大黃蟲丸抗實驗性肝纖維化的功效組分研究

1、大黃蟲丸抗實驗性肝纖維化的功效組分研究作者：賴景紹，蔡紅兵，陳文倩，劉強，陳育堯，呂志 平【摘要】目的觀察大黃蟲丸各功效組分對大鼠實驗性 肝纖維化的作用。方法建立肝纖維化大鼠模型。全自動生化 分析儀測定alt、ast、tp、alb,放免法測定ha、ln、civ、 pciii,光鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)及膠原纖維增生情況。結(jié)果 各功效組分均能一定程度上改善肝功能及降低肝纖維化血 清指標(biāo)，光鏡下可見各藥物組肝纖維化程度與模型組相比差 異顯著。其中活血化淤組在降低alt、ast及肝纖維血清指 標(biāo)方面效果較好，而滋陰養(yǎng)血組能更有效地升高tp及albo 結(jié)論大黃蟲丸各功效組分均有一定的抗肝纖維化作用，其中

2、活血化淤組作用更為明顯?！娟P(guān)鍵詞】肝纖維化；大黃蟲丸；肝功能；病理ab stract : objectiveto observetheeffectsofdividedfunctionof 1(dr-dzp)onexperim isinrats. methodslnalhepaticfibrosis, alanalyzerwasusedt alb,radioimmunoassdahuangzhechongpi1 entalhepaticfibros ratswithexperimentautomaticbiochemicodetectalt,ast,tp,aywasusedtodetecth a

3、,ln,c iv ,pcill ,andpat hologicalchangesun deralightmicroscopewerewiththemodelcpcouldimprovetheliserummarkersof1ivehepaticfibrosis； ill； liverfunctio n；ontrol,allthedr-dz verfunction,reducerfibrosis(pkeywordsdahuangzhechongppathology肝纖維化(hepaticfibrosis, h f)是指肝臟內(nèi)細(xì)胞外基 質(zhì)(ecm)的合成大于降解，導(dǎo)致纖維結(jié)締組織異常過度沉積。 肝

4、纖維化是肝硬化形成的早期階段和必經(jīng)階段，也是唯一在 一定情況下可被逆轉(zhuǎn)的階段。如病因持續(xù)存在，肝纖維化逐 漸加重，肝小葉及血管等逐漸被改建，肝臟的正常結(jié)構(gòu)遭到 破壞，中心靜脈區(qū)和匯管區(qū)出現(xiàn)間隔、假小葉形成，即發(fā)展 為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化1。大黃蟲丸出自張仲景所著金匱要略，由大黃、蟲、 水蛭、虻蟲、蠐螬、桃仁、干漆、生地黃、芍藥、黃芩、杏 仁、甘草12味藥材組成，具有疏通經(jīng)絡(luò)、破淤生新、緩中補 虛、清熱潤燥、滋陰養(yǎng)血之功效，是袪淤生新的代表方劑， 攻補兼施，主治五勞虛極，淤血內(nèi)停之干血勞；動物實驗及 臨床觀察表明大黃蟲丸對各種原因引起的肝纖維化均有良 好的治療作用26。本研究的目的是在全方有效的基礎(chǔ)

5、 上，按照大黃蟲丸的功效組成進行拆方研究，進一步探討大 黃蟲丸抗肝纖維化有效的功效組分，為深入研究其組方規(guī)律及作用機制奠定基礎(chǔ)。1材料與儀器動物健康wistar大鼠58只，雄性，體質(zhì)量180220g， 由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(合格證號：scxk粵x x-0015)。試劑二甲基亞硝胺，購自天津化學(xué)試劑研究所，批號 0605 23。藥物大黃蟲丸按功效將全方諸藥拆分為3部分，分別為： 活血化淤組，由水蛭60g，蟲30g，虻蟲45g，蠐螬45g，桃 仁120g，干漆30g組成；清熱潤燥組，由大黃300g,黃芩60g， 杏仁120g組成；滋陰養(yǎng)血組，由生地黃300g,芍藥120g， 甘草90g組

6、成7。12味中藥藥材由南方醫(yī)科大學(xué)中藥制劑 教研室提供，將1 2味中藥分別制成超微粉劑，臨用前按照全 方的劑量比配制成混懸液使用。儀器au5400全自動生化分析儀；普通光學(xué)顯微鏡；超薄 石蠟切片機，模型組及各藥物組大鼠以10mg/(kg d)%d麗 溶液腹腔注射，每周連續(xù)3d，共4周8。造模的第1天開 始灌胃給藥，大黃蟲丸全方組每日給藥劑量為g/k g、活血 化淤組g/kg、清熱潤燥組g/kg、滋陰養(yǎng)血組g/kg，連續(xù)灌 胃28d。在整個實驗過程中，以普通飼料喂養(yǎng)大鼠，自由飲 用自來水。指標(biāo)檢測實驗期滿后，動物禁食不禁水12h,用10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈采血，真空負(fù)壓采血管收集，室溫

