D13生物制藥組3實訓報告

1、D13生物制藥組3實訓報告目錄一、 實訓主要內(nèi)容：2二、 試劑的配制、培養(yǎng)基的配制31. 試劑的配制32. 培養(yǎng)基的配制33. 醋酸鈉-醋酸緩沖液pH44. 1%可溶性淀粉溶液4三、 實驗前的準備41. 滅菌42. 23號菌種的培養(yǎng)63. 固體平板培養(yǎng)基的制備7四、 實驗內(nèi)容及操作81. 接種培養(yǎng)82. 活菌數(shù)檢測83. 酶活檢測114. 菌液濁度檢測145. 酶蛋白的提取156. 細菌的染色和鏡檢16五、 數(shù)據(jù)分析171. 活菌數(shù)隨培養(yǎng)時間的變化172. 酶活力隨培養(yǎng)時間的變化183. 菌液濁度隨培養(yǎng)時間的變化184. pH對提取的酶蛋白的變化19六、 實驗總結2020一、 實訓主要內(nèi)容：活

2、菌數(shù)的檢測、酶活檢測、菌液濁度的檢測、酶蛋白的提取組3組員12表1根據(jù)實訓時間，列出下列表格，以便后續(xù)的實驗培養(yǎng)時間（h）接種時間取樣時間36.24 8:309:006.24 12:0066.24 8:309:006.24 15:007.56.24 8:309:006.24 16:30126.24下午16:30 （20:00）（4）（30）6.25 8:00166.24下午 16:3017:006.25 8:00186.24下午 16:3017:006.25 11:00216.24下午 16:3017:006.25 14:00246.25 9:006.26 9:00276.25 9:006.2

3、6 12:00306.25 9:006.26 15:00表格1注：紅色標記為未檢測項目。二、 試劑的配制、培養(yǎng)基的配制1. 試劑的配制所配的試劑名稱所需試劑的質(zhì)量或體積0.2M醋酸鈉母液200ml3.28g0.2M醋酸母液200ml2.299ml2mol/L氫氧化鈉溶液500ml40g1%磷酸二氫鉀母液250ml2.5g1%七水硫酸亞鐵母液250ml2.5g1%硫酸銨母液250ml2.5g0.5%氯化鈣母液250ml1.25g0.5%七水硫酸鎂母液250ml1.25g表格2由于這些母液上個班配的還沒用完，所以也就沒再配。2. 培養(yǎng)基的配制組3發(fā)酵培養(yǎng)基的配制（V總）150ml試劑所需（ml）/

4、（g）所得終濃度1%磷酸二氫鉀15ml0.1%磷酸二氫鉀1%七水硫酸亞鐵1.5ml0.01%七水硫酸亞鐵0.5%氯化鈣7.5ml0.025%氯化鈣0.5%七水硫酸鎂15ml0.05%七水硫酸鎂1%硫酸銨15ml0.1%硫酸銨可溶性淀粉2.26g1.5%蛋白胨1.52g1%氯化鈉0.79g0.5%牛肉膏0.73g0.5%最終培養(yǎng)基pH值為5.0表格3營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制試劑所需質(zhì)量營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基16g稱取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基16.08g，加水定容至500ml，煮沸溶解表格43. 醋酸鈉-醋酸緩沖液pHpH0.2M醋酸鈉0.2M醋酸4.01.8ml8.2ml5.07.0ml3.0ml6.09.4ml0.

5、6ml表格54. 1%可溶性淀粉溶液稱取1.24g可溶性淀粉，用約15ml冷的蒸餾水充分溶解混勻，取約70ml沸騰的蒸餾水，將已經(jīng)混勻的淀粉懸浮液倒入沸水中，邊倒邊用玻璃棒攪拌，使淀粉溶解。冷卻后，用冷的蒸餾水定容到100ml，備用。三、 實驗前的準備1. 滅菌將配好的發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于15個規(guī)格為100ml錐形瓶，9ml/瓶250ml錐形瓶+150ml蒸餾水5瓶將配好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分裝于規(guī)格為250ml錐形瓶，2瓶置于高壓蒸汽滅菌鍋121，20min滅菌圖三1圖三22. 23號菌種的培養(yǎng)取23號菌種在超凈工作臺內(nèi)進行接種，100ul/瓶，共3瓶，供后續(xù)實驗菌種的來源。置于搖床中培養(yǎng)30，10

6、0rmp/min。圖三3圖三43. 固體平板培養(yǎng)基的制備取滅好菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，在超凈工作臺里倒入平板中，大約15ml/個。供后續(xù)檢測活菌數(shù)使用。圖三5圖三6注意事項：在配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基時，要先加少量水進行溶解攪拌，再加熱水進行充分溶解，最后煮沸使瓊脂全部溶解，否則瓊脂沒有溶解就分裝，滅菌后就出現(xiàn)上圖現(xiàn)象，有的培養(yǎng)基太硬，有的太軟。四、 實驗內(nèi)容及操作1. 接種培養(yǎng)根據(jù)表2時間表進行接種培養(yǎng)，100ul/瓶，置于搖床30，100rmp/min培養(yǎng)。圖四12. 活菌數(shù)檢測根據(jù)表2時間表進行操作，取菌液100ul+900ul無菌水于EP管中進行連續(xù)梯度稀釋，然后取100ul在平板培養(yǎng)基上進行涂

7、布。放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得下表數(shù)據(jù)。活菌數(shù)隨培養(yǎng)時間變化表時間（hr）稀釋倍數(shù)菌數(shù)平均值010811×108310709×1061069610822×1087.510678.5×106107112106241.8×108107910853161071275.2×101010823010913318109332.0×101010873211091066.3×101010821024108231.615×10101093027未檢測30未檢測表四1圖四2圖四3圖四4圖四5（為6h失敗平板）注意事項:菌液稀釋倍數(shù)

