凱氏定氮法原理資料

1、凱氏定氮法原理，方法步驟和計算方法（三少整理版）2008 年 09 月 25 日 星期四19:52三鹿奶粉事件讓全國人民知道了 三聚氰胺，食品中蛋白質含量的現(xiàn)行國家標準和國際通行測定方法是經(jīng)典 凱氏定氮法， 作為一名分析人員，現(xiàn)在將 凱氏定氮法原理，方法 三少 步驟和計算方法 寫出來，看看凱氏定氮法在 蛋白質含量中的缺陷。何為凱氏定氮法？簡單地說，凱氏定氮法是一種檢測物質中“氮的含量”的方法。蛋白質是一種含氮的有機化合物， 食品中的蛋白質經(jīng)硫酸和催化劑分解后，產(chǎn)生的氨能夠與硫酸結合，生成硫酸氨，再經(jīng)過堿化蒸餾后，氨即成為游離狀態(tài)，游離氨經(jīng)硼酸吸引， 再以硫酸或鹽酸的標準溶液進行滴定，根據(jù)酸的消

2、耗量再乘以換算系數(shù)， 就可以推算出食品中的蛋白含量。一. 凱氏定氮法原理 凱氏定氮法首先將含氮有機物與濃硫酸共熱， 經(jīng)一系列的分解、 碳化和氧化還原反應等復雜過程， 最后有機氮轉變?yōu)闊o機氮硫酸銨， 這一過程稱為有機物的消化。 為了加速和完全有機物質的分解， 縮短消化時間，在消化時通常加入硫酸鉀、 硫酸銅、氧化汞、過氧化氫等試劑，加入硫酸鉀可以提高消化液的沸點而加快有機物分解，除硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類類提高沸點，但效果不如硫酸鉀。硫酸銅起催化劑的作用。 凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多， 除硫酸銅外，還有氧化汞、汞、硒粉、鉬酸鈉等，但考慮到效果、價格及環(huán)境污染等多種因素， 應用

3、最廣泛的是硫酸銅。 使用時常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機物氧化。消化完成后，將消化液轉入凱氏定氮儀反應室，加入過量的濃氫氧化鈉，將 NH4+轉變成 NH3，通過蒸餾把 NH3驅入過量的硼酸溶液接受瓶內，硼酸接受氨后，形成四硼酸銨，然后用標準鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復原來的氫離子濃度。 滴定消耗的標準鹽酸摩爾數(shù)即為 NH3的摩爾數(shù)，通過計算即可得出總氮量。在滴定過程中，滴定終點采用甲基紅- 次甲基藍混合指示劑顏色變化來判定。測定出的含氮量是樣品的總氮量，其中包括有機氮和無機氮。反應式如下：1. 有機物中的氮在強熱和 CuSO4，濃 H2SO4作用下，消化生成（ NH4）2SO

4、4反應式為： H2SO4=SO2+H2O+OR.NH32NH3+H2SO4=(NH4)2SO42. 在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出 NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中反應式為： 2NH4+OH-=NH3+H2ONH3+H3BO3=NH4+H2BO3-3. 再用已知濃度的 HCI 標準溶液滴定，根據(jù) HCI 消耗的量計算出氮的含量，然后乘以相應的換算因子，既得蛋白質的含量。反應式為： H2BO3-+H+=H3BO3蛋白質是一類復雜的含氮化合物，每種蛋白質都有其恒定的含氮量 約在 1418，平均為 16（質量分數(shù)） 。凱氏定氮法測定出的含氮量，再乘以系數(shù)6.25 ，即為蛋白質含量。凱氏定

5、氮裝置圖塞子 5. 樣品入口 4. 汽水分離管 3. 導管 2. 安全管 1.6. 冷凝管 7. 吸收瓶 8. 隔熱液套 9. 反應管 10. 蒸汽發(fā)生瓶本文為三少綜合整理所得，轉載請注明 源自二. 方法和步驟 （一）消化1、準備 6 個凱氏燒瓶，標號。 1、2、3 號燒瓶中分別加入適當濃度的蛋白溶液 1.0mL，樣品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀 - 硫酸銅接觸劑0.3g ，濃硫酸 2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6 號燒瓶作為空白對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質，對樣品測定進行校正。4、5、6 號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL 代替樣液，其余所加

