血培養(yǎng)檢測規(guī)范化操作

1、摘自：血培養(yǎng)檢測規(guī)范化操作主編：徐英春、倪語星、王金良，上?？茖W技術出版社來源：微生物之家一、血培養(yǎng)檢測 采血指征：對入院的危重患者未進行系統(tǒng)性抗生素治療前，應及時進行血液培養(yǎng)，患者出現(xiàn)以下體征時可作為采集血培養(yǎng)的重要指征：1 發(fā)熱（38）或低溫（36）。2 寒戰(zhàn)。3 白細胞增多（>10×10 9/L，特別有“核左移”未成熟的或帶狀的白細胞增多。4 粒細胞減少（成熟的多核白細胞<1×10 9/L）。5 血小板減少。6 皮膚粘膜出血。7 昏迷。8 多器官衰竭?；蛲瑫r具備上述幾種體征時應采血培養(yǎng)。在評估可疑新生兒敗血癥時，除發(fā)熱或低燒外，很少培養(yǎng)出細菌，應該補充尿液

2、和腦脊液培養(yǎng)。肺炎鏈球菌與流感嗜血桿菌菌血癥的患兒（特別是2歲以下的幼兒）一般多見于門診，常伴有明顯發(fā)熱（38.5）和白細胞增多（20×109/L）。老年菌血癥患者，可能不發(fā)熱或不低熱，如伴有身體不適，肌痛或中風可能是感染性心內膜炎的重要指征。血培養(yǎng)檢測 皮膚消毒程序：血培養(yǎng)為防止皮膚寄生菌污染，可使用消毒劑（碘酊或碘伏）對皮膚進行嚴格仔細的消毒處理，最大限度地減低皮膚污染。感染性心內膜炎，特別是心臟瓣膜修復術的感染，可能由皮膚寄生的微生物引起（例如：表皮葡萄球菌或棒桿菌屬）。因此，在采集過程中血培養(yǎng)的污染一定要減小至最低程度。用做培養(yǎng)的血液均不應該在靜脈或動脈的導管中抽取，除非靜脈

3、穿刺無法得到血液或用來評價與導管感染相關性指標。如果抽取了導管血，也應同時在其他部位穿刺獲取非導管內靜脈血液進行血培養(yǎng)。皮膚消毒嚴格按以下步驟進行：1 首先用70%酒精擦拭靜脈穿刺部位待30秒鐘以上。2 然后用一根碘酊或碘伏棉簽消毒皮膚（1%-2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒），從穿刺點向外以1.5cm2cm直徑畫圈進行消毒。3 最后用70%酒精脫碘。嚴格執(zhí)行三步消毒后，可行靜脈穿刺采血。注意對碘過敏的患者，只能用70%酒精消毒，消毒60秒鐘，待穿刺部位酒精揮發(fā)干燥后穿刺采血。血培養(yǎng)檢測 培養(yǎng)瓶消毒程序：1 用70%酒精或碘溶液（不要使用碘）消毒血培養(yǎng)瓶橡皮塞子。2 酒精作用待60秒。3

4、在血液注入血培養(yǎng)瓶之前，用無菌紗布清除橡皮塞子表面剩余的酒精，然后注入血液。要點：血培養(yǎng)的關鍵是防止皮膚寄生菌或環(huán)境引起的污染，由污染菌引起的假陽性增加了患者抗生素的使用量，延長了住院日，延誤病情診斷并增加了經濟負擔等。然而，在理想的消毒條件下，仍有3%5%血培養(yǎng)中混有污染菌，它們來源于皮膚（表皮葡萄球菌，痤瘡丙酸桿菌，梭桿菌屬，類白喉群）或來源于環(huán)境（革蘭陽性芽孢桿菌屬，不動桿菌屬），這些微生物有時有致病作用。對兩次不同部位血培養(yǎng)生長同一種微生物，不同類無菌部位標本培養(yǎng)中生長同一種微生物，微生物快速生長（48h內）。上述情況下，應考慮是真正的感染。臨床實驗室工作人員和醫(yī)生之間應經常討論血培養(yǎng)

5、結果，建立良好的交流關系對各方面都有益處。例如查病例回顧性調查分析：19951999年血中分離的70例凝固酶陰性葡萄球菌，入院48h內檢出者，39.3%（24例）為污染菌，48h后檢出者（9例）100%為污染菌，污染菌檢出時間顯著長于病原菌。提示血培養(yǎng)中凝固酶陰性葡萄球菌污染率較高。因此，采血前嚴格執(zhí)行皮膚消毒程序非常重要。血培養(yǎng)檢測 采血量：對從菌血癥或真菌菌血癥患者血培養(yǎng)中獲得微生物，每個培養(yǎng)瓶抽取的血量是唯一重要的變量。當培養(yǎng)的血量從2ml增加到20ml時，血培養(yǎng)的陽性率增加30%50%，因為培養(yǎng)的血液量增加1ml，陽性率增加3%5%。用靜脈穿刺獲得的血量，成人和兒童不同。兒童，特別是新

