現(xiàn)代基因工程_03DNA純化后的利用

1、 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 基因工程第三講： DNA純化后的利用Manipulation of Purified DNA Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 講課提綱講課提綱3.1 DN

2、A操作使用酶3.2 切割DNA的酶限制性內(nèi)切酶3.3 連接-將DNA分子連接到一起 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 為了得到重組DNA分子，載體分子和將要被克隆的DNA都必須在特定的位點(diǎn)被切開，并以可控方式連接在一起。另外，還可以對(duì)DNA進(jìn)行： 切短和延長(zhǎng)， 轉(zhuǎn)錄成RNA或復(fù)制成新的DNA分子， 添加或去除一些化學(xué)基團(tuán)而修飾。 研究生化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)和控制基因表達(dá)的。3.1 DNA操作使用酶

3、 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 幾乎所有的DNA操作都要使用純凈的酶。酶： 在細(xì)胞內(nèi)參加各種基本反應(yīng)； 從細(xì)胞提取純化后，能夠在人工條件下，催化其天然反應(yīng)，或類似的反應(yīng)。這些酶促反應(yīng)大多數(shù)無法用化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)。因此純化的酶對(duì)于基因工程是非常關(guān)鍵的，其制備、性質(zhì)研究和市場(chǎng)買賣已經(jīng)形成了一個(gè)重要的產(chǎn)業(yè)。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；

4、S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 依賴于基因克隆的DNA： 切開_限制性內(nèi)切酶(restriction endonuleases) 連接_連接酶(ligases) 本講的絕大部分就這兩種酶的使用方法進(jìn)行介紹。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University DNA操作酶的范圍DNA操作酶根據(jù)其催化

5、反應(yīng)的類型分為5大類：(1)核酸酶：切開、切除或降解；(2)連接酶：將核酸分子連接起來；(3)聚合酶：復(fù)制核酸分子；(4)修飾酶：去除或添加化學(xué)基團(tuán)；(5)拓?fù)洚悩?gòu)酶：向共價(jià)閉合環(huán)狀DNA中引入或消除超螺旋。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 在分析這些酶的分類前，有兩點(diǎn)必須明確：首先，盡管絕大多數(shù)酶能夠被分到特定的類別中，但有一小部分表現(xiàn)出多重活性而橫跨兩個(gè)或兩個(gè)以上的類別。如：很多能夠合成

6、新DNA鏈的聚合酶，同時(shí)也表現(xiàn)出DNA水解酶的活性。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 其次，有許多與DNA酶相似的RNA酶，用于在DNA制備實(shí)驗(yàn)中除去造成污染的RNA。隨后的章節(jié)中將介紹一些RNA操作酶，但重點(diǎn)是DNA操作酶。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and

7、environment engineering, University 3.1.1 核酸酶核酸酶通過打斷DNA鏈中連接相鄰核苷酸的磷酸二酯鍵來水解DNA分子。分為兩種: (1)外切核酸酶(exonuleases)：從DNA分子的末端一個(gè)個(gè)地切除核苷酸。 (2)內(nèi)切核酸酶(endonuleases)：在一個(gè)DNA分子內(nèi)部打開磷酸二酯鍵。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of B

8、iotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 不同的外切核酸酶之間的主要區(qū)別： 當(dāng)雙鏈DNA分子被攻擊時(shí)，外切核酸酶會(huì)切開其中的一條鏈或是把兩條鏈都切斷。典型外切核酸酶Bal31： 能夠切開雙鏈DNA分子的兩條鏈， 作用時(shí)間越久，所制得的DNA片段就越短。相反，大腸桿菌外切核酸酶：只能夠切開DNA雙鏈中的某一條鏈，最后得到單鏈的DNA分子。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved

9、 ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 同樣的規(guī)則也可用于對(duì)內(nèi)切核酸酶進(jìn)行分類。S1內(nèi)切核酸酶：只切單鏈；DNase I(脫氧核糖核酸酶I)：切雙鏈和單鏈。 一種非特異性內(nèi)切酶，能夠打破所攻擊的DNA內(nèi)部的任意磷酸二酯鍵連接。 延長(zhǎng)DNase I作用時(shí)