6、試劑與1、2、3 號燒瓶相同。2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接好抽氣裝置。先用微火加熱煮沸，此時燒瓶內物質炭化變黑，并產(chǎn)生大量泡沫，務必注意防止氣泡沖出管口。待泡沫消失停止產(chǎn)生后，加大火力，保持瓶內液體微沸，至溶液澄清后，再繼續(xù)加熱使消化液微沸 15min。在消化過程中要隨時轉動燒瓶， 以使內壁粘著物質均能流入底部， 以保證樣品完全消化。消化時放出的氣體內含 SO2，具有強烈刺激性，因此自始自終應打開抽水泵將氣體抽入自來水排出。 整個消化過程均應在通風櫥中進行。消化完全后，關閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。（二）蒸餾和吸收蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內進行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體上都

7、由蒸氣發(fā)生、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組成。1、儀器的洗滌儀器安裝前，各部件需經(jīng)一般方法洗滌干凈，所用橡皮管、塞須浸在10%NaOH溶液中，煮約10min，水洗、水煮 10min，再水洗數(shù)次，然后安裝并固定在一只鐵架臺上。儀器使用前，微量全部管道都須經(jīng)水蒸氣洗滌， 以除去管道內可能殘留的氨，正在使用的儀器，每次測樣前，蒸氣洗滌 5min 即可。較長時間未使用的儀器，重復蒸氣洗滌，不得少于三次，并檢查儀器是否正常。仔細檢查各個連接處，保證不漏氣。首先在蒸氣發(fā)生器中加約 2/3 體積蒸餾水，加入數(shù)滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結果，并放入少許沸石（或毛細管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加

8、入蒸餾水約 20mL讓水經(jīng)插管流入反應室，但玻杯內的水不要放光，塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。蒸氣發(fā)生后，立即關閉廢液排放管上的開關， 使蒸氣只能進入反應室，導致反應室內的水迅速沸騰， 蒸出蒸氣由反應室上端口通過定氮球進入冷凝管冷卻， 在冷凝管下端放置一個錐形瓶接收冷凝水。 從定氮球發(fā)燙開始計時，連續(xù)蒸煮 5min，然后移開煤氣燈。沖洗完畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管， 由于氣體冷卻壓力降低， 反應室內廢液自動抽到反應室外殼中，打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗 23 次，再在冷凝管下?lián)Q放一個盛有硼酸 - 指示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口完全浸沒在溶液中，蒸餾 12min，觀

9、察錐形瓶內的溶液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝置內部已洗干凈。移去錐形瓶，再蒸餾 1 ，用蒸餾水沖洗冷凝器下口，關閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使用。 2min2、無機氮標準樣品的蒸餾吸收由于定氮操作繁瑣， 為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術， 初學者宜先用無機氮標準樣品進行反復練習， 再進行有機氮未知樣品的測定。 常用巳知濃度的標準硫酸銨測試三次。取潔凈的 100mL錐形瓶五只，依次加入 2%硼酸溶液 20mL，次甲基藍 -甲基紅混合指示劑（呈紫紅色）34 滴，蓋好瓶口待用。取其中一只錐形瓶承接在冷凝管下端， 并使冷凝管的出口浸沒在溶液中。 注意：在此操作之前必須先打開收集器活塞，以免錐形瓶內液體倒吸

