分子發(fā)光分析論文(DOC)

1、HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY分子發(fā)光分析課程論文題 目 超分辨率熒光顯微成像技術(shù)研究進(jìn)展_Progress in Super-resolution FluorescenceMicroscopy Imaging Techniques姓 名金鑫學(xué) 號(hào) 2013310201019學(xué) 院 理學(xué)院專業(yè)班級(jí)應(yīng)化 1303中國(guó)武漢二一六年四月摘要2014 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了三位科學(xué)家，以表彰他們?cè)诔直媛薀晒怙@微成像技術(shù) 方面的重大貢獻(xiàn)。本文就這一技術(shù)的發(fā)展歷程進(jìn)行簡(jiǎn)要概述，并對(duì)于超分辨率熒光顯微 技術(shù)的發(fā)展前景進(jìn)行展望。關(guān)鍵詞 : 諾貝爾獎(jiǎng)，超分辨，顯微成像Abstr

2、actThe Nobel Prize in Chemistry was awarded to three scientists in 2014, in recognition of theirsignificant contribution to the super-resolution fluorescence microscopy imaging techniques. Inthis paper, a brief overview on the course of development of this technology, and prospects for thedevelopmen

3、t of super-resolution fluorescence microscopy techniques will be discussed.Key Words: Nobel Prize, Super-resolution, Microscopy imaging1緒論1.1 傳統(tǒng)的分辨?zhèn)鹘y(tǒng)的分辨可以定義為： 如果點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)較大， 那么對(duì)于兩個(gè)靠得很近的點(diǎn)， 則不 能分辨。在此基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)超分辨的方法可分為兩類：基于點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)調(diào)制的超分辨技 術(shù)，使得點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)變?。换陔S機(jī)單分子定位的超分辨技術(shù)，使得沒(méi)有靠得很近的兩 個(gè)點(diǎn)同時(shí)發(fā)光1。1.2 超分辨率簡(jiǎn)介基于點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)調(diào)制的超分辨技術(shù)的代

4、表為受激發(fā)射光淬滅（簡(jiǎn)稱 STED）技術(shù) 早在1994 年，此次獲獎(jiǎng)的羅馬尼亞裔德國(guó)科學(xué)家 Stefan W-Hell 最先提出了打破光學(xué)衍 射極限的構(gòu)思，并最終于 2000 年在實(shí)驗(yàn)上得以實(shí)現(xiàn)5。基于隨機(jī)單分子定位的超分辨技術(shù)的核心是，如果圖像上的點(diǎn)不是同時(shí)。亮起來(lái)，也就是不會(huì)有兩個(gè)靠得很近的點(diǎn)同時(shí)亮，就可以通過(guò)定位的方式實(shí)現(xiàn)超分辨。雖然一次 定位只能得到少數(shù)幾個(gè)分子，但是通過(guò)數(shù)千張圖片對(duì)數(shù)十萬(wàn)個(gè)單分子的定位，就可以獲 得一張高分辨率的圖像1。2熒光顯微鏡的發(fā)明歷程2.1 光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡自發(fā)明伊始，即與生命科學(xué)結(jié)下了不解之緣。 16 世紀(jì)末期，荷蘭眼鏡商Zaccharias Janss

5、en 和他的兒子把兩個(gè)凸透鏡放到一個(gè)鏡筒中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鏡筒能放大物 體，這就是顯微鏡的前身。隨后，荷蘭人 Anthony Von Leeuwen -hoek 通過(guò)精密研磨的玻 璃透鏡，首次將復(fù)式顯微鏡的分辨率提高到了 300 倍，并用它來(lái)觀察牙縫中的微生物 細(xì)菌。后來(lái)，英國(guó)實(shí)驗(yàn)科學(xué)家 Robert Hooke 對(duì)這一顯微鏡進(jìn)行了系統(tǒng)的改進(jìn)，用它 來(lái)觀察軟木塞的微小結(jié)構(gòu)。他看到了上面致密排列的小室，并將其命名為細(xì)胞，記錄在 他 1665 年創(chuàng)作的顯微鏡一書中1。2.2 電子顯微鏡1872 年，德國(guó)數(shù)學(xué)和物理學(xué)家 Ernst Abbe 根據(jù)光的波動(dòng)性，得出了以下結(jié)論：對(duì) 一個(gè)理想的發(fā)光點(diǎn)，在經(jīng)過(guò)顯微