10、間后得到的是單核苷酸和寡核苷酸的混合物。限制性內(nèi)切酶：能夠在有限的特定位點(diǎn)切開雙鏈DNA。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3.1.2 連接酶細(xì)胞中連接酶的

11、作用: 修復(fù)單鏈上的切口(斷裂)，這些斷裂是在雙鏈DNA分子的復(fù)制過程中出現(xiàn)的。從有機(jī)體中提取的DNA連接酶: 修復(fù)單鏈上的切口; 還能夠連接兩條雙鏈DNA片段(圖4-4)。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environmen

12、t engineering, University 3.1.3 聚合酶DNA聚合酶： 能夠合成一條與已知模板DNA或RNA互補(bǔ)的新DNA鏈。 只有當(dāng)模板(template)具有雙鏈區(qū)域充當(dāng)聚合反應(yīng)起始引物(primer)時(shí)，絕大多數(shù)聚合酶才能夠發(fā)揮作用?；蚬こ讨型ǔＳ玫降挠?種DNA聚合酶。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 第一種：DNA聚合酶I通常從大腸桿菌中制得。當(dāng)DNA分子主要由雙鏈

13、構(gòu)成但存在一段短的單鏈區(qū)域（或缺口）時(shí)，DNA聚合酶I與單鏈區(qū)域相結(jié)合，并合成一條全新的鏈，與此同時(shí)降解掉原來存在但被代替掉的那段DNA序列。因此DNA聚合酶I是典型的具備雙重酶活性酶：既具備DNA合成酶活性也具備DNA水解酶活性。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University DNA聚合酶I的聚合酶活性和水解酶活性是受酶分子不同部位控制。水解酶活性包含在多肽鏈前223個(gè)氨基酸中。因此切掉此部分后所得到的

14、修飾后的酶，雖然還保留DNA聚合酶活性，但是不能再水解DNA。這種DNA聚合酶I修飾后的酶，稱作Klenow片段。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Klenow片段 能夠結(jié)合在單鏈模板上合成一條互補(bǔ)DNA鏈； 因?yàn)橐咽NA水解酶活性，一旦填滿缺口合成就無法繼續(xù)進(jìn)行。 一些其他的酶，天然狀態(tài)和修飾后狀態(tài)，都和Klenow片段有著相似的性質(zhì)。 Lecture of Biotechnology

15、； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Taq DNA聚合酶 是細(xì)菌Thermus aquaticus中的DNA聚合酶I。 這種細(xì)菌生活在溫度很高溫泉中，因此它的很多酶，包括Taq DNA聚合酶都是熱穩(wěn)定性的， 意味著它們能夠在熱處理的條件下保證不會(huì)發(fā)生變性。正是這一特殊性質(zhì)使得Taq DNA聚合酶適合用于PCR反應(yīng)，因?yàn)槿绻痪哂袩岱€(wěn)定性，當(dāng)反應(yīng)溫度升到94使DNA變性時(shí)，聚合酶也會(huì)發(fā)生變性而失活。 Lecture of Biotechnolo

16、gy； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 逆轉(zhuǎn)錄酶一種在一些病毒復(fù)制中出現(xiàn)的酶。獨(dú)一無二的特點(diǎn)： 所用到的模板是RNA而非DNA。這種以一條RNA為模板合成互補(bǔ)DNA鏈的方法是一項(xiàng)稱為互補(bǔ)DNA(cDNA)克隆技術(shù)的核心。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, Univ

17、ersity Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3.1.4 DNA修飾酶（modifying enzymes）通過添加或刪除化學(xué)基團(tuán)來修飾DNA分子的酶，統(tǒng)稱為DNA修飾酶。最重要的：(1)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase) 從大腸桿菌、牛小腸組織、北極蝦中提取， 能去除DNA分子5末端的磷酸基團(tuán)。 Lecture of Biotechnology； All Right R

18、eserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University (2)多核苷酸激酶(polynucleotide kinase) 從T4噬菌體侵染的大腸桿菌中提取， 和堿性磷酸酶的活性相反，在DNA分子5游離末端添加磷酸基團(tuán)。 (3)末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase) 從小牛胸腺組織中提取， 在DNA分子3末端添加一個(gè)或多個(gè)脫氧核苷酸。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S

