從組織器官分離細(xì)胞

1、從組織器官分離細(xì)胞一、非酶分離細(xì)胞方法(一) 機(jī)械分離法 適用于較柔軟的組織，如腦、肝、脾、淋巴結(jié)、 胸腺、胚胎組織、腫瘤組織等。1. 組織研磨法：操作方法：(1) 取消毒的碟皿(直徑58cm或略大)，放入少許Hanks液或PBS;(2) 將采取的小塊組織先用PBS漂洗去組織表面的血污，剪成撕去附帶的其它組織，如脂肪或多余的纖維、包膜等，切成5mm左右大小的小塊，放入碟皿內(nèi) Hanks液或PBS中；(3) 用鋒利手術(shù)刀或眼科剪將組織剪切成 1mm左右的碎組織塊；(4) 將碎組織及Hanks液或PBS置于較松的組織研磨勻漿器內(nèi)， 用手緩慢研磨(可反復(fù)幾次)，形成散在細(xì)胞的勻漿。(5) 將組織勻漿

2、經(jīng)40目或100目不銹鋼網(wǎng)過濾去除纖維組織、血 管及較大的凝塊。過濾時(shí)可用 Hanks液或PBS沖中洗；(6) 將過濾的細(xì)胞勻漿懸液直立靜置片刻使較大的組織塊及紅細(xì)胞先沉淀，取上部細(xì)胞懸液，以Hanks液或PBS洗滌，離心，收集細(xì) 胞；(7) 計(jì)算活細(xì)胞率，計(jì)數(shù)細(xì)胞，制備成所需濃度的細(xì)胞懸液。注意：組織研磨勻漿器不能太緊，研磨時(shí)應(yīng)緩慢，否則易使細(xì)胞 損傷、破碎、或增高死亡細(xì)胞率。2. 不銹鋼網(wǎng)擠壓法：操作方法：(1) 將切取的組織塊以PBS漂洗去表面血污，切成510mm啲組 織塊;(2) 在消毒碟皿內(nèi)放少許 Hanks液或PBS把40目100目的不 銹鋼網(wǎng)放入Hanks液或PBS中，將組織塊置

3、網(wǎng)上，用消毒注射器芯或 試管的底端輕輕壓擠組織，使其穿過網(wǎng)眼入Hanks液或PBS中。同時(shí)， 用Hanks液或PBS沖洗網(wǎng)上的組織。最后，將網(wǎng)上剩余的纖維包膜或 血管等棄去 ;(3) 收集Hanks液或PBS液中的細(xì)胞懸液顯微鏡檢查，如仍有較 多的小組織塊，可用更細(xì)的不銹鋼網(wǎng)(20卩m)重復(fù)壓擠1次；(4) 收集Hanks液或PBS細(xì)胞懸液。1000r/min離心片刻使殘留 較大組織碎塊及紅細(xì)胞沉淀，吸取未沉淀的細(xì)胞懸液。再以Hanks液 或PBS洗滌，離心，收集1次；(5) 計(jì)數(shù)活細(xì)胞率及計(jì)算細(xì)胞數(shù)，制備所需濃度的細(xì)胞懸液。 注意：如經(jīng) 1 次壓擠尚有較多的碎組織塊，也可用消毒注射器，帶 6

4、 號(hào)注射針頭， 將細(xì)胞及碎組織從注射器內(nèi)經(jīng)針頭壓出， 使細(xì)胞再 次分散。3. 吹打分離法： 此法只適用于很松軟的組織， 如從腦組織分離膠 質(zhì)細(xì)胞。操作方法：(1) 取小塊腦組織，剝離腦膜，血管等纖維組織后，用 Hanks 液 漂洗 2 次;(2) 在消毒碟皿中放約2 3倍于腦組織的Hanks液，將腦組織置 Hanks液中，用滴管吸取Hanks液反復(fù)吹打腦組織使成懸液；(3) 將組織懸液經(jīng) 40 目尼龍網(wǎng)過濾后，移入試管中直立靜放 510 分鐘，較大的組織碎塊及紅細(xì)胞下沉，脂肪及碎細(xì)胞片等漂浮在 液體上部。吸取中間部分的細(xì)胞懸液，并如此反復(fù)23次；(4) 取少許細(xì)胞懸液顯微鏡檢查， 如已制成較多

5、的散在細(xì)胞懸液， 可計(jì)數(shù)活細(xì)胞率。計(jì)數(shù)細(xì)胞用Hanks液或適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液制備成所需濃 度的細(xì)胞懸液。(二) EDTA分離法 EDTA(ethyle nediami netetraaceticacid) , 是一種螯合劑(chelatingagent)，能與組織內(nèi)的Ca2+ Mg2離子螯 合而使細(xì)胞分離。EDTA常用PBS等配成0.02%的工作液。其作用溫和，在一般情況 下對(duì)細(xì)胞損傷較小， 但分離效果并不很高。 可用于分離一些胚胎組織 或肝臟灌流，不過較少單獨(dú)使用，常和其它一些酶 (如 0.25%胰蛋白 酶)混合使用(以1 : 1或2 : 1混合)；但不要與膠原酶混合使用，因這 種酶依賴Ca2+和

6、Mg2+與EDTA昆合后可使膠原酶的消化作用嚴(yán)重障 礙或失效。 與胰蛋白酶混合可用于分離培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 其方 法是將培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液吸去后，加入 0.02%EDTA< 0.25%胰蛋白酶 的混合液，以蓋滿細(xì)胞為度，處理 310分鐘，注意不能消化過度使 細(xì)胞收縮脫落。吸出消化液，立即用Hanks液洗滌23次以洗去EDTA 最后加入培養(yǎng)液，用滴管吹打使細(xì)胞脫落形成細(xì)胞懸液。使用EDTA應(yīng)注意分離時(shí)間不能過長。因其對(duì)細(xì)胞的線粒體可有 損傷，而且細(xì)胞長時(shí)間處于無 Ca2+環(huán)境下(被EDTA螯合)則可使細(xì)胞 內(nèi)K+降低;同時(shí)呼吸減弱也可造成細(xì)胞損害。(三) 其他非酶分離細(xì)胞方法甘氨酸(gl