6、鏡光學(xué)系統(tǒng)后，將是一個(gè)高斯型的艾里斑。由此可以想 到無(wú)論一個(gè)樣品結(jié)構(gòu)有多復(fù)雜，總是能夠描述為是由一個(gè)個(gè)點(diǎn)構(gòu)成的，因此，這個(gè)點(diǎn)的 像描述了光學(xué)系統(tǒng)的響應(yīng)函數(shù)，或者稱之為系統(tǒng)的分辨率。該函數(shù)即點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)1。通過(guò)阿貝公式2，很容易想到的是，縮短波長(zhǎng)即可產(chǎn)生更高的分辨率，比如利用 X 光，實(shí)際上電子的德布羅意波長(zhǎng)是光波的千分之一，是屬于 X 光的范疇。1986 年，電子 顯微鏡技術(shù)獲得了諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。2.3 光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡的不足光學(xué)顯微需要所看的對(duì)象“色彩斑斕”，而細(xì)胞一般是高度透明的。為了能夠看到 細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，人們發(fā)明了染色技術(shù)。最常用的染色技術(shù)一一HE 染色能夠利用 2 種染料對(duì)生物組

7、織進(jìn)行染色，目前仍是臨床采用的判定腫瘤良惡性的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，染色對(duì)于 觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍存在較大挑戰(zhàn)：染色是通過(guò)對(duì)光的直接吸收來(lái)產(chǎn)生的反差，也就是讓 細(xì)胞器有吸收，而周圍沒(méi)有吸收達(dá)到反差效果。光的吸收率可以用比爾定量描述，當(dāng)樣 品的厚度非常小時(shí)，吸收率幾乎為 0,這也就是薄樣品看上去幾乎透明的原因。電鏡使得過(guò)去不能夠看到的樣品細(xì)節(jié)能夠被清晰地展現(xiàn)。但是，電鏡卻有著復(fù)雜、 嚴(yán)苛的樣品制備過(guò)程，如切片、脫水、固定、鍍金等，這些均會(huì)破壞細(xì)胞的活性甚至改 變其原有的結(jié)構(gòu)。而且，電鏡只能看到細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，對(duì)于所觀察到的結(jié)構(gòu)的判斷，貝 U 需要其他技術(shù)輔助辨別。2.4 熒光染色傳統(tǒng)的染色是吸收 A 波長(zhǎng)，探

8、測(cè) A 波長(zhǎng)的吸收率。為了解決這一問(wèn)題，可以使系統(tǒng) 吸收 A波長(zhǎng)，探測(cè)從樣品染色上發(fā)出的B 波長(zhǎng)。這樣，僅在有“染色”的地方發(fā)光，沒(méi)有染色的地方是完全黑的，即熒光染色。1871 年，Johann Friedrich Wilhelm Adolf von Baeyer因合成熒光素獲 1905 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。在此基礎(chǔ)上，能夠特異性地標(biāo)記細(xì)胞中的不同細(xì)胞器的熒光染色技術(shù)應(yīng) 運(yùn)而生。2008 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的綠色熒光蛋白能夠通過(guò)外源性標(biāo)記或者內(nèi)源性轉(zhuǎn)基因的 方式選擇性地讓某一個(gè)感興趣的細(xì)胞器發(fā)熒光，將活體成像往前推進(jìn)了一大步o圖 1 HE 染色病理切片圖（a）與細(xì)胞熒光顯微圖（b）的對(duì)比2.5 超分辨

