南亞實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組及嗅覺(jué)相關(guān)基因的初步分析

1、南亞實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組及嗅覺(jué)相關(guān)基因的初步分析DUYinggang1，2，JIQinge3，LAIZhongxiong2*1.FacilityHorticultureLaboratoryofUniversitiesinShandong，WeifangUniversityofScienceandTechnology，Shouguang，Shandong262700，China;2.InstituteofSubtropicalPomology，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350002，China;3.CollegeofPlantP

2、rotection，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350002，Chinaaswellastheestablishmentofcontrolmeasuresbasedonolfactories.Walker;analysisoftranscriptome;high-throughputsequencing;geneannotation;olfactiongenes10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.018南亞實(shí)蠅Hendel【5】。目前，對(duì)南亞實(shí)蠅的防治措施主要借鑒橘小實(shí)蠅進(jìn)行了進(jìn)化分析，為

3、南亞實(shí)蠅嗅覺(jué)機(jī)理的探討和防治方法的尋求提供了重要數(shù)據(jù)。材料1.1.1供試蟲(chóng)源及飼養(yǎng)方法室內(nèi)大量飼養(yǎng)蟲(chóng)源為福建農(nóng)林大學(xué)益蟲(chóng)研究所2021年建立的室內(nèi)大量飼養(yǎng)種群，初始種群采自漳州為害絲瓜，本實(shí)驗(yàn)用蟲(chóng)為同地點(diǎn)同類(lèi)寄主上野生蟲(chóng)源連續(xù)復(fù)壯3次后的蟲(chóng)源;輻照蟲(chóng)源為用95Gy/100Gy劑量的60Co輻照的羽化前2d的蛹，羽化后正常人工飼料飼養(yǎng)的蟲(chóng)源12;ME/CUE亞劑量誘導(dǎo)蟲(chóng)源為取1mL純的ME/CUE均勻涂抹盛在直徑60mm培養(yǎng)皿中的人工飼料外表，于羽化后2d性成熟前、5d發(fā)育關(guān)鍵日齡、7d交配前飼喂3次，連續(xù)誘導(dǎo)4代的蟲(chóng)源。飼養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)13。1.1.2測(cè)序樣本正常飼養(yǎng)、輻照處理、CUE/ME誘

4、導(dǎo)的南亞實(shí)蠅在1日齡對(duì)ME有觸角電位反應(yīng)，但沒(méi)趨性【6】、5日齡對(duì)ME/CUE開(kāi)始有趨性反應(yīng)，但性未成熟、10日齡性成熟、交配前后、17日齡產(chǎn)卵后、19日齡局部實(shí)蠅開(kāi)始出現(xiàn)2次交配雌雄各取5只，平行取3管，液氮速凍后送至北京百邁客生物科技進(jìn)行測(cè)序和分析，測(cè)序系統(tǒng)為HiSeq2500PE125測(cè)序儀。方法1.2.1RNA的提取樣品充分研磨后用TrizolReagent提取RNA，用Nanodrop分光光度計(jì)德國(guó)Implen公司、Qubit2.0熒光定量?jī)x美國(guó)LifeTechnologies公司、Agilent2100系統(tǒng)美國(guó)AgilentTechnologies公司方法檢測(cè)RNA樣品的純度、濃度

5、和完整性。1.2.2文庫(kù)的構(gòu)建、測(cè)序及數(shù)據(jù)的拼接、組裝RNA樣品檢測(cè)合格后，按照PreparingSamplesforSequencingofmRNA試劑盒說(shuō)明書(shū)Illumina構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。當(dāng)庫(kù)檢合格后，用IlluminaHiSeq2500的PE125bp雙向測(cè)序技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到堿基質(zhì)量打分能到達(dá)或超過(guò)Q30高質(zhì)量的Rawdata進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除其中接頭序列及低質(zhì)量Reads，獲得高質(zhì)量的Cleandata。然后利用短reads組裝軟件Trinity將具有重疊區(qū)域的Cleandata進(jìn)行序列組裝，獲得Unigene庫(kù)。1.2.3Unigene功能注釋使用BLAST軟件將Uni

6、gene序列與NRNon-redundantproteindatabase，非冗余的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)、Swiss-ProtAmanuallyannotatedandreviewedproteinsequencedatabase，人工注釋和審查蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)、GOGeneontology，基因本體、COGClusteroforthologousgroups，蛋白相鄰類(lèi)的聚簇、KOGEukaryoticorthologousgroups，真核生物同源組、PfamPfamdatabase，同源蛋白家族數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGGKyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，京都基因與基

7、因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，通過(guò)基因的相似性進(jìn)行功能注釋。1.2.4嗅覺(jué)相關(guān)基因鑒定分析根據(jù)獲得的南亞實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)嗅覺(jué)系統(tǒng)相關(guān)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在NCBI、公共數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并與已登錄的黑腹果蠅等昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)相關(guān)基因的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，其中OBPs、CSPs結(jié)合其特有的結(jié)構(gòu)通式14-15進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。鑒定出來(lái)的OBPs用MEGA5.0的Neighbor-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，以Bootstrap=1000檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)的可靠性。的提取與檢測(cè)總RNA提取完整，OD為0.91，28S/18S為1.4，濃度分別為2873.4ng/L，RNA純度和質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及序列