19、. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3.1.5 拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerases)能夠通過引入或去除超螺旋來改變共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(如：質(zhì)粒DNA分子)的構(gòu)象。盡管它的重要性主要體現(xiàn)在DNA復(fù)制的研究中，但在基因工程中也占據(jù)一席之地。 Lectu

20、re of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3.2 切割DNA的酶限制性內(nèi)切酶基因克隆要求DNA分子以一種準(zhǔn)確的并且是可重復(fù)的方式被切割。 每一個(gè)載體都必須在一個(gè)單一位點(diǎn)被切割，以打開環(huán)使新的DNA能夠被插入進(jìn)去; 一個(gè)分子如果被切割了超過一次，將會(huì)斷裂成兩個(gè)或更多的互相分離的片段，這些片段是無法作為分子克隆載體的； 每個(gè)載體分子必須在環(huán)中的同一位置被切割開，隨機(jī)切割不會(huì)令人滿意。 Lecture of Biot

21、echnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 通常情況下，需要對(duì)克隆的DNA進(jìn)行切割。首先，如果以克隆單個(gè)基因?yàn)槟康?，該單個(gè)基因可能僅僅包含2-3kb DNA，則這個(gè)基因不得不從大的(通常情況下超過80kb)DNA分子中切割出來。其次，大的DNA分子不得不被切斷成小的足以被載體攜帶的片段。絕大多數(shù)克隆載體能夠承載的DNA片段處于一個(gè)特定的大小范圍中。比如，以M13噬菌體為基礎(chǔ)的載體，所克隆的DNA分子超過3kb時(shí)運(yùn)載效率非常低。 Le

22、cture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 純化后的限制性內(nèi)切酶允許分子生物學(xué)家以一種精確的可重復(fù)的方式切割基因克隆所需的DNA分子。這些酶的發(fā)現(xiàn)使W. Arber. H. Smith和D. Nathans榮獲1978年的諾貝爾獎(jiǎng)。也是基因工程發(fā)展過程中的一項(xiàng)突破性進(jìn)展。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of

23、 chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3.2.1 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和其功能20世紀(jì)50年代，觀察到有一些細(xì)菌菌株對(duì)噬菌體的侵染表現(xiàn)出免疫力，這種現(xiàn)象稱之為宿主調(diào)控性限制。盡管全面理解限制的機(jī)制花費(fèi)了20多年的時(shí)間，但其實(shí)并不復(fù)雜。原因：細(xì)菌產(chǎn)生出一種能夠在噬菌體DNA進(jìn)行復(fù)制和合成新的噬菌體顆粒

24、前就將其降解的酶。 細(xì)菌本身的DNA卻不受這種攻擊的影響，否則是致命的。因?yàn)榧?xì)菌本身攜帶有額外的甲基基團(tuán)阻斷了降解酶的活動(dòng)。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University

25、 這些降解酶被稱作限制性內(nèi)切酶，能夠?yàn)楹芏嗟募?xì)菌所合成。已有超過1200種、三大類三大類區(qū)別主要是作用模式上微小的不同。 限制性內(nèi)切酶I和結(jié)構(gòu)上要復(fù)雜得多，并且在基因工程中只承擔(dān)很少的角色。 限制性內(nèi)切酶是基因克隆中要用到的非常重要的切割酶。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3.2.2 限制性內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱為限制性內(nèi)切酶）核心特征：每種酶都有一段特定的識(shí)別序列，在這段序列上它們才能夠切割DNA

26、分子。PvuI(從Proteus vulgaris中分離)切割CGATCG，同一細(xì)菌分離的另外一種酶Pvu，是CAGCTG。 很多限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別六核苷酸目標(biāo)位點(diǎn)， 另一些識(shí)別四、五、八等核苷酸序列位點(diǎn)。如：Sau3A能夠識(shí)別GATC， AluI在AGCT位點(diǎn)進(jìn)行切割。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 有許多具有非保守識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，意味著它們能夠在相關(guān)位點(diǎn)構(gòu)成的家族中的任意位點(diǎn)

27、切割DNA。比如：HinfI，識(shí)別GANTC， 能夠在GAATC，GATTC，GAGTC和GACTC切割。一些最頻繁使用的限制性內(nèi)切酶的限制序列在表4-1中列出。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engi