9、率熒光顯微技術(shù)前文提到，Hell 對(duì)于突破衍射極限的執(zhí)著追求造就了 STED 技術(shù)的問(wèn)世，而后引領(lǐng) 的 STED技術(shù)的發(fā)展和推廣熱潮成就了 STED 技術(shù)在超分辨成像領(lǐng)域的一席之地4o物理學(xué)出身的 Betzig 于 2006 年在Scienee雜志上發(fā)表文章正式提出了光激活定 位超分辨顯微鏡。PALM/STOR 均是通過(guò)對(duì)熒光分子的激活一定位一漂白三個(gè)步驟加之?dāng)?shù) 萬(wàn)次的循環(huán)最終重構(gòu)出超分辨圖像。相比于STED 技術(shù)，PALM/STOR 在實(shí)現(xiàn)上更簡(jiǎn)單且 成本更低，多色 PALM 成像、三維 PALM 成像、活細(xì)胞 PALM 成像以及厚樣本 PALM 成像相 繼誕生，并且在生物學(xué)研究中迅速普及開

10、來(lái)4。Moerner 教授雖然沒(méi)有直接提出超分辨成像的概念，卻是第一個(gè)觀察到單分子并對(duì) 單分子性質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)測(cè)量的科學(xué)家4。3展望超分辨顯微成像技術(shù)在問(wèn)世十多年之后便迅速獲得了諾貝爾獎(jiǎng)，足見(jiàn)其對(duì)化學(xué)領(lǐng)域 尤其是生物學(xué)領(lǐng)域的重大影響。時(shí)至今日，三大超分辨成像技術(shù)的理論基礎(chǔ)已比較完 備，但是其應(yīng)用范圍與普通共聚焦顯微鏡相比還有很大差距，因此此次諾貝爾獎(jiǎng)的頒發(fā) 勢(shì)必會(huì)引起更多化學(xué)家、生物學(xué)家的重視，將更多的科研興趣和研究重點(diǎn)投入超分辨顯 微成像技術(shù)上來(lái)。高昂的裝備和維護(hù)費(fèi)用也是影響超分辨成像技術(shù)推廣的重要制約因 素。因此如何進(jìn)一步降低超分辨率研究的成本及其推廣是目前人們需要關(guān)注的主要內(nèi) 容。參考文獻(xiàn)席

11、棚,孫有杰. 超分辨率熒光顯微技術(shù)解析 2014 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) J. 北京大學(xué)科技 導(dǎo)報(bào).2015.顧兆泰. 超分辨熒光壽命顯微方法及系統(tǒng) . 浙江大學(xué) D. 2013.1.紀(jì)偉,徐濤,劉貝. 光學(xué)超分辨熒光顯微成像 2014 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)解析 . 中國(guó)科學(xué)院 生物物理研究所 J. 2014.6.李帥. 超分辨熒光顯微方法與系統(tǒng)研究 . 浙江大學(xué) D. 2014.1.7.Hell S W, Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission:stimulated- emission- de

12、pletion fluorescence microscopyJ. Optics Letters, 1994, 19(11):780782.Willig K I, Kellner R R, Medda R, et al. Nanoscale resolution in GFP-based microscopyJ. NatureMethods, 2006, 3(9): 721-723課程心得本片文獻(xiàn)主要介紹的是熒光金納米粒子的發(fā)展歷史，從最早的黃金和薄銅的光致發(fā) 光一直到現(xiàn)代的各種粒徑的熒光納米金粒。人們合成了大量的多功能的熒光納米金粒，它們的熒光量子產(chǎn)率也在不斷提升。作者介紹了幾個(gè)重要的關(guān)于合

