5酶蛋白質(zhì)工程

1、 第五章第五章 酶的蛋白質(zhì)工程酶的蛋白質(zhì)工程一、概念：一、概念： 蛋白質(zhì)工程是以蛋白質(zhì)工程是以創(chuàng)造性能創(chuàng)造性能更適用的蛋白更適用的蛋白質(zhì)分子為目的，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為質(zhì)分子為目的，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，以基因重組技術(shù)為主要手段，對天然蛋基礎(chǔ)，以基因重組技術(shù)為主要手段，對天然蛋白質(zhì)分子的設(shè)計和改造。白質(zhì)分子的設(shè)計和改造。二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ)二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定一級結(jié)構(gòu)測定：一級結(jié)構(gòu)測定：直接法：直接測定多肽鏈的氨基酸順序。直接法：直接測定多肽鏈的氨基酸順序。間接法：

2、從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基間接法：從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。酸順序。三級結(jié)構(gòu)測定：三級結(jié)構(gòu)測定：x-x-射線晶體衍射射線晶體衍射研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)核磁共振核磁共振(nmr)(nmr)光譜光譜研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。 x-x-射線衍射技術(shù)：射線衍射技術(shù)： 用于蛋白質(zhì)及核酸三維結(jié)構(gòu)的確定，至今已用于蛋白質(zhì)及核酸三維結(jié)構(gòu)的確定，至今已有數(shù)百種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被確定。有數(shù)百種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被確定。 三、蛋白質(zhì)工程的主要手段三、蛋白質(zhì)工程的主要手段 以重組以重組dn

3、adna技術(shù)為核心的基因工程技術(shù)改造蛋白質(zhì)。技術(shù)為核心的基因工程技術(shù)改造蛋白質(zhì)。 位點特異性突變位點特異性突變基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、信息生物學(xué)基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、信息生物學(xué) 基因突變基因突變 隨機突變隨機突變基于基于高通量高通量篩選法篩選法 基因內(nèi)部的剪接基因內(nèi)部的剪接 基因剪接基因剪接 55或或 33端的剪接端的剪接四、蛋白質(zhì)工程改造的實際應(yīng)用四、蛋白質(zhì)工程改造的實際應(yīng)用 1.1.枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶 1 1）增強抗氧化性）增強抗氧化性 2 2）改變底物特異性）改變底物特異性 2.2.溶菌酶溶菌酶 1)1)抗菌范圍的擴大抗菌范圍的擴大 2)2)熱穩(wěn)定性的提高熱穩(wěn)定性的提高 五、酶的穩(wěn)定性五、酶

4、的穩(wěn)定性 1.1.酶穩(wěn)定的分子原因酶穩(wěn)定的分子原因 1 1）共價鍵：）共價鍵： 肽鍵肽鍵（peptide bondpeptide bond） 穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶主鏈的核心力量。穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶主鏈的核心力量。 二硫鍵二硫鍵（disulfide bonddisulfide bond） 由兩個由兩個cyscys的側(cè)鏈的側(cè)鏈-sh-sh氧化而成，是某些蛋氧化而成，是某些蛋白質(zhì)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要因素。白質(zhì)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要因素。2 2）非共價鍵：）非共價鍵：疏水相互作用疏水相互作用（hydrophobic interactionhydrophobic interaction）: : 是維持蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定

5、的主要的作用力。是維持蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定的主要的作用力。氫鍵氫鍵（hydrogen bondhydrogen bond）：）： 是穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，特別是二級結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，特別是二級結(jié)構(gòu)的重要力量。的重要力量。靜電相互作用靜電相互作用（electrostatic interactionelectrostatic interaction）：）： 又稱離子鍵、鹽鍵、鹽橋，是正負電荷間的作用又稱離子鍵、鹽鍵、鹽橋，是正負電荷間的作用力。對酶分子穩(wěn)定性有關(guān)的鹽鍵大部分形成于分子表力。對酶分子穩(wěn)定性有關(guān)的鹽鍵大部分形成于分子表面上。面上。范德華力：范德華力： 在電中性分子之間的非共

6、價結(jié)合。分子間形成的在電中性分子之間的非共價結(jié)合。分子間形成的范德華力越大越穩(wěn)定。范德華力越大越穩(wěn)定。金屬離子：金屬離子： caca2+2+、mgmg2+2+和和znzn2+2+等高價陽離子與多肽鏈不穩(wěn)定的等高價陽離子與多肽鏈不穩(wěn)定的彎曲部分結(jié)合，可顯著增加酶分子的穩(wěn)定性。彎曲部分結(jié)合，可顯著增加酶分子的穩(wěn)定性。途徑途徑方法方法優(yōu)點優(yōu)點不足不足酶酶分分子子改改造造核酸水平核酸水平蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程從根本上提高酶分從根本上提高酶分子穩(wěn)定性子穩(wěn)定性操作復(fù)雜，周操作復(fù)雜，周期長期長蛋白質(zhì)水平蛋白質(zhì)水平化學(xué)修飾化學(xué)修飾適應(yīng)所有酶，操作適應(yīng)所有酶，操作簡單經(jīng)濟簡單經(jīng)濟修飾過程破壞修飾過程破壞酶分子酶分子劑型劑型固定化固定化適應(yīng)所有酶，穩(wěn)定適應(yīng)所有酶，穩(wěn)定性高，可重復(fù)利用性高，可重復(fù)利用和連續(xù)生產(chǎn)和連續(xù)生產(chǎn)載量較低，易載量較低，易失活失活交聯(lián)酶晶體交聯(lián)酶晶體 穩(wěn)定性好，載量高，穩(wěn)定性好，載量高，催化效率高催化效率高成本高成本高微環(huán)境改良微環(huán)境改良穩(wěn)定劑穩(wěn)定劑簡單、經(jīng)濟簡單、經(jīng)