28、neering, University 3.2.3 平末端和黏末端限制性內(nèi)切酶切割的確切性質(zhì)在設(shè)計(jì)基因克隆實(shí)驗(yàn)中具有顯著的重要性。許多限制性內(nèi)切酶在識(shí)別序列處產(chǎn)生簡(jiǎn)單的雙鏈斷口。得到平末端或平端(blunt end或flush end)Pvu和AluI是平末端內(nèi)切酶的典型例子。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 還有大量的限制性內(nèi)切酶切割DNA方式不同。DNA的兩條鏈在不同的位置被切開，形成一

29、種交錯(cuò)的切口，通常會(huì)隔開2或4個(gè)核苷酸，因此，所得的DNA片斷在末端都具有短的懸垂部分。這些被稱作黏末端(sticky or cohesive ends)或黏性末端。黏末端之間的堿基配對(duì)能夠?qū)NA分子重新連接起來。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 黏末端酶的一個(gè)重要特征是：不同識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶能夠產(chǎn)生出相同的黏末端。BamHI(識(shí)別序列GGATCC)、Bgl(識(shí)別AGATCT) 和S

30、au3A(識(shí)別序列GATC) 都能夠產(chǎn)生GATC黏末端。經(jīng)這些酶切割產(chǎn)生的DNA片段，都能夠通過每一個(gè)片段所攜帶的互補(bǔ)黏末端連接在一起。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, Univ

31、ersity 3.2.4 DNA分子中識(shí)別序列的出現(xiàn)頻率對(duì)特定的限制性內(nèi)切酶來說，在已知長(zhǎng)度的DNA分子中,識(shí)別序列的數(shù)量能夠通過數(shù)學(xué)方法計(jì)算出來。這一算法假定核苷酸以一種隨機(jī)方式排列而4個(gè)不同核苷酸以相同的比例出現(xiàn)(例如GC含量：50)。一個(gè)四核苷酸序列(如GATC的酶)每44=256個(gè)核苷酸出現(xiàn)一次。實(shí)際上，這些假設(shè)不可能完全有效。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 如，DNA分子，49k

32、b， GC的含量要少于50。對(duì)一個(gè)六核苷酸識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶來說應(yīng)該具有12個(gè)酶切位點(diǎn)。實(shí)際上，這些識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生的頻率要小一些，如：Bgl有6個(gè)， BamHI有5個(gè)， SalI則只有2個(gè)。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 限制性位點(diǎn)通常不會(huì)均勻分布于DNA分子中。如果它們是均勻分布的，那么用一種特定的限制性內(nèi)切酶消化后所得的片段應(yīng)該是一樣長(zhǎng)的。圖4-10(b)給出的就是用召Bgl，Bam

33、HI，SalI對(duì)DNA進(jìn)行切割后得到的片段。在每一種酶切中，都能夠看到片段在一定范圍內(nèi)存在著變化，這表明入DNA中核苷酸并非完全隨機(jī)地進(jìn)行排列。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering,

34、University 從圖4-10中我們能夠?qū)W到的是:盡管數(shù)學(xué)方法可以就一個(gè)給定的DNA分子，來推斷究竟能夠出現(xiàn)多少個(gè)限制性位點(diǎn)，但是只有實(shí)驗(yàn)分析法才能夠給出準(zhǔn)確的結(jié)果。因此我們必須繼續(xù)考慮在實(shí)驗(yàn)室中如何使用限制性內(nèi)切酶。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3.2.5 實(shí)驗(yàn)室條件下的限制性酶切以Bgl (125g/ml )對(duì)DNA樣品的消化為例：1.取DNA： DNA用量取決于實(shí)驗(yàn)本身的要求，

35、用微量移液器。 假設(shè)：需要消化2g DNA2.為內(nèi)切酶提供一個(gè)合適的環(huán)境(buffer)。 所有限制性內(nèi)切酶都需要在鎂離子存在下才發(fā)揮作用。 離子強(qiáng)度通常由氯化鈉(NaCl)提供。 不當(dāng)?shù)沫h(huán)境，不僅會(huì)降低限制性內(nèi)切酶的活性，還會(huì)導(dǎo)致酶的專一性的改變，使DNA切割額外的、非標(biāo)準(zhǔn)的識(shí)別序列。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適pH在7.4左右，不同的酶對(duì)離子強(qiáng)度和鎂離子(