13、成納米金的實(shí)驗(yàn)，并 從納米金的粒徑、表面配體、 金屬原子的價(jià)態(tài)和納米顆粒的結(jié)晶度等等結(jié)構(gòu)因素， 分析 了它們對(duì)熒光納米金粒發(fā)光的影響，并且用幾個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以佐證。文獻(xiàn)中還根據(jù)各種 結(jié)構(gòu)因素對(duì)納米金熒光特性的影響還分析了可能的發(fā)光機(jī)理?？v觀文獻(xiàn)整體，由于是一片綜述類型的文章，深度不深但是涉及的面非常廣，要較 好的加以理解需要查閱不少相關(guān)資料。在文獻(xiàn)結(jié)尾處，作者說(shuō)明了在納米金微粒熒光機(jī) 理方面的廣闊前景。學(xué)生對(duì)于這一篇文獻(xiàn)的主要心得就是這個(gè)地方，實(shí)際上現(xiàn)在的化學(xué) 體系發(fā)展的已經(jīng)比較完整了，但是在一些前沿領(lǐng)域，尤其是微觀領(lǐng)域，雖有大量的實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)，但是對(duì)于機(jī)理方面是相對(duì)比較薄弱的，很多現(xiàn)象只知道該怎

14、么去做以及會(huì)成為什 么樣子，但是對(duì)于背后的機(jī)理還欠缺一些核心的理論支持，那么是不是去研究這些地方 就一定會(huì)有很好的發(fā)展前景呢？學(xué)生認(rèn)為是否定的，機(jī)理實(shí)際上就是大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所 遵循的潛在的某種規(guī)律，基本上只需要足夠多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，再加上一些運(yùn)氣的成分以及 能夠識(shí)破本質(zhì)的天分，發(fā)現(xiàn)機(jī)理的必然性就確定了，剩下的只是時(shí)間的問(wèn)題。所以沒(méi)有 必要去追求那個(gè)“空中樓閣”，該出來(lái)的時(shí)候就會(huì)出來(lái)了，畢竟這個(gè)世界上大部分的天 才都是依靠努力的。翻譯正文不同尺寸的熒光金納米粒子Jie Zheng, Chen Zhou, Mengxiao Yu and Jinbin Liu經(jīng)過(guò)十多年的努力，大量具有不同的尺寸和表面化

15、學(xué)性質(zhì)的高熒光金屬納米粒子已 被開發(fā)。熒光通常被認(rèn)為是受微粒大小的影響，至于其它的結(jié)構(gòu)因素，例如表面配體， 金屬原子的價(jià)態(tài)和納米顆粒的結(jié)晶度也會(huì)對(duì)熒光的特性與發(fā)光機(jī)制有重要的影響。在這 篇綜述中，我們總結(jié)了如何去制造從幾個(gè)原子到百萬(wàn)數(shù)量級(jí)原子數(shù)的熒光金納米粒子的 方法并討論了這些結(jié)構(gòu)因素是如何影響它們的光致發(fā)光。1. 引言在納米級(jí)尺寸下，金是一種很好的材料，它具有可調(diào)控的電子結(jié)構(gòu)和廣泛的材料特 性。毫無(wú)疑問(wèn)，納米金顆粒的表面等離子共振吸收是其最迷人的財(cái)產(chǎn)，本質(zhì)上它是由于 大量的自由電子在連續(xù)能帶中集體震蕩產(chǎn)生的，可以通過(guò)改變粒徑等結(jié)構(gòu)參數(shù)來(lái)進(jìn)行調(diào) 節(jié)。例如，對(duì)于粒徑大于光的波長(zhǎng)的納米金顆粒，其

16、頻率和表面等離子體的帶寬可以用 Mie 氏散射理論定量地描述。當(dāng)顆粒尺寸接近電子的平均自由路徑（對(duì)于金約為 50 納 米），粒徑的減少會(huì)導(dǎo)致表面等離子激元藍(lán)移，這仍然可以用改進(jìn)的 Mie 理論解釋。其 他的結(jié)構(gòu)參數(shù)，如形狀、聚集度、組成和表面粗糙度也顯著影響表面等離子體及其相關(guān) 性質(zhì)，如表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）和光熱轉(zhuǎn)換等。許多優(yōu)秀的評(píng)論將幫助讀者全面了 解這些知名納米金的等離子體特性。在這篇綜述中，我們專注于金納米粒子的熒光特性，這比表面等離子激元更難理 解。經(jīng)過(guò)十年的努力，發(fā)光金屬納米粒子已成為一類新興的金屬納米結(jié)構(gòu)。新的不同大 小，高量子產(chǎn)率的發(fā)光金納米粒子的合成方法已經(jīng)得到了發(fā)展，

