蛋白質(zhì)修飾的研究方法

1、蛋白質(zhì)修飾的研究方法人類基因組包含23,000個基因，然而，這些基因產(chǎn)生了顯著更大的 蛋白質(zhì)組。這是由于在轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平的多樣性。 單個基因在轉(zhuǎn) 錄后，可以通過可變剪接，偶爾通過RNA編輯，產(chǎn)生多個mRNA分 子。許多蛋白質(zhì)在翻譯后，通過蛋白質(zhì)修飾和 /或蛋白質(zhì)剪切，產(chǎn)生 成熟的和功能型的形態(tài)。通過廣泛的翻譯后修飾，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功 能就多樣性了。簡介相比于基因組包含的全部基因，人類蛋白質(zhì)組包含了更多的功能性多 肽，部分歸因于，翻譯的同時和翻譯后的蛋白修飾（圖1A）。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目的是獲得存在于特定的細(xì)胞或組織類型，和存在于健康或患病組織的功能蛋白質(zhì)的全貌。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要領(lǐng)域之

2、一，是識別那些翻譯后修飾的蛋白質(zhì)，及其修飾位點，確定修飾的功 能以及在細(xì)胞功能網(wǎng)絡(luò)中修飾蛋白的相互作用。放大0圖1.蛋白質(zhì)修飾.A,翻譯后修飾，以及可變剪接，在從單一基因生 成多種功能蛋白的過程中發(fā)揮重要作用。B,翻譯后修飾，作為細(xì)胞內(nèi)信號（磷酸化），蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控（泛素），轉(zhuǎn)錄調(diào)控（組蛋白 乙酰化和甲基化），細(xì)胞表面信號（糖基化）等多種多樣的細(xì)胞功能 中發(fā)揮重要作用。在過去的幾十年，開發(fā)了多種方法測定蛋白質(zhì)修飾。在這里，我們重 點介紹識別蛋白質(zhì)修飾的一般方法，質(zhì)譜；識別磷酸化的特異性方法, 磷酸鹽標(biāo)記；識別泛素化的方法；在染色質(zhì)重塑過程中識別組蛋白乙 ?；图谆姆椒?；識別蛋白質(zhì)糖基化的

3、方法（表 1和圖1B）詳細(xì)的實驗步驟以后將會整理歸納。修飾功能磷酸化細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)泛素化蛋白質(zhì)降解乙酰化和甲基化轉(zhuǎn)錄的調(diào)控糖基化細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)檢測* 質(zhì)譜放射性測量分析磷酸化特異抗體的免疫印跡* 質(zhì)譜* 泛素化檢測染色質(zhì)免疫沉淀ChlP-o n-chip* 質(zhì)譜高效液相色譜法表格1.蛋白質(zhì)修飾的類型，其主要的細(xì)胞功能，和主要的研究方法。 初步識別新的修飾位點的一個主要方法是計算機(jī)分析。 已經(jīng)廣泛應(yīng)用 計算機(jī)程序根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列識別假定修飾位點， 這不是本文的討論范圍。計算機(jī)程序的概述見 Liu and Li, 2011 1 。質(zhì)譜在過去 20 年來，質(zhì)譜分析已成為確定蛋白質(zhì)修飾類型和位點

4、的必不 可少的工具。 質(zhì)譜分析可用于純化的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的混合 ?物，例 如細(xì)胞裂解液 2 3 。質(zhì)譜儀從蛋白樣品產(chǎn)生氣相離子，根據(jù)質(zhì)荷比 (m/z) 將其分開，并記 錄其豐度。 質(zhì)譜可用于多肽和蛋白質(zhì)的分子量測定， 多肽氨基酸序列 的確定，和翻譯后修飾的檢測，以及多肽和蛋白質(zhì)的相對定量。這種 方法不能用于絕對定量。質(zhì)譜分析的樣品制備， 用限制性內(nèi)切酶如胰蛋白酶把蛋白質(zhì)或裂解液 消化成小分子多肽片段。然后蒸發(fā)和分析這些多肽片段，以確定其 m/z 值。由于酶切位點是已知的，所以就可以用計算機(jī)程序，根據(jù)質(zhì) 量確定每個肽段的特定氨基酸序列。 由于磷酸基等分子的分子量和電 荷是已知的，所以也可以檢測肽