7、靜置h，2 500r/min離心15min,取上層血清，分裝于離心 管中，用au540 0全自動生化分析儀測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶 (alt)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ast)、總蛋白(tp)、白蛋白(alb)，拭 劑盒為南京建成生物工程公司產(chǎn)品；放免法測定血清透明質(zhì) 酸(ha)、層粘蛋白(ln)、iv型膠原(civ)、iii前膠原(pciii)， 試劑盒來自上海海研生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。病理學(xué)觀察大鼠予10%水合氯醛腹腔麻醉后，仰臥位 定，打開腹腔，取cmxcmxcm大小肝組織，40g/l中性甲醒 液固定，24h后逐級酒精脫水，二甲苯透明，56°c石蠟包埋，4 um厚切片，制成切片分別用于進行蘇木素

8、-伊紅及mallory 染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)及膠原纖維增生情況。肝纖 維化程度分級參考9: 0級，肝組織正常，無膠原纖維增 生；i級，膠原纖維在匯管區(qū)或中央靜脈周圍輕度增多；ii 級，中央靜脈區(qū)膠原纖維間隔形成；iii級，中央靜脈到中央 靜脈或中央靜脈到匯管區(qū)纖維間隔形成或相連接；iv級，多 數(shù)纖維間隔形成，分隔肝實質(zhì)并形成假小葉，假小葉中央時 見匯管區(qū)。統(tǒng)計學(xué)分析利用統(tǒng)計軟件，對計量資料采用單向方差分析，先對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，并分別用lsd或games-ho well法進行組間比較，結(jié)果以±s表示；對等級資料采用非 參數(shù)組間秩和檢驗。3結(jié)果一般狀況和形態(tài)學(xué)觀察實驗過程中

9、，正常組大鼠生長狀 態(tài)良好，皮毛光滑，二便如常；模型組大鼠活動少，喜睡少 動，皮毛欠光滑，尿色黃；各藥物組大鼠狀態(tài)較正常組稍差， 但比模型組明顯改善。全部實驗結(jié)束后，正常組大鼠無死亡， 模型組及滋陰養(yǎng)血組丸組大鼠各死亡3只，大黃蟲丸全方組、 活血化淤組及清熱潤燥組大鼠各死亡2只，死亡多在造模第 4周后發(fā)生。各藥物干預(yù)組間死亡率無明顯差異。血清alt、ast、tp、alb的變化與正常組比較，模型組 alt.ast的含量顯著升高（p肝纖維化指標(biāo)（血清中ha,ln, civ , pciii）的變化與正常組相比，模型組動物血清中的ha，ln, civ , pc iii顯著升高（p）。結(jié)果見表2。表2不

10、同藥物組對肝纖維化 大鼠肝纖維化指標(biāo)的影響各組大鼠肝臟病理組織學(xué)結(jié)果結(jié)果見表3。正常組大鼠 肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無炎細(xì)胞浸潤及膠原纖維增生；模型組大 鼠肝纖維化程度較明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)不完善，肝細(xì)胞片狀壞 死、炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，有膠原纖維構(gòu)成的纖維間隔，形成 假小葉。清熱潤燥組及滋陰養(yǎng)血組匯管區(qū)仍有不同程度的纖 維增生、炎性細(xì)胞浸潤，少數(shù)大鼠仍有不完全性假小葉形成， 但較模型組輕；而大黃蟲丸全方及活血化淤組僅可見少量肝 組織炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞壞死少見，纖維增生不明顯，與 模型組相比，肝纖維化程度減輕更為明顯。表3各組肝纖 維化程度比較例4討論肝纖維化是向肝硬化發(fā)展的過渡階段，是危害人類健康 的常見

11、病和多發(fā)病，中藥復(fù)方治療是祖國醫(yī)學(xué)的特點所在， 中醫(yī)藥抗肝纖維化的作用日益受到人們的重視10，而有 關(guān)中藥復(fù)方組方規(guī)律的現(xiàn)代化研究更是一個熱點課題。祖國醫(yī)學(xué)把肝纖維化歸屬于“癥積” “脅痛” “黃疽”等 范疇，認(rèn)為其病因病機初期多因濕熱毒邪侵害肝膽，濕熱困 阻中焦，久而形成血淤，為淤血內(nèi)阻肝經(jīng)，加之久病人體正 氣漸虛，形成虛實夾雜的復(fù)雜證候。大黃蟲丸是著名的經(jīng)方， 在臨床上應(yīng)用廣泛，本方并非單純一活血化淤方，既有破血 逐淤之蟲類藥，又伍以滋陰養(yǎng)血及清熱潤燥之品。因而，本 方為攻補兼施、緩中補虛的典型方劑，其整方抗肝纖維化的 療效確切，但有關(guān)大黃蟲丸功效組分的拆方研究報道甚少， 本實驗為研究大黃