8、拼接組裝對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)，共得到10.97GbCleanData，Q30比例測(cè)序錯(cuò)誤率90%，GC含量為43.58%。說(shuō)明此樣品測(cè)序的數(shù)據(jù)符合要求，可以保證后續(xù)序列拼接組裝質(zhì)量。采用Trinity軟件把獲得的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列組裝，取每條基因中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene，得到36109條Unigenes表1。其中N50和平均長(zhǎng)度分別為1897和955.14bp，說(shuō)明此轉(zhuǎn)錄本文庫(kù)的測(cè)序和組裝結(jié)果較好，能夠進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。的功能注釋使用BLAST軟件將36109條Unigenes與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得Unigen

9、e的注釋信息。最終獲得21127條有注釋信息的Unigenes，占總Unigenes的58.51%，其中在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋成功的Unigenes數(shù)目最多，20948條，占總數(shù)的58.01%;其后依次是Swiss-Prot有14103條39.06%，GO有14029條38.85%，KOG有13479條37.33%，Pfam有12670條35.09%，KEGG有6442條17.84%和COG有5984條16.57%表2。Unigene注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種分布圖顯示圖1，地中海實(shí)蠅153條;其他物種2718條。的功能分類(lèi)對(duì)南亞實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組的Unigenes進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，在GO注釋的14029條

10、Unigenes中，注釋到生物學(xué)過(guò)程Biologicalprocess的基因最多52151條，其次是分子功能Molecularfunctiion25047條，細(xì)胞組分Cellularcomponent的最少18959條。在57個(gè)亞類(lèi)中，以細(xì)胞過(guò)程、單生物過(guò)程、代謝過(guò)程在生物學(xué)過(guò)程中的比例較高，細(xì)胞和細(xì)胞局部在細(xì)胞組分中所占比例較高，蛋白結(jié)合和催化活性在分子功能分類(lèi)中占有較高比例圖2。對(duì)南亞實(shí)蠅的Unigenes基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能分類(lèi)，可以從宏觀上認(rèn)識(shí)南亞實(shí)蠅基因功能分布特征，為下一步目標(biāo)基因的挖掘提供了便利。將組裝得到的Unigenes與KOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共有13479個(gè)Unigenes基

11、因被注釋?zhuān)?7.33%，分為25個(gè)類(lèi)別，最多的是一般功能預(yù)測(cè)基因1681個(gè)，占12.47%;其次，是翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與合成基因711個(gè)，占5.27%;第三，是復(fù)制、重組和修復(fù)基因629個(gè)，占4.67%;第四，是翻譯后的修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化、伴侶基因584個(gè)，占4.33%;最少的是核酸結(jié)構(gòu)基因2個(gè)，占0.01%，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)基因0個(gè)圖3，說(shuō)明了南亞實(shí)蠅Unigenes功能分類(lèi)的總體情況。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)南亞實(shí)蠅的Unigenes可能參與或涉及的代謝途徑進(jìn)行分析說(shuō)明，6442個(gè)Unigenes參與了細(xì)胞過(guò)程cellularprocessing、環(huán)境信息處理environmentalinformatio

12、nprocessing、遺傳信息處理geneticinformationprocessing、代謝metabolism和生物系統(tǒng)organismalsystems5大類(lèi)共152個(gè)代謝通路，其中注釋基因數(shù)最多的10個(gè)代謝通路依次為：核糖體276個(gè)、氧化磷酸化268個(gè)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工246個(gè)、RNA運(yùn)輸233個(gè)、嘌呤代謝181個(gè)、剪接體174個(gè)、細(xì)胞內(nèi)吞作用146個(gè)、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解143個(gè)、溶酶體141個(gè)和吞噬體133個(gè)表3。嗅覺(jué)相關(guān)基因分析通過(guò)對(duì)7大公共數(shù)據(jù)庫(kù)同源比對(duì)和注釋分析，528個(gè)嗅覺(jué)相關(guān)基因在南亞實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組中獲得鑒定。其中包括34個(gè)OBPAKM45842.1序列一致性?xún)H為44%且在

13、進(jìn)化樹(shù)中形成一個(gè)獨(dú)立的小分支，說(shuō)明不同種類(lèi)的實(shí)蠅OBPs出現(xiàn)了各自的分化。副信息素類(lèi)引誘劑從發(fā)現(xiàn)其對(duì)實(shí)蠅相關(guān)種類(lèi)雄性具有強(qiáng)引誘活性開(kāi)始，就一直在實(shí)蠅綜合防治和監(jiān)控上發(fā)揮著重要作用8，在很多地區(qū)甚至是唯一的防治措施。但在施用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：相關(guān)實(shí)蠅種類(lèi)的雄蟲(chóng)取食少量的引誘劑不但不會(huì)死亡還可大幅度提高其交配競(jìng)爭(zhēng)能力以及對(duì)雌性的吸引力6，16;實(shí)蠅經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的ME處理后不但有助于性成熟17，且其當(dāng)代和后代雄性對(duì)ME的敏感性下降，有些學(xué)者據(jù)此擔(dān)憂副信息素類(lèi)誘劑不合理的使用會(huì)導(dǎo)致田間出現(xiàn)其抗性種群8;實(shí)蠅輻照成為不育雄蠅后，對(duì)引誘劑的反應(yīng)活性降低且開(kāi)始反應(yīng)的日齡推遲，飼喂一定量的引誘劑后交配能力得到一定程