5、段中特定氨基酸的磷酸化?；|(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)肽圖譜或納升電質(zhì)譜儀可以分析酶 解消化的蛋白質(zhì)樣品。 然而這些方法的局限是不能完全檢測所有多肽 片段，有些肽段清晰可見， 有些肽段不可見。這對于復(fù)雜混合物的分 析通常是一個主要問題， 對于修飾肽段和翻譯后修飾的分析， 先用反 相色譜分離多肽，然后餾分收集和用質(zhì)譜分析 (LC/MS)( 圖 2B) 4 。 為了更準(zhǔn)確地確定肽段修飾的性質(zhì)，經(jīng)常用串聯(lián)質(zhì)譜 (MS/MS) 實驗 (圖2A)。第一個MS步驟后，用惰性氣體撞擊多肽離子，從而導(dǎo)致進(jìn) 一步的碎片化。然后在第二個MS步驟分析這些多肽片段5。在此過程中，有些修飾肽段將保持不變，產(chǎn)生的肽

6、段模式類似于中未相撞 的肽段，有些肽段將顯著碎片化，產(chǎn)生的肽段模式可以為修飾氨基酸 的性質(zhì)和位點提供進(jìn)一步的信息。圖2.質(zhì)譜作為一般的蛋白質(zhì)修飾分析的工具。 A,質(zhì)譜（MS）分析 是利用肽電離分析蛋白質(zhì)碎片的質(zhì)量電荷比（m/z）。進(jìn)一步（MS/MS 分析），肽段進(jìn)一步碎片化以獲得更多的數(shù)據(jù)。 B, LC-MS/MS,蛋白 質(zhì)的復(fù)雜混合物，通過液相色譜進(jìn)行分離（左圖），然后MS/MS （右 圖）確定每個多肽片段21。除了被用來確定單一蛋白質(zhì)的修飾狀態(tài)，質(zhì)譜還被用來確定帶有某種 特定修飾如磷酸化的所有蛋白質(zhì)的廣泛數(shù)據(jù)集。 這通常涉及到質(zhì)譜分 析前的親和層析。這種技術(shù)被用于確定帶有這種修飾的次級蛋白

7、質(zhì)組'例如磷酸化蛋白質(zhì)組分析癌癥中整個信號網(wǎng)絡(luò)的激活狀態(tài)6。質(zhì)譜法已被用來確定上述所有四種修飾。然而，質(zhì)譜分析較為昂貴， 需要特定的設(shè)備，通常需要更多的定量數(shù)據(jù)，所以質(zhì)譜分析通常是結(jié) 合其他生化方法用于分析蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。多種MS方法的更廣 泛的綜述可參見2 , 3。磷酸化磷酸化，或絲氨酸，蘇氨酸或酪氨酸殘基增加一個磷酸基團(tuán)，是蛋白 質(zhì)修飾最常見的形式之一（圖3A）。在細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，蛋白質(zhì) 磷酸化起著重要的作用，是可逆的，微調(diào)的信號7。幾種體內(nèi)的和體外的方法，被用于檢測蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，檢測一個特定氨基酸的磷酸化，以及確定一個特定的激酶（或磷酸酶）是否作用于目標(biāo)蛋 白質(zhì)。

8、放大圖3.通過抗體分析的蛋白磷酸化檢測。A,磷酸化過程中，一個磷酸基團(tuán)被結(jié)合到絲氨酸，蘇氨酸或酪氨酸殘基。這個磷酸基團(tuán)可以被 用作標(biāo)記，無論是使用放射性磷酸鹽進(jìn)行放射性測量，或是使用針對磷酸化氨基酸的抗體。B,體內(nèi)磷酸化檢測確定c-Src對TH1的磷酸化。異位表達(dá)這兩個蛋白，對 Myc標(biāo)簽TH1進(jìn)行免疫沉淀，使用 通用的酪氨酸磷酸化抗體檢測在 c-Src表達(dá)有或無的情況下TH1的 磷酸化22。體外磷酸化分析放射測量激酶反應(yīng)使用32P-gamma-ATP，可用于檢測體外磷酸化狀 態(tài)8。這也是檢測特定激酶作用的金標(biāo)準(zhǔn)。在反應(yīng)緩沖液中，溫育純化的靶蛋白，激酶，和32P-gamma-ATP。然后，反應(yīng)