36、Mg2+）濃度的要求不盡相同。加入一個(gè)還原劑也是明智的做法，比如二硫蘇糖醇(DTT)，它能夠使內(nèi)切酶穩(wěn)定并防止其失活。Bgl合適的緩沖液的成分在表4-2中排列出來。這里列出的緩沖液是工作濃度的10倍，在加入反應(yīng)混合液的過程中被稀釋。本例子中，一個(gè)反應(yīng)混合液的合適的終體積是20uL,因此我們加入2L的10Bgl緩沖液到16L的已經(jīng)配制好的DNA溶液中。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lect

37、ure of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3. 限制性內(nèi)切酶： 供應(yīng)商提供純的已知濃度的溶液。1個(gè)酶單位： 被定義為在1h中切割1gDNA所需要的酶量。 所以，需要2個(gè)單位的Bgl來切割2g的DNA。 Bgl通常是以4單位/L的濃度，本實(shí)驗(yàn)0.5L足夠。因此反應(yīng)混合物中加入0.5L酶和1.5uL水， 達(dá)到20L的最終體積。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserve

38、d ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 4. 反應(yīng)溫度： 絕大多數(shù)，包括Bgl，37時(shí)活性達(dá)到最大； 一小部分需要不同的工作溫度，如TaqDNA聚合酶消化時(shí)，65才能達(dá)到酶的最大活性。 限制性酶切經(jīng)過1h就應(yīng)該結(jié)束。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 如果酶切下來的DNA片段用于克隆

39、實(shí)驗(yàn)，則反應(yīng)中的酶應(yīng)該消除掉以保證它不會(huì)意外地消化掉那些將在以后步驟中加入的其他DNA分子?！跋麥纭?酶： 70保存很短的一段時(shí)間； 苯酚抽提; 加入EDTA(鰲和Mg2+)。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environme

40、nt engineering, University 3.2.6 分析限制內(nèi)切酶的酶切結(jié)果要想知道一個(gè)DNA分子究竟是否被限制性酶切割，可以輕易地通過檢測(cè)溶液黏度來確定。大的DNA分子的溶液黏度要比小分子DNA溶液大得多，因此酶切會(huì)導(dǎo)致溶液黏度的降低。然而，要計(jì)算出單個(gè)酶切產(chǎn)物的大小和數(shù)量要困難得多。當(dāng)凝膠電泳技術(shù)在20世紀(jì)70年代的早期被開發(fā)出來后，這些問題就相應(yīng)得到了解決。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, U

41、niversity 通過凝膠電泳分離生物大分子DNA分子攜帶有一定的負(fù)電荷。因此，當(dāng)DNA分子被置于電場(chǎng)中時(shí)，它們就會(huì)朝著陽(yáng)極發(fā)生遷移。大分子的遷移速度取決于兩個(gè)因素： 形狀和荷質(zhì)比。不幸的是，絕大多數(shù)DNA有著相同的外形并且所有的DNA分子都有著非常相似的荷質(zhì)比。因此，不同大小的片段無法通過標(biāo)準(zhǔn)的電泳標(biāo)準(zhǔn)的電泳進(jìn)行分離。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotech

42、nology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 如果電泳是在凝膠凝膠中進(jìn)行，則DNA分子的大小就成為一個(gè)影響電泳結(jié)果的因素。凝膠通常由： 瓊脂糖； 聚丙烯酰胺； 兩者的混合物。凝膠包含復(fù)雜的孔道網(wǎng)絡(luò)，DNA分子必須通過這些孔道才能夠到達(dá)陽(yáng)極。小的DNA分子，在凝膠中遷移的更快。凝膠電泳根據(jù)DNA分子大小對(duì)其進(jìn)行分離。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartme

43、nt of chemistry and environment engineering, University 凝膠的成分和濃度決定能夠分離的DNA大小。瓊脂糖凝膠： 相對(duì)大的孔道，分離大一些的分子；聚丙烯酰胺凝膠： 很小的孔道，分離小的DNA分子， 能夠分離僅僅相差一個(gè)核苷酸的DNA分子。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 使凝膠中的DNA分子可視化染色是最簡(jiǎn)單的方法。溴乙錠(EtBr) 能