14、度的恢復(fù)18，據(jù)此副信息素類(lèi)引誘劑被廣泛應(yīng)用到實(shí)蠅SIT工程中19。為探討副信息素類(lèi)引誘劑使用對(duì)南亞實(shí)蠅嗅覺(jué)相關(guān)基因的影響，進(jìn)而指導(dǎo)其在實(shí)蠅監(jiān)測(cè)、防治中的合理應(yīng)用，本研究綜合考慮轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的特點(diǎn)20和南亞實(shí)蠅當(dāng)時(shí)的發(fā)育歷期21-22，對(duì)正常飼養(yǎng)、輻照處理、副信息素類(lèi)引誘劑誘導(dǎo)下的蟲(chóng)源在不同日齡進(jìn)行了混合取樣和測(cè)序。該樣品通過(guò)組裝共獲得36109條Unigenes，其中N50長(zhǎng)度為1897bp，獲得了測(cè)序和組裝結(jié)果較好，能滿足后續(xù)對(duì)功能基因挖掘要求的轉(zhuǎn)錄本文庫(kù)。進(jìn)一步將得到的Unigenes通過(guò)Blast與7大公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性搜索獲得21127條Unigenes58.51%的注釋?zhuān)渲性贜R

15、注釋成功的Unigenes數(shù)目最多，20948條58.01%，且在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中，注釋到地中海實(shí)蠅上的Unigenes為3112條，占在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中總注釋Unigenes的14.86%，這不但說(shuō)明了地中海實(shí)蠅與南亞實(shí)蠅的親緣關(guān)系較近，也進(jìn)一步說(shuō)明了此轉(zhuǎn)錄本文庫(kù)組裝和注釋的正確，還有，這2種昆蟲(chóng)都有基因組數(shù)據(jù)，這為下一步南亞實(shí)蠅功能基因的挖掘和生物信息學(xué)分析提供了便利。同時(shí)，利用GO、KOG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)南亞實(shí)蠅Unigenes進(jìn)行了基因功能分類(lèi)和功能預(yù)測(cè)，用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)南亞實(shí)蠅6442條Unigenes進(jìn)行了代謝通路初步分析，這為下一步挖掘功能基因及開(kāi)展靶標(biāo)基因的克隆及功能驗(yàn)證提供了根底數(shù)據(jù)。嗅覺(jué)

16、在昆蟲(chóng)寄主定位與選擇、躲避天敵、尋找配偶、產(chǎn)卵行為等生命活動(dòng)中發(fā)揮著感知寄主揮發(fā)物、昆蟲(chóng)利它素、昆蟲(chóng)信息素等氣味物質(zhì)的重要作用，昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了一套高度專(zhuān)一、極其靈敏、復(fù)雜的嗅覺(jué)系統(tǒng)，系統(tǒng)中涉及OBP、CSP、OR、SNMP、IR、G-Protein和ODE等多種蛋白家族23。其中OBP的功能是將外界疏水性的氣味分子運(yùn)載到嗅覺(jué)神經(jīng)樹(shù)突膜上的感覺(jué)受體OR，是昆蟲(chóng)實(shí)現(xiàn)嗅覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一步，也是目前研究較多、機(jī)理了解最多的一步。在該轉(zhuǎn)錄本中，我們初步篩選出了528個(gè)嗅覺(jué)相關(guān)基因，其中包括34個(gè)及其他功能基因提供了依據(jù)，也為下一步以該蛋白為根底，探討南亞實(shí)蠅對(duì)副信息素的引誘機(jī)理并篩選新的引誘

17、成分提供了根底數(shù)據(jù)。參考文獻(xiàn)【1】陳海東，周昌清，楊平均，等.瓜實(shí)蠅、桔小實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅在廣州地區(qū)的種群動(dòng)態(tài)J.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1995，224：348-354.【2】黃振.果實(shí)蠅屬重要種的鑒定、人工飼料篩選、適生性預(yù)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)分析D.?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2021.【3】駱米娟，張賀賀，陳家驊，等.南亞實(shí)蠅成蟲(chóng)腸道細(xì)菌的別離與鑒定J.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2021，451：8-13.【4】馬興莉，李志紅，胡學(xué)難，等.橘小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅和南亞果實(shí)蠅對(duì)廣東省造成的經(jīng)濟(jì)損失評(píng)估J.植物檢疫，2021，273：50-56.【5】周波.南亞實(shí)蠅生物學(xué)特性及不同食料對(duì)其種群增長(zhǎng)的影響D.重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2

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