17、部分發(fā)光機(jī)制已經(jīng)被闡 明，多種納米金粒子的應(yīng)用已被展示。尺寸為 0.3 到 20 納米的熒光納米金粒子可以通過(guò) 調(diào)諧不同的結(jié)構(gòu)參數(shù)，如粒度，表面配體，價(jià)態(tài)和晶粒尺寸來(lái)合成，有必要總結(jié)這些因 素是如何影響發(fā)光性能和機(jī)制的，這可能有助于發(fā)光金屬納米粒子的應(yīng)用和未來(lái)的發(fā) 展。發(fā)光金納米粒子已在過(guò)去的十年里被深入的研究，金的發(fā)光觀察最早可追溯到 1969 年。Mooradia 用 488 納米的激光激發(fā)黃金和銅的薄膜，分別在 564 和 620 納米處觀察到 光致發(fā)光。由于黃金或銅膜具有連續(xù)導(dǎo)通的能帶結(jié)構(gòu)，觀察到的量化轉(zhuǎn)換（發(fā)光）并不 是因?yàn)閹?nèi)躍遷而是由于帶間躍遷產(chǎn)生的。圖一是是首次被提出的能夠解釋

18、金和其它金 屬薄膜的光致發(fā)光的光學(xué)機(jī)制，這個(gè)輻射機(jī)制產(chǎn)生于 D 帶上有空穴的費(fèi)米能級(jí)上的電子 重組。在觀察金屬的光致發(fā)光時(shí)，具有一個(gè)非常大的態(tài)密度和大量的自由電子的系統(tǒng)相 比傳統(tǒng)的已知的熒光基團(tuán)是相當(dāng)不尋常的，在這項(xiàng)工作發(fā)表后的前20 年里，很少有人注意這一領(lǐng)域。部分原因是由于量子產(chǎn)率僅10-10，對(duì)于詳細(xì)理解和實(shí)際應(yīng)用金屬輻射來(lái)說(shuō) 太小了。在 1986 年，由于在對(duì)金屬薄膜的表面增強(qiáng)拉曼光譜研究中不斷發(fā)現(xiàn)了一個(gè)持續(xù) 的背景輻射，人們又開始注意到金屬薄膜的光致發(fā)光。博伊德等發(fā)現(xiàn)金膜發(fā)光的范圍為 400 至 653 納米，輻射的最大值決定于激發(fā)波長(zhǎng)和膜粗糙度。由于當(dāng)?shù)氐膱?chǎng)效應(yīng)，表面粗 糙度可以提

19、高光致發(fā)光強(qiáng)度至高達(dá) 6 倍。這項(xiàng)研究進(jìn)一步表明，金薄膜發(fā)光是由于在 D 帶有空穴的費(fèi)米能級(jí)下面的電子復(fù)合直接輻射導(dǎo)致的。方案 1 貴重金屬的能帶結(jié)構(gòu)的示意圖，如圖示出了電子激發(fā)和復(fù)合躍遷。發(fā)光的不僅是觀察到的金膜，也包括小的納米金結(jié)構(gòu)。在1998 年，Wilcoxon 等在440 納米處觀察到尺寸小 5 納米的納米金粒子有比較強(qiáng)烈的藍(lán)色輻射。那些發(fā)藍(lán)光的金納 米粒子是通過(guò) KCN 蝕刻制造的，其發(fā)射量子產(chǎn)率為io-5大約比散裝金高105倍。然而究竟 是什么在發(fā)光仍舊不清楚。2000 年，穆罕默德等在波長(zhǎng)為 560 納米處觀察到的金納米棒 比散裝金的量子產(chǎn)率高一百萬(wàn)倍。有趣的是，量子產(chǎn)率隨著勵(lì)