44、夠用來對(duì)瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA進(jìn)行染色。只要在足夠的DNA存在條件下，經(jīng)過EtBr染色后，在紫外照射下能以不同的條帶顯示出來。注意： 溴乙錠是非常強(qiáng)的致癌物；紫外光也會(huì)灼傷。因此，用于把DNA染成藍(lán)色或綠色，又不需要紫外照射就能看見DNA的非致癌染料，越來越多地被用于實(shí)驗(yàn)室研究中。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Righ

45、t Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 瓊脂糖凝膠照片示例 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 對(duì)放射性標(biāo)記的DNA進(jìn)行放射性自顯影染色的一個(gè)缺陷是其靈敏性的限制，如果每條帶中DNA的含量少于10ng，則很有可能在染色后仍然看不到條帶。對(duì)于微量的DNA就需要更加靈敏的

46、檢測(cè)手段。放射自顯影是一個(gè)很好的方法。 電泳前將DNA結(jié)合上放射性標(biāo)記，利用X射線敏感攝影對(duì)凝膠進(jìn)行拍攝就能夠肉眼觀察到DNA分子。放射性DNA使膠片曝光，顯示出DNA條帶。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environmen

47、t engineering, University 通常，DNA分子通過結(jié)合攜帶放射性32P的方法進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記方法：缺口平移法和末端填平法。缺口平移法： 雖然樣品的制備過程很小心，但是絕大多數(shù)純化的DNA樣品都包含一些帶缺口的分子，DNA聚合酶I能夠結(jié)合到DNA上，并催化替代一條鏈的反應(yīng)。這一反應(yīng)需要提供核苷酸，如果這些核苷酸中有一個(gè)被標(biāo)記，則最終形成的新DNA本身也被標(biāo)記上放射性同位素。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment enginee

48、ring, University 缺口平移能夠用來標(biāo)記任何DNA分子，但在某些條件下也能夠切割DNA。末端填平法： 相對(duì)溫和的方法，幾乎不會(huì)導(dǎo)致DNA的斷裂； 但只能標(biāo)記含有黏末端的DNA分子。 使用Klenow片段，通過合成互補(bǔ)鏈“填平”黏末端。缺口平移和末端填平法都能夠標(biāo)記非常微量的DNA，在凝膠中這樣的微量標(biāo)記能夠被放射自顯影所檢測(cè)。在理想條件下每條帶小到2ng的DNA都能夠被觀察到。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment enginee

49、ring, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3.2.7 DNA分子大小的估計(jì)如何確定凝膠電泳中片段的大小?最準(zhǔn)確的方法：利用遷移速度和分子重量間的數(shù)學(xué)關(guān)系。相關(guān)公式是： D=a-b (logM)D是遷移的距離，M是相對(duì)分子質(zhì)量，a和b是依賴于電泳條件的常數(shù)。通常使用：一種簡(jiǎn)單，但相對(duì)不太精確的估計(jì)DNA片段大小的方法。 Lecture of Biotechnology；

50、 All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 方法：利用已知大小的DNA片段作標(biāo)準(zhǔn)(marker /ladder),目的DNA片段與之比對(duì)、估計(jì)。例如：Hind將DNA切成8個(gè)片段，這些片段的大小都已經(jīng)知道，范圍從125bp到23kb。實(shí)驗(yàn)中的片段大小可以通過對(duì)比兩條泳道中條帶的位置而加以估計(jì)。盡管不十分精確，這種方法進(jìn)行起來只有5的錯(cuò)誤率，這對(duì)絕大多數(shù)要求已經(jīng)足夠了。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserv

51、ed ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3.2.8 通過作圖標(biāo)出DNA分子的限制性酶位點(diǎn)在前述基礎(chǔ)上，可以構(gòu)建DNA分子的酶切圖譜，以顯示一定數(shù)量的不同內(nèi)切酶的識(shí)別序列在DNA分子上的相對(duì)位置。只有當(dāng)一個(gè)限制性圖譜(restriction map)