12、蟲丸抗肝纖維化的主要功效成分及組方 規(guī)律，分別以全方及各功效組分干預(yù)麗n誘導(dǎo)的肝纖維化模 型大鼠來觀察藥物作用。dmn具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性，造模4周即有 明顯肝纖維化表現(xiàn)，具有造模周期短、肝纖維化形成相對穩(wěn) 定的特點，所致病變類似人類肝病病理改變，且長期穩(wěn)定存 在，較適宜進行肝纖維化的研究。這次實驗通過腹腔注射麗n 制備大鼠肝纖維化模型，在大黃蟲丸全方有效的基礎(chǔ)上按功 效組分進行拆方研究，探討其組方規(guī)律。結(jié)果顯示，與正常 組大鼠比較，模型組大鼠肝功能及肝纖維化各項血清指標(biāo)明 顯異常，且病理組織顯示模型組大鼠肝纖維化程度明顯，表 明用d酮誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型存在明顯肝損傷及肝纖維化 病

13、變；大黃蟲丸拆方各功效組分對實驗性肝纖維化大鼠有不 同程度改善肝功能、降低肝纖維化各項指標(biāo)的作用，其中全 方組及活血化淤組在降低alt、ast及肝纖維化血清指標(biāo)方 面效果最為明顯，而滋陰養(yǎng)血組有明顯的升高總蛋白和白蛋 白的作用；病理組織觀察顯示大黃蟲丸全方及各功效組分均 可以不同程度減輕肝內(nèi)炎細(xì)胞浸潤程度，減少肝臟膠原纖維 增生，從而達(dá)到降低肝纖維程度的目的，尤其以全方組及活 血化淤組效果最為明顯。表明大黃蟲丸全方及各功效組分能 抑制膠原過度增生沉積，具有良好的抗肝纖維化大鼠模型肝 損傷及肝纖維化的作用。綜上所述，肝纖維化病機不外乎“熱毒、血淤、體虛”， 前期熱毒侵犯，日久則正氣漸虛，但其病變

14、主要階段仍在于 淤血內(nèi)阻；而大黃蟲丸從方劑組成藥物中可以看出，主要由 活血、清熱、補虛三部分藥物組成，既有桃仁及各蟲類藥物 活血化淤散結(jié)，又合大黃、黃岑、杏仁清解郁熱，加上地黃、 芍藥、甘草滋陰養(yǎng)血濡脈，諸藥合用可起到活血化淤為主兼 有補虛及清熱解毒之功。本次實驗結(jié)果亦表明，大黃蟲丸全方及各功效組分通過保護肝功能及抑制肝臟纖維組織形成， 有一定的抗肝纖維化作用，其中以整方作用最為明顯，而各 功效組分中活血化淤組效果更佳，這可能與其疏通經(jīng)絡(luò)、活 血化淤功效有關(guān)，但其確切作用機制有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】1 xiaojc,jinxl,rue kp,etal. hepatieprogenitorc

15、ellsinhumanlivercirrhosis：immunohistochemical,candimmunofluorencelectronmicroscopi encefindings j .worldjgastroenterol, xx, 10 (8):1208.2 chenxiaoyin,lienqi ng,yangqinhe,etal.clinicalstudyofdahuangzhechongpil1 intreatingposthepati tisbhepaticf ibrosi s j. cjim, xx， 10:63 .3 蔡紅兵.大黃蟲丸對肝纖維化大鼠細(xì)胞因子表迖譜 的影響及其調(diào)控機制研究d.中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù) 庫，xx： 6.4 梁小立.大黃蟲丸治療病毒性肝炎肝硬化臨床觀察 j.中外醫(yī)療，xx，11:129.5 徐列明.肝纖維化中醫(yī)藥治療和評價j.藥品評 價，xx，4: 285.6 伍竹君，王邦才.中醫(yī)藥調(diào)節(jié)肝纖維化相關(guān)因子的研究進展j.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，xx，6: 784.hironakak,terais,e imethylnitrosamineverfibrosiswithine7 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典s.北京: 化學(xué)工業(yè)出版社，xx ： 3