9、液用濾膜過 濾，蛋白質(zhì)結(jié)合到濾膜，洗去未結(jié)合的ATP，用閃爍計數(shù)器檢測磷酸化水平（保留在濾膜的放射性同位素）。或者，反應(yīng)液用SDS-PAGE 電泳分析，用X射線膠片暴光觀察。這種方法是半定量，但可以確 定磷酸化蛋白的分子量。放射性脈沖標(biāo)記為了檢測磷酸化體內(nèi) ,可以使用放射性脈沖標(biāo)記 9 。細(xì)胞生長于32 P-正磷酸鹽存在的條件下。然后用特定抗體免疫沉淀某種蛋白質(zhì)， 沉淀得到的放射性同位素，用閃爍計數(shù)器定量或 SDS-PAGE 電泳分 析和 X 射線膠片暴光。這種方法可以在各種生理條件下檢測磷酸化。 此外，與蛋白質(zhì)敲除實驗相結(jié)合， 這種方法也可用來分析一個特定的 激酶或磷酸酶是否影響靶蛋白的修飾

10、狀態(tài)。磷酸化特異性抗體 磷酸化特異性抗體有兩種類別。第一類是通用的 磷酸化酪氨酸 ，磷 酸化絲氨酸，磷酸化蘇氨酸抗體，將結(jié)合于任何磷酸化酪氨酸，磷酸 化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸分子， 與鄰近的氨基酸殘基無關(guān)。 第二類包 括的抗體是磷酸化特定氨基酸表位抗體（參見 摘要 在來邦網(wǎng)產(chǎn)品數(shù)據(jù)庫的磷酸化特異性抗體 ）。用計算機(jī)方法或用質(zhì)譜法識別了（假定）的磷酸化位點之后，可以從 公司購買針對磷酸化位點的通用抗體， 通過免疫沉淀的步驟， 以確定 目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在特定類型的位點被磷酸化（例如一個典型的 cyclin/cdk 位點） 10 。也可以使用針對一個特定的磷酸化氨基酸， 如磷酸化酪氨酸，制備的抗體（圖3

11、B）。接下來，針對特定表位制備磷 酸化抗體，通過簡單的免疫印跡檢測磷酸化。為了分析大量的樣品， 可以用酶聯(lián)免疫吸附試驗， 目標(biāo)蛋白結(jié)合到膜上， 然后用磷酸化特異 抗體檢測 11 。泛素化蛋白質(zhì)泛素化，或靶蛋白共價結(jié)合泛素，在蛋白質(zhì)降解中的研究最深 入。例如，泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解被證明在細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)中發(fā)揮了 至關(guān)重要的作用12。然而，最近的研究也發(fā)現(xiàn)了在多個不關(guān)乎蛋 白質(zhì)降解的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中泛素的作用。泛素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的多樣性是取決于目標(biāo)蛋白可以通過多種方式 被泛素修飾-在一個或多個位點的單泛素化，和通過幾種可能鍵合 的多泛素化13。每一個泛素分子有七個可能的賴氨酸殘基可用于 泛素鏈的

12、延伸；因此多泛素化的功用取決于泛素鏈延伸中所用的賴 氨酸殘基。而這是由特異的E2 （泛素結(jié)合酶）或E3 （泛素連接酶） 確定的，但是E1 （泛素激活酶）沒有特異性（圖4A）。特異賴氨酸鍵 合的多泛素鏈生成了獨(dú)特的結(jié)合表面，與特定相互作用蛋白的泛素結(jié) 合域相吻合。放大圖4.蛋白質(zhì)的泛素化體內(nèi)和 體外可以由基于免疫印跡的檢測分 析。A,體內(nèi)和體外蛋白質(zhì)泛素化的檢測需要底物蛋白，E1, E2, E3,ATP,泛素，然后可以通過 SDS-PAGE和Western印跡顯示泛素化 的底物。B,體內(nèi)泛素化實驗表明RNF185介導(dǎo)了 BNIP1的K63鍵 合的多泛素化。底物（BNIP1）, E3（RNF185