52、獲得的情況下，才能夠正確選擇用于特定酶切操作中的限制性內(nèi)切酶。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 構(gòu)建限制性圖譜，必須要進(jìn)行一系列的限制性消化。首先，每個(gè)限制

53、性內(nèi)切酶消化所得到的片段的數(shù)量和大小必須要通過凝膠電泳，并對(duì)比標(biāo)記物的大小確定出來。這一信息必須隨后被一系列雙酶切加以補(bǔ)充，即DNA被兩種限制性內(nèi)切酶同時(shí)消化。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 雙酶切時(shí)，如果兩種酶對(duì)pH和Mg2+濃度等有相似的要求，則雙酶切可以同時(shí)進(jìn)行。如果要求不同，那么這兩種酶切需要一個(gè)接一個(gè)地進(jìn)行。在初次酶切后調(diào)整反應(yīng)混合物，為第二種酶提供適宜的反應(yīng)條件。 Lectur

54、e of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 對(duì)比單酶切和雙酶切的結(jié)果，能夠使很多甚至全部的限制性位點(diǎn)作圖標(biāo)出。模棱兩可的地方通常可以通過部分酶切(partial digestion)來解決。即在某些條件下，DNA分子上只切開部分限制性位點(diǎn)。部分酶切常通過減少反應(yīng)時(shí)間來達(dá)到，這樣一來限制性酶就沒有足夠的時(shí)間切割所有的限制性位點(diǎn)；或者通過在低的反應(yīng)溫度(4而不是37)下進(jìn)行，這樣能夠抑制內(nèi)切酶的活性。 Lecture

55、of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 部分消化結(jié)果： 復(fù)雜的電泳條帶圖。 和完全消化所得標(biāo)準(zhǔn)酶切片段一樣，還能夠看見額外的條帶。額外的條帶： 包含兩個(gè)相鄰的、 未被切割開的限制性片段。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, Univers

56、ity Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3.3 連接-將DNA分子連接到一起重組DNA分子構(gòu)建的最后一步，就是將載體分子和將要被克隆的DNA連接到一起,這一

57、過程稱作連接。催化連接反應(yīng)的酶稱作DNA連接酶。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 3.3.1 DNA連接酶的作用模式DNA連接酶： 所有的活細(xì)胞中都能產(chǎn)生，在修復(fù)DNA一條鏈上的斷裂區(qū)域時(shí)發(fā)揮著非常重要的作用； 基因工程中的連接酶主要是從被T4噬菌體侵染的大腸桿菌中純化制得。斷裂是DNA鏈上連接相鄰核苷酸的磷酸二酯鍵缺失(缺口是指發(fā)生一個(gè)到多個(gè)核苷酸的缺失)。斷裂原因： 細(xì)胞DNA的隨機(jī)斷裂

58、； DNA復(fù)制和重組過程。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 試管中純凈的DNA連接酶功能： 修復(fù)單鏈上的斷裂； 將單獨(dú)的DNA分子或同一分子的兩個(gè)末端連接在一起。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, Univers

59、ity 3.3.2 黏末端可增加連接的效率在試管中可以進(jìn)行兩條平末端片段連接反應(yīng)，但反應(yīng)效率不高。因?yàn)椋篋NA連接酶不能夠“主動(dòng)捕獲”將要被連接的分子，而只能夠等待隨機(jī)的機(jī)會(huì)將兩個(gè)末端連接在一起。如果可能的話，平末端連接反應(yīng)應(yīng)在高的DNA濃度的溶液中進(jìn)行，以增加分子末端以正確方式結(jié)合到一起的機(jī)會(huì)。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University 相對(duì)平末端連接，互補(bǔ)的黏末端連接反應(yīng)更高效。因?yàn)椋合嗳菪缘酿つ?/p>

60、端能夠通過氫鍵連接相互形成堿基配對(duì)，構(gòu)成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)便于連接酶作用。如果磷酸二酯鍵不能夠很快的生成，黏末端將會(huì)再次分開。正是這一堿基配對(duì)形成的短暫過程，增加了末端間相互聯(lián)系的時(shí)間，從而提高了連接反應(yīng)的效率。 Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemistry and environment engineering, University Lecture of Biotechnology； All Right Reserved ；S. Q. LIUDepartment of chemi