6、生兒很難獲得大量的血液，對嬰幼兒和兒童，一般靜脈采血1ml5ml用于血培養(yǎng)，當細菌濃度足夠高時，血液少于1ml也足以檢測菌血癥。標本量大于1ml，細菌量也增加，對于感染的兒童沒毫升血液比成人有更多的微生物。對于成人血培養(yǎng)的標本量少于10 ml不易培養(yǎng)出細菌，每瓶最低限量應是10ml血液，20ml30ml最合適，血液和肉湯的比一般推薦為1:5至1:10。幾乎所有現(xiàn)代的血培養(yǎng)系統(tǒng)假如血液量均在10ml以上。雖然靜脈采血30ml可增加細菌量，但這不太切合實際，這很容易造成醫(yī)院獲得性貧血。血培養(yǎng)的數(shù)量和采血時間：血培養(yǎng)的數(shù)量和采血時間關系到菌血癥的病理生理學，一次靜脈采血注入到多個培養(yǎng)瓶中應視為單次血

7、培養(yǎng)。研究已經證實，采集適量的血液注入23瓶血培養(yǎng)瓶中足以檢測所有的菌血癥和真菌菌血癥。對間歇性菌血癥，用于培養(yǎng)的血液應在估計寒戰(zhàn)或體溫高峰到來之前采集，因為細菌流入血液與寒戰(zhàn)發(fā)作通常間隔1h，在發(fā)燒時血液可能沒有細菌，實際上，血培養(yǎng)通常是在寒戰(zhàn)或發(fā)燒后進行。由于細菌很快會從血液中清除，因此，在寒戰(zhàn)或發(fā)燒后應盡快抽取血培養(yǎng)。正是由于這個原因，我們一般不推薦在任意時間抽取靜脈血進行培養(yǎng)，研究資料表明任意時間采血并不能提高微生物的檢出率。實際上已經證明在24h內同一時間或任意時間抽血培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)微生物的結果相似。無論何時，采集血培養(yǎng)應該在使用抗生素之前進行，推薦同時采集23瓶，每瓶20ml30ml血樣

8、進行培養(yǎng)來做最初的平谷，這也更切合實際。先前餓抗生素治療可能導致血培養(yǎng)結果陰性，微生物延遲生長更為常見。有研究證實，對鏈球菌心內膜炎患者，在做血培養(yǎng)的前兩周內患者接受了抗生素治療，血培養(yǎng)的陽性率從97%下降到91%。由于有很好的血培養(yǎng)技術，對感染性心內膜炎患者血培養(yǎng)的陽性率應該達到95%以上。對特殊的全身性和局部感染患者采集血培養(yǎng)的建議：1 懷疑記性原發(fā)性菌血癥、真菌菌血癥、腦膜炎、骨髓炎、關節(jié)炎或肺炎的患者：應立即采集2或3份血培養(yǎng)瓶，快速進行血培養(yǎng)。2 不明病源的發(fā)熱，如隱性膿腫，傷寒熱和波浪熱：發(fā)熱開始采集2或3份血培養(yǎng)。24h至36h后，估計溫度升高之前（通常在下午）立即采集2份以上血

9、培養(yǎng)。3 懷疑菌血癥或真菌菌血癥，血培養(yǎng)結果持續(xù)陰性，應改變學培養(yǎng)方法，以便獲得罕見的或苛養(yǎng)的微生物。4 感染性心內膜炎，對急性心內膜炎患者1h（2h內）采集3份血培養(yǎng)，如果所有結果24h后陰性，再采集3份血培養(yǎng)瓶。入院前兩周內接受抗生素治療的患者，連續(xù)三天采集血培養(yǎng)，每天2份。要點：大部分臨床醫(yī)生對成年患者采集血量不足，采集血培養(yǎng)份數(shù)不夠，采血時機不合適，通常在患者體溫高熱時，24h內采集一瓶血培養(yǎng)，降低了血培養(yǎng)的陽性率，不符合才學的基本規(guī)程，實驗室應該做大量宣傳溝通工作。血培養(yǎng)檢測 運輸標準：采血后血培養(yǎng)瓶或采集管應立即送到臨床微生物實驗室。血培養(yǎng)瓶和采集管短期內置于室溫不影響細菌檢出，不