13、）,泛素都是異位表達(dá)的， 然后免疫沉淀Flag標(biāo)簽的底物，通過免疫印跡顯示myc標(biāo)簽的泛素23 泛素化的檢測方法可以識別特定賴氨酸殘基的泛素化或確認(rèn)特異的E3 （或E2）是否在靶蛋白的修飾上發(fā)揮了作用。檢測泛素化體內(nèi)的 最直截了當(dāng)和常用的方法是免疫沉淀認(rèn)定的泛素化蛋白，然后 SDS-PAGE/ 免疫印跡，觀察泛素化蛋白典型的梯狀。往往通過異位 表達(dá)靶蛋白，E3連接酶，甚至泛素，以確定突變的影響 （圖4B）。蛋 白酶體降解的抑制劑，如 MG132 ，通常被用來分析體內(nèi)靶蛋白的 K48 泛素化（降解錨定）。體外泛素化檢測（提供靶蛋白，泛素，E1，E2，和E3 ），結(jié)合SDS-PAGE ，接著蛋白質(zhì)

14、印跡，可以被用來更直接地檢測目標(biāo)蛋白 的泛素化。 目標(biāo)蛋白中賴氨酸殘基的突變實驗， 可以被用來確定泛素 的結(jié)合位點。相反，在多泛素化的情況下，泛素中特定的賴氨酸殘基 的突變實驗， 可以被用來確定特異的泛素鍵合方式。 為了發(fā)現(xiàn)新的泛 素化蛋白，可以進(jìn)行泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)純化，然后質(zhì)譜分析 14 。乙酰化和甲基化保守的核心組蛋白H2A，H2B，H3，和H4的表觀遺傳修飾（如磷 酸化，泛素化， 乙酰化和甲基化）在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用15 。例如，組蛋白尾部 N-末端賴氨酸殘基的乙?；图谆閷?dǎo) 染色質(zhì)域的形成， 如，常染色質(zhì)和異染色質(zhì)， 從而直接介導(dǎo)基因沉默。 檢測核心組蛋白的修飾狀態(tài)，是分

15、析基因表達(dá)調(diào)控的重要技術(shù)16 。組蛋白修飾的研究方法的詳細(xì)討論 這里.。修飾的組蛋白抗體和 ChIP所有已知的組蛋白修飾位點的抗體都可以從公司購買?？梢允褂眠@些 抗體，進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗17。簡言之，交聯(lián)劑如甲 醛處理細(xì)胞或組織樣本，組蛋白交聯(lián)到染色質(zhì)。超聲或核酸酶處理染 色質(zhì)，產(chǎn)生短的DNA片斷。然后用針對組蛋白特定修飾的抗體，進(jìn) 行免疫沉淀（IP）的實驗步驟。如果目標(biāo)基因或啟動子中假定的組蛋 白修飾位點是已知的，那么 PCR就可以對組蛋白某個位點的特定修 飾進(jìn)行定量（圖5A）。另外，這種方法可以用來確定通用啟動子區(qū)域內(nèi) 的組蛋白修飾位點，以及組蛋白某個位點的修飾動力學(xué) （圖

16、5B）。放大圖5.核心組蛋白的乙?；图谆梢酝ㄟ^染色質(zhì)的免疫沉淀確 定。A,染色質(zhì)的免疫沉淀（ChIP）可用于檢測核心組蛋白的修飾， 由此，基因的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)。B, ChIP分析是用來在更廣闊的啟動 子區(qū)域中確定組蛋白修飾的狹窄區(qū)域，以及TCA處理之后，對fos基因的組蛋白修飾動力學(xué)進(jìn)行檢測。TCA處理之后的長達(dá)4個小時， 對包括fos基因啟動子在內(nèi)的3kb區(qū)域的組蛋白甲基化狀態(tài)進(jìn)行了測 定24。ChIP-o n-chip如果組蛋白修飾位點是未知的，那么ChIP-on-chip就可以確定基因組中帶有特定組蛋白修飾的區(qū)域18。在這個實驗中，用不同的熒光素標(biāo)記IP的DNA片段和IP本身。然后