20、磁功率增加而二次增長(zhǎng)， 最大波長(zhǎng)線性的增長(zhǎng)。這些小金納米粒子和金納米棒的發(fā)光也是由于電子和空穴的帶間 重組的過(guò)程而產(chǎn)生的，其通過(guò)表面等離子體進(jìn)一步增強(qiáng)。金納米結(jié)構(gòu)熒光量子產(chǎn)率的增加歸因于上述研究的局部電場(chǎng)增強(qiáng)效應(yīng)，一些額外的 報(bào)告表明，非常小的納米金的熒光顯示表面等離子體可能不是高量子產(chǎn)率發(fā)光的必不可 少的金納米結(jié)構(gòu)。2000 年，維特和他的同事報(bào)道了在 1.1 到 1.7 納米的近紅外發(fā)光區(qū)的金 納米粒子，量子產(chǎn)率達(dá)（4.4 5）入0-5。2001 年，黃和 Murray 用 1.7 納米的金納米粒子觀 察在 770 納米處的熒光量子產(chǎn)率為 3X10-3， Link 小組觀察在 770 納米

21、處 Au28納米簇 （注 釋： 在后來(lái)的研究中已用 AU25校正）的熒光量子產(chǎn)率為 210-3，這比金膜的熒光量子產(chǎn) 率高出107倍。由于這些非常小的納米金開始像分子并沒(méi)有表現(xiàn)出表面等離子體特性，局 域場(chǎng)增強(qiáng)效應(yīng)不再參與所觀察到的高量子熒光產(chǎn)率。人們進(jìn)一步提出假說(shuō)，認(rèn)為金團(tuán)簇 分子的發(fā)光不僅能夠產(chǎn)生以前就知道的帶內(nèi)躍遷，也能產(chǎn)生帶間躍遷。這些研究是現(xiàn)在 對(duì)金納米粒子熒光的基礎(chǔ)。在過(guò)去的十年中，大量的尺寸從 0.3到 20 納米的高熒光金（對(duì)應(yīng)于從幾十到數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的原子金原子數(shù)）已被合成，發(fā)光機(jī)制的基本認(rèn)知也有了 很大的進(jìn)步。在此，我們通過(guò)強(qiáng)調(diào)影響發(fā)光性能和發(fā)射機(jī)制的因素總結(jié)了這一領(lǐng)域的進(jìn) 展。

22、已從非等離子和等離子納米金上均觀察到了發(fā)光，發(fā)光源可分為分子發(fā)光金納米粒 子和等離子體金納米粒子。對(duì)于分子的金納米粒子，我們可以進(jìn)一步分為兩類：少原子的金納米團(tuán)簇和幾納米的金納米粒子。粒子大小、表面配體、價(jià)態(tài)和晶粒尺寸都對(duì)金納米 粒子的發(fā)光性能有顯著的影響。2.幾個(gè)原子發(fā)光的熒光單一的金納米粒子的電子結(jié)構(gòu)是依賴于它的顆粒大小。當(dāng)粒子的尺寸變得可以媲美 金電子的費(fèi)米波長(zhǎng)（0.5 納米）時(shí)，納米顆粒的連續(xù)能帶結(jié)構(gòu)分解成離散的能量狀態(tài)，因 此，金納米粒子表現(xiàn)的像分子。在這個(gè)非常小的規(guī)模上，金納米粒子通常被稱為納米團(tuán) 簇（NCS）。在 1987年，金納米粒子被發(fā)現(xiàn)在低溫，氣體介質(zhì)中發(fā)光。Harbich 和同事們制造了被植入氬介質(zhì)的發(fā)光的 AU2和 AU3。雖然這些研究清楚地表明了金納米粒子的大 小與發(fā)光有關(guān)，但是其具體的定量關(guān)系仍舊不明確