10、要冷藏，如果血培養(yǎng)瓶在送往實驗室培養(yǎng)或自動化儀器檢測之前不得已需放置一段時間，應置于3537孵箱中。但含血液的采集管不應置于孵箱中，若有細菌生長會釋放出一些氣體，采集管有破裂或滲漏的危險。實驗室收到血培養(yǎng)瓶后立即進行肉眼觀察微生物生長情況。采用自動化連續(xù)檢測血培養(yǎng)系統(tǒng)，有一點很讓人憂慮，那就是標本運送有時被延誤，這樣會導致微生物檢測延遲（盡管微生物生長不受影響），目前很少有人注重這一點。盡管自動化連續(xù)檢測系統(tǒng)有允許延遲上瓶檢測微生物生長的原理，培養(yǎng)瓶在運送過程中還應盡量減少延遲。血培養(yǎng)檢測接受標準：實驗室收到血培養(yǎng)后，應按以下步驟操作：1 檢查培養(yǎng)瓶確保它們被安全地放置。2 用肉眼觀查微生物生

11、長的情況，注意血液層上面是否有絮狀沉淀、均勻的或表面下的渾濁、溶血、液體培養(yǎng)基凝固、有一層表面薄膜、產生氣體、血層表面或深層有白色顆粒等，如有上述情況產生提示有微生物生長。3 檢查瓶子上的標簽，確認資料是否齊全，與申請單上的患者資料是否一致。4 保證獲得適量的血液。5 檢查血液是否超過要求的基線。6 放置在孵箱中或上機進行檢測。由于菌血癥和真菌菌血癥的檢測對臨床感染性基本的診斷十分重要，實驗室工作人員應認真接收血標本，對兒童和承認，不管抽血量多少，均應該進行培養(yǎng)并在報告單上注明血量，有可能延誤菌血癥或真菌菌血癥的檢測。血培養(yǎng)檢測不規(guī)范處理方法：送到實驗室的血標本應認真處理，減少標本錯誤和標本污

12、染。標本處理不當及不正確采集，醫(yī)院及實驗室工作人員本身攜帶的病菌均可能造成標本污染。因此，建議發(fā)生下列不規(guī)范的血培養(yǎng)時應該及時處理。1. 血培養(yǎng)或培養(yǎng)管無標簽或貼錯標簽、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)管有滲漏、破裂或明顯的污染、血標本采集后放置12h以上、用不適當?shù)呐囵B(yǎng)瓶或培養(yǎng)管收集標本。處理方法：立即與臨床醫(yī)師聯(lián)系，報告：“標本不規(guī)范的具體理由”。2. 用失效的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)管收集標本。處理方法：與醫(yī)生聯(lián)系，報告：“用過期培養(yǎng)瓶收集血標本，請用效期內的培養(yǎng)瓶收集標本并送檢。3. 送交血標本的量不足或只送一瓶血培養(yǎng)。處理方法：與醫(yī)生聯(lián)系，報告：“送交的血培養(yǎng)標本量不足，請補送足量血液培養(yǎng)瓶”。4. 未送推薦的培養(yǎng)

13、瓶數(shù)或類型處理方法：與醫(yī)生聯(lián)系，報告：如“只送需氧瓶不符合規(guī)程，血培養(yǎng)的基本規(guī)程推薦送兩種培養(yǎng)瓶：需氧瓶和厭氧瓶”。要點：每位臨床醫(yī)師都應該對患者負責任，實驗室工作人員發(fā)現(xiàn)不規(guī)范的血標本后，應該即使同志臨床醫(yī)生以便重復采集血培養(yǎng)進行補救。血培養(yǎng)檢測 微生物室處理血培養(yǎng)預防感染的安全程序：1 細菌室工作人員，在所有的血培養(yǎng)處理過程中都應戴乳膠手套。2 拒收不符合安全標準的血培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)管。3 在生物安全柜內打開或穿刺培養(yǎng)瓶或家一個膠膜防護裝置（如：把培養(yǎng)瓶置于丙烯酸酯膜后或戴上口面罩）。4 在生物安全柜內操作肉眼觀察有微生物生長跡象的培養(yǎng)瓶。5 操作產生的氣溶膠，可能含有高濃度的致病菌或真菌，利