8、要合理，在進行用涂布棒涂布的時候，涂布棒在酒精燈上灼燒后一定要冷卻，否則會燙死菌種。涂布要均勻，多來回涂幾次，否則就成上圖6h失敗平板3. 酶活檢測計算公式：酶活力（U）=（A-空白）-（B-空白）-（對照-空白）×V標/t反應×D（倍數(shù)值）×103根據(jù)表2時間表進行對應的時間段酶活的檢測，,按照下表進行操作步驟試劑空白對照AB1發(fā)酵液上清0ml0ml100ul100ul2H2O100ul100ul0ml0ml3醋酸鈉-醋酸緩沖液400ul4H2O1ml0ml0ml1ml51%可溶性淀粉溶液0ml1ml1ml0ml6室溫放置反應5min5min7立即加2MNaOH

9、2ml8DNS溶液2ml9100加熱顯色6-8min10冰水冷卻3min11補水定容4.5ml12540nm檢測表四2根據(jù)上表進行操作得到以下數(shù)據(jù)酶活力隨培養(yǎng)時間變化培養(yǎng)時間（h）A值（平均值）B值空白對照酶活力30.3350.1080.1070.22910.560.6490.3740.1080.2331507.50.9620.6300.1070.235204120.8920.5730.1070.214212160.8320.5490.1060.207182180.8090.4980.1070.22918.9210.6600.3620.1070.22917.6240.6060.3050.106

10、0.26813.927未檢測30未檢測表四3圖四6圖四7圖四8圖四9注意事項：在使用儀器時，樣品室使用完都要清洗，樣品室的石英窗應保持清潔，樣品室石英窗不應有污染。4. 菌液濁度檢測按照培養(yǎng)時間的不同對菌液稀釋10倍操作是取0.5ml菌液+4.5ml水，共3只，所測結果取平均值。對菌液稀釋50倍操作是取1ml菌液+4ml水，再從中取出0.5ml+4.5ml水，即得稀釋50倍，共3只，所測結果取平均值。下表為所得數(shù)據(jù)菌液濁度檢測培養(yǎng)時間（hr）菌液稀釋倍數(shù)吸光度值菌液濁度3100.0930.936100.4074.077.5100.6576.5712500.2713.516500.3819185

11、00.40720.3521500.4321.524500.51325.6527未檢測30未檢測表四4圖四105. 酶蛋白的提取取培養(yǎng)菌液于離心管中，進行5000rmp，10min離心。取上清，加入50ml冰的無水乙醇，放入4冰箱1h。5000rmp，20min離心。棄上清，加入1ml蒸餾水，混勻溶解。改變醋酸鈉-醋酸緩沖液pH進行酶活力檢測，得以下數(shù)據(jù)蛋白提取酶活力表pH值空白對照AB酶活力pH4.00.1070.2841.2270.99159pH5.00.1060.2671.3150.940214pH6.00.1060.2641.3830.939286表四5圖四11注意事項：加入的無水乙醇一

12、定是要冰的，不然容易使酶失活。6. 細菌的染色和鏡檢1.滴加少量種子液于干凈載玻片上，用鑷子置于酒精燈上端干燥。2.待到種子液干燥后，滴加結晶紫染液于細菌涂抹處，使其布滿菌膜，染色1min，用蒸餾水洗去多余染液，甩干載玻片上的積水。3.滴加碘液覆蓋菌膜，維持1min，用蒸餾水洗去，將載玻片上的積水甩干。4.加95%酒精加于載玻片上脫色，左右搖動使其脫色均勻，脫色時間約為30s，脫色后立即用蒸餾水沖洗干凈。5.滴加稀釋復紅染液于菌膜上，覆蓋住菌膜，染色1min。用蒸餾水沖洗去染液，甩去載玻片上積水。6.待到載玻片上積水干燥后置于顯微鏡下觀察細菌形態(tài)、顏色。圖四12五、 數(shù)據(jù)分析1. 活菌數(shù)隨培養(yǎng)

13、時間的變化圖五12. 酶活力隨培養(yǎng)時間的變化圖五2分析：在前7.5h，酶活力一直在增大，在7.5h時達到最大酶活力。之后就開始成快速下滑階段，在7.5h到12h之間變化不算太大，這之間應該有段時間是處于穩(wěn)定期。3. 菌液濁度隨培養(yǎng)時間的變化圖五3分析：從上表可以看出，菌液濁度隨培養(yǎng)時間的變化在21h的時候濁度是最大的，說明此時菌數(shù)已經(jīng)達到了最大極限。之后在24h是下降趨勢，可能是菌體開始死亡自溶4. pH對提取的酶蛋白的變化圖五4分析：根據(jù)上表的折線圖，酶蛋白酶活力隨pH值得變大而增大，在pH4.0 時酶活力最小，在pH6.0時最大，在pH4.0到pH5.0時酶活力增大的趨勢比較明顯，在pH5.0到pH6.0時酶活力增大不是很明顯，說明這階段pH值對酶活力影響不是很大。六、 實驗總結通過這次實訓，我們對發(fā)酵流程有了一定的了解，由于時間的原因，我們的主要工程也放在了種子培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵上，在實訓中我們分工合作，對于我們個人的動手能力也有了一定的幫助。在實訓過程中，失敗在所難免，但在失敗中我們學會了分析總結，分析出問題的所在，找出解決問題的辦法，然后在重新進行這一步的實驗。這次實訓和我們平時的實驗完全不同，在平時的實驗中，都是老師說一步的做一步，完全跟著老師的安排走，沒有思考過每一步的原因及注意