17、，樣品雜交于帶有DNA探 針的芯片，IP中某個DNA片段的富集與基因組中特定區(qū)域的組蛋白 特異修飾相關(guān)。ChIP和ChIP-on-chip實驗可以提供某個啟動子上組蛋白修飾的信 息，修飾狀態(tài)變化的動力學(xué)，以及在某個基因或調(diào)控序列中，或在整 個基因組中組蛋白修飾所在的位置。 這些表觀遺傳學(xué)變化既可以揭示 生理功能的正常基因調(diào)控，又可以揭示疾病發(fā)生的異常基因調(diào)控。糖基化在所有的蛋白質(zhì)中，將近 50 %的蛋白被糖基化，或結(jié)合多種糖基， 在多種多樣的生物過程中，從胚胎發(fā)育，細(xì)胞分裂，到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào) 控，糖基化都發(fā)揮作用。在正常的生理活動和疾?。ɡ缪装Y，敗血 癥和癌癥）過程中，多種不同蛋白質(zhì)的糖基化狀

18、態(tài)發(fā)生顯著變化。因 此，檢測蛋白質(zhì)糖基化的實驗，有助于疾病預(yù)后和治療目的的研究。蛋白糖基化的兩個主要類型是 N-糖基化（聚糖結(jié)合到天冬酰胺）和 O-糖基化（聚糖結(jié)合到絲氨酸或蘇氨酸）。不同于以上討論的蛋白修 飾，糖基化修飾的聚糖種類繁多。蛋白糖基化分析的目的是確定聚糖 基，被修飾的蛋白質(zhì)，或結(jié)合的位點。在一般情況下，糖基化分析， 可以使用三種不同的方法，概述如圖 6A :化學(xué)或酶解后對釋放的聚 糖本身的分析，胰蛋白酶消化后對糖肽的定性，或完整的糖蛋白中對 聚糖的定性。放大圖 6. 糖基化可通過質(zhì)譜測定， 以確定特定的修飾聚糖。 A, 糖基化 的質(zhì)譜測定有三種常用方法： 檢測完整的蛋白多糖， 檢

19、測胰蛋白酶消 化的產(chǎn)物，或檢測釋放的和分離的聚糖。 B, LC-MS 檢測小牛血清胎 球蛋白，表明 Cc5 細(xì)菌培養(yǎng)的（下圖）相比于未經(jīng)處理的（上圖） 胎球蛋白的糖基化變化。用胰蛋白酶消化胎球蛋白，然后用 LC-MS 分析。藍(lán)色正方形代表 GlcNAc ，紅色和綠色的圓形代表 Man 和 Gal, 橙色鉆石形代表 Sial 25 。聚糖分析 聚糖分析，可以用質(zhì)譜分析，有時并用高效液相色譜法。糖蛋白首先 經(jīng)過酶（肽N糖苷酶A或F）或化學(xué)（hydazinolysis ）方法釋放糖 基。 然后 LC/MS 直接分析釋放的低聚糖。 或者，酶或化學(xué)裂解產(chǎn)生 可以還原型末端被標(biāo)上熒光標(biāo)記，然后通過一些可能

20、的 HPLC 方法， 如親水作用色譜，分析熒光標(biāo)記的聚糖 19 。糖蛋白鑒定 雖然上述方法能提供特定聚糖的信息， 但是這些信息不能鑒定出帶有 特定修飾的蛋白質(zhì)， 也不能鑒定出糖基化的結(jié)合位點。 為了獲得此信 息，就要進(jìn)行蛋白內(nèi)切酶裂解（如胰蛋白酶消化），LC/MS 或HILIC-MS/MS 分析糖肽。這種方法提供的信息是帶有特定聚糖分子 的所有蛋白質(zhì)，或者是目標(biāo)蛋白中聚糖的結(jié)合位點 20 。例如，圖 6B，是Cc5細(xì)菌培養(yǎng)對特定胎球蛋白殘基的糖基化狀態(tài)的影響，分 析方法是胰蛋白酶消化后，用 LC-MS 檢測。參考文獻(xiàn)1. Liu C, Li H. In silico prediction of

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