14、用實驗室的方法和技術采取正確的自我保護措施。6 用于培養(yǎng)基的塞子和膠帶可能含有高濃度的致病菌，應防止接觸。7 正確處理與血培養(yǎng)有關的污染物。8 立即報告血培養(yǎng)結果及抗生素敏感試驗結果。血培養(yǎng)檢測陽性結果的處理：傳統(tǒng)手工法血培養(yǎng)應該每天至少檢查一次，對48h72h未生長的培養(yǎng)瓶至少應進行需氧傳種培養(yǎng)一次。對培養(yǎng)瓶進行肉眼檢查，注意下列幾點提示有微生物生長：1 血與肉湯混合物出現(xiàn)渾濁。2 在血液層上有絮狀沉淀，某些鏈球菌在沉積的紅細胞表面上，會有小的“棉球樣”生長。3 肉湯內出現(xiàn)渾濁生長。4 肉湯表面有薄膜生長。5 出現(xiàn)溶血。6 產生氣體，許多發(fā)酵菌可產氣，梭菌屬會產生大量的氣體，出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)

15、象。7 血液層表面或深層有白色顆粒。8 液體培養(yǎng)基凝固。如果懷疑血培養(yǎng)陽性，應立即進行革蘭染色，以無菌手續(xù)從培養(yǎng)瓶中取肉湯23滴涂片，自然干燥，加熱固定并染色。染色結果應盡快報告，如革蘭陽性球菌為成對或成堆或成鏈，革蘭陰性桿菌為小桿菌或球桿菌等。革蘭染色結果可指導醫(yī)生為患者經驗選擇抗生素治療，并作為實驗室進行細菌鑒定補充試驗的參考依據(jù)，它對于鑒別葡萄球菌和鏈球菌非常有用。如果血培養(yǎng)陽性革蘭染色未發(fā)現(xiàn)細菌，應做吖啶橙染色進行二次鏡檢，這對檢測彎曲菌菌血癥和布魯菌菌血癥很有幫助，而革蘭染色很少發(fā)現(xiàn)這些細菌。依據(jù)細菌革蘭染色形態(tài)特點，選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基傳種，見表1。表1。 血培養(yǎng)陽性后根據(jù)革蘭染色特點

16、應傳種培養(yǎng)基種類的建議染色特點 5%10%CO2孵育 厭氧氣體孵育?血瓊脂 巧克力瓊脂 中國蘭或麥康凱或EMB 血瓊脂 PEA或CAN革蘭陽性球菌 × × ×桿菌 × × ×革蘭陰性球菌 × × × ×桿菌 × × × × ×真菌b × ×持續(xù)檢測陽性 × × ×革蘭染色陰性c所有培養(yǎng)至少至48h；EMB；伊紅美藍瓊脂；PEA；苯乙基醇瓊脂；CAN；多粘菌素-萘啶酮酸瓊脂。增加真菌培養(yǎng)基（如：沙保

17、弱葡萄糖瓊脂）和30培養(yǎng)。接種硫羥乙酸鹽肉湯中。當革蘭染色顯示細菌形態(tài)均一時，厭氧培養(yǎng)的價值不大。對所有培養(yǎng)陽性，革蘭染色陰性的血培養(yǎng)瓶，再次上機檢測之前都應傳種厭氧和需氧培養(yǎng)皿。革蘭染色為純的細菌，可進行初步鑒定并做直接抗生素藥敏試驗的標準程序，而且沒有經FDA批準的市售產品。可用于初步鑒定的商品試劑，包括：膽汁溶解，DNA酶，乳膠凝集分型實驗等。美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）推薦的抗生素敏感試驗沒有血培養(yǎng)直接敏感試驗法。然而，許多學者提出：根據(jù)革蘭染色初步分析鑒定，可以靈活地選擇抗生素進行直接抗生素藥敏試驗。對各種血培養(yǎng)法中的陽性肉湯培養(yǎng)物進行傳種并且立即孵育培養(yǎng)，為進一步試驗用

18、，傳種5h-7h后有明顯的菌落生長，取瓊脂表面的菌落用于細菌鑒定和抗生素敏感試驗。使用含固體培養(yǎng)基的血培養(yǎng)系統(tǒng)，如：雙相法，有菌落生長可直接進行細菌鑒定和標準的抗生素敏感試驗。盡管現(xiàn)在使用探針雜交和DNA擴增技術可以鑒定血培養(yǎng)中的細菌和檢測抗生素敏感性，但這種技術不實用，價格昂貴，F(xiàn)DA不推薦常規(guī)使用。血培養(yǎng)分離的細菌，萬一需要進一步的研究，至少保存幾個星期。為了讓細菌活著，兼性需氧菌和兼性厭氧菌應傳種到半固體培養(yǎng)基中，例如動力培養(yǎng)基。嚴格厭氧菌應保存到無葡萄糖的肉湯培養(yǎng)基或冷凍在兔血或脫脂牛奶培養(yǎng)基中?？吗B(yǎng)菌可以接種到巧克力瓊脂斜面上并用礦物油封存。為長期儲存，細菌可懸浮于15%甘油肉湯中并-70冷凍。血培