10、。 準確吸取 2mL硫酸銨標準液加到玻杯中， 小心提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢流入蒸餾瓶中， 用少量蒸餾水沖洗小玻杯3 次，一并放人蒸餾瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30 NaOH溶液，使堿液慢慢流入蒸餾瓶中，在堿液尚未完全流入時，將棒狀玻塞蓋緊。向小玻杯中加約 5mL蒸餾水，再慢慢打開玻塞，使一半水流入蒸餾瓶，一半留在小玻杯中作水封。關閉收集器活塞，加熱蒸氣發(fā)生器，進行蒸餾。錐形瓶中的硼酸 - 指示劑混合液由于吸收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時起，再蒸餾 35min，移動錐形瓶使瓶內液面離開冷凝管下口約 lcm，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口，再繼續(xù)蒸餾 1min，移開錐形瓶，蓋

11、好，準備滴定。在一次蒸餾完畢后， 移去煤氣燈，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器間的橡膠管，排除反應完畢的廢液，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液排除。如此反復沖洗干凈后，即可進行下一個樣品的蒸餾。按以上方法用標準硫酸銨再做兩次。另取 2mL 蒸餾水代替標準硫酸銨進行空白測定二次。 將各次蒸餾的錐形瓶一起滴定。3、未知樣品及空白的蒸餾吸收將消化好的蛋白樣品三支，空白對照液三支，依次作蒸餾吸收。加 5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或空白對照液中， 通過小玻杯加到反應室中，再用熱蒸餾水洗滌小玻杯 3 次，每次用水量約 3mL，洗滌液一并倒入反應室內。其余操作按標準硫酸銨的蒸餾進行。由于消化液內硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀，

12、 不易從凱氏燒瓶內倒出， 必須加入熱蒸餾水 5 mL 稀釋之，如果有結晶析出，必須微熱溶解，趁熱加入玻杯，使其流入反應室。此外，還應當注意趁儀器洗滌尚未完全冷卻時立即加入樣品或空白對照液， 否則消化液通過冷卻的管道容易析出結晶，造成堵塞。（三）滴定樣品和空白蒸餾完畢后，一起進行滴定。打開接受瓶蓋，用酸式微量滴定管以 0.0100mol/L 的標準鹽酸溶液進行滴定。待滴至瓶內溶液呈暗灰色時， 用蒸餾水將錐形瓶內壁四周淋洗一次。若振搖后復現(xiàn)綠色，應再小心滴入標準鹽酸溶液半滴，振搖觀察瓶內溶液顏色變化， 暗灰色在一二分鐘內不變， 當視為到達滴定終點。若呈粉紅色，表明已超越滴定終點，可在已滴定耗，每組

13、樣品的定氮終點顏色必須完全一致?？?0.02mL 用的標準鹽酸溶液用量中減去白對照液接受瓶內的溶液顏色不變或略有變化尚未出現(xiàn)綠色， 可以不滴定。記錄每次滴定耗用標準鹽酸溶液毫升數(shù)，供計算用。三. 結果與計算 運算下列公式計算出每次無機氮標準樣品和未知樣品的總含氮量。式中WN每毫升樣品的含氮毫克數(shù)；A滴定樣品消耗的鹽酸量（mL）；B滴定空白消耗的鹽酸量（mL）；C測定樣品所取用量（mL）；0.0100 標準鹽酸物質的量濃度（mol/L ）；14.008 每摩爾氮原子質量（g/mol ）。三次樣品測定的含氮量相對誤差應小于±2%。樣品粗蛋白含量總氮量× 6.25 ，這個系數(shù)來自蛋白質平均含氮量為 166.25 為含氮量換算為蛋白質含量的系數(shù)。 . 實際上各種蛋白質因氨基酸組成不同， 含氮量不完全相同。 ，花，大米為 5.95 乳類為 6.38 等生為5.46本文為三少綜合整理所得，源自轉載請注明凱氏定氮法的缺陷： 從凱氏定氮原理可以知道： 凱氏定氮法是將含氮有機物轉變?yōu)闊o機氮硫酸銨來進行檢測， 以得到含氮量的測定值乘以一定系數(shù)得出蛋白質含量。 而含氮有機物不僅僅等等。 在加上食品中蛋白質含量的現(xiàn)行國家標準和國際通 三聚氰胺 是蛋