7、ycine)也可用于分離細(xì)胞，如用含1mol/L甘氨酸與2mol/LEDTA的混合液分離海膽胚胎。雙 糖(disaccharides)，如高張蔗糖、乳糖、麥芽糖等(常用0.5mol/L) 可分離細(xì)胞間的縫隙連接或緊密連接等。0.5%KOH勺稀堿溶液(pH9.3 左右)也可用于胚胎組織的分離。但如將pH恢復(fù)正常，則分散的細(xì)胞 又可再聚合。二、酶分離細(xì)胞技術(shù)可用于分離細(xì)胞的酶很多。蛋白水解酶類有胰蛋白酶(trypsin)、 膠原酶(collagenases)、彈性蛋白酶(elastase)、鏈霉蛋白酶 (pronase)、溶菌酶(lysozyme)、木瓜蛋白酶(papain)等。其它酶類 有透明質(zhì)

8、酸酶(hyaluronidase)，脫氧核糖核酸酶(deoxyribo nuclease)等。這些酶各有優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞的損傷也各不 相同，所以對(duì)使用何種酶應(yīng)按實(shí)驗(yàn)要求加以選擇。比較常用的有胰蛋 白酶、膠原酶、鏈霉蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等。胰蛋白酶適于消化間質(zhì)較少的組織，如胚胎組織、羊膜、上皮、 肝、腎等;對(duì)纖維性組織的消化能力較差。Ca2+ Mg2+寸其活性有抑 制作用，故配制時(shí)應(yīng)不含Ca2+或 Mg2+或與EDTA配伍使用。胰蛋白 酶的工作濃度為0.01%0.5%,常配成0.25%的工作液。室溫及37C 下消化比較恰當(dāng)，4C時(shí)仍有緩慢的消化作用。最適工作 pH為89 左右。消化時(shí)間最短（如胚胎組

9、織）為2030分鐘，一般為3060分 鐘，低溫或低濃度時(shí)也可延長至 1218小時(shí)（過夜）。膠原酶適用于消化分離纖維組織，對(duì)上皮、肝、胰、腎及一些癌 組織的細(xì)胞分離也比較適用。它有很多類型，Sigma廠的產(chǎn)品有1V、忸、幻等型，分別適用于分離肝細(xì)胞、胰島、脂肪細(xì)胞或一 般纖維組織，應(yīng)按實(shí)驗(yàn)要求，按產(chǎn)品說明書選用。膠原酶與胰蛋白酶 不同，它必須在Ca2+及 Mg2+存在的條件下，才能較好地活化。常用 的濃度為100200U/ml（按說明書配制。一般產(chǎn)品&gt;125U/mg，故 工作濃度常用0.05%0.1%，高純度膠原酶可為&gt;1200U/mg或 10003000U/mg）。

10、該酶的作用緩慢，常需較長的消化時(shí)間。鏈霉蛋白酶為非特異性具有廣譜性質(zhì)的中性蛋白酶， 適于分離消 化道的粘膜上皮細(xì)胞及肝臟的 Kupffer細(xì)胞。其消化速度比胰蛋白酶 快。分離的消化道上皮存活率可高達(dá) 96%r右，較其它酶優(yōu)越。透明質(zhì)酸酶對(duì)間質(zhì)中含多量透明質(zhì)酸的組織比較適用，對(duì)熱穩(wěn) 定，工作pH較寬，常可與其它酶配合使用以增加消化分離細(xì)胞的效 果。（一）胰蛋白酶消化分離細(xì)胞方法操作方法：1. 在消毒碟皿中將組織剪切成 35mm左右的碎組織塊；2. 在小燒杯內(nèi)放入3050倍的0.25%胰蛋白酶，加入剪切碎的組織，在37C水浴或溫箱中消化3060分鐘，每隔5分鐘左右搖蕩1次（ 用電磁攪拌器拌攪亦可

11、）;3. 將消化的組織離心 1000r/min10 分鐘，吸去上清液，以 Hanks 液漂洗 2 3 分鐘，再離心，去上清，重復(fù) 3 次以盡量洗去胰蛋白酶 ;4. 用100卩m尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)過濾，去除未消化分離的碎組織 塊、纖維等 ;5. 再以 Hanks 液漂洗，收集細(xì)胞懸液 ;6. 計(jì)數(shù)活細(xì)胞百分率，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，用含 4%J、牛血清的PBS或 Hanks液制備所需濃度的細(xì)胞懸液（加小牛血清不僅可以作為穩(wěn)定劑， 抑制分散的細(xì)胞凝聚 ; 也可作為酶抑制劑，抑制與細(xì)胞表面結(jié)合的胰 蛋白酶的消化作用 ）。（ 二） 膠原酶消化分離細(xì)胞方法操作方法：1. 將切取的組織先用Hanks液或PBS洗凈粘附的血污。在碟皿內(nèi) 剪切成35mm3卒組織塊；2. 在小培養(yǎng)瓶內(nèi)加 45ml 培養(yǎng)液，放入數(shù)小塊組織碎塊，加入 等量 0.1%的膠原酶 （終濃度約為 100U/ml 或 0.05%）， pH6.5；3.37 C溫箱內(nèi)消化448小時(shí)（不需搖蕩）。如消化緩