現(xiàn)代生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)PPT課件

1、實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的制備與質(zhì)量鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的載體質(zhì)粒DNA的提取方法。第1頁/共44頁二、實(shí)驗(yàn)原理 在堿性溶液中，雙鏈DNA氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)遭破壞而發(fā)生變性，但由于質(zhì)粒DNA分子量相對(duì)較小，且呈環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，即使在高堿性pH條件下，兩條互補(bǔ)鏈也不會(huì)完全分離，當(dāng)加入中和緩沖液時(shí)，變性質(zhì)粒DNA 又恢復(fù)到原來的構(gòu)型；而線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA則不能復(fù)性，與細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、SDS等形成不溶性復(fù)合物，通過離心沉淀，細(xì)胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)等可被除去，而質(zhì)粒DNA及小分子量的RNA則留在上清液中，再用酚/氯仿處理，可去除殘留蛋白質(zhì)，

2、混雜的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。第2頁/共44頁三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑 實(shí)驗(yàn)材料： 含pEGFP質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 主要試劑： 溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA， 25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L 溶液II： 0.2 mol/L NaOH溶液（內(nèi)含1% SDS）,現(xiàn)配現(xiàn)用 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸鉀，11.5 mL 冰醋酸， 28.5 mL H2O； 飽和酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V） TE緩沖液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，

3、 含RNA酶（RNaseA）: 20 g/ml 醋酸鈉（pH5.2）、70%乙醇、無水乙醇第3頁/共44頁第4頁/共44頁四、實(shí)驗(yàn)步驟1) 吸取1.4 ml菌液至1.5 ml離心管中。2) 離心(8 000r/min，1min)，棄上清液（根據(jù)菌液濃度判斷是否需要重復(fù)12次）。3) 加入150 L 溶液，用旋渦振蕩器充分懸浮菌體。4) 加入200 L溶液，加蓋后溫和顛倒56次，直至呈透明狀。此步驟在5分鐘內(nèi)完成。5) 加入150 L預(yù)冷的溶液，加蓋后反復(fù)顛倒混勻，直至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，冰浴5min。6) 離心(14 000r/min，5min)，移取上清液于另一干凈離心管。第5頁/共44頁7)

4、7)向上清液中加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），振蕩混勻抽提，離心(14 000 r/min，5min)，溶液將出現(xiàn)分層。8) 移取上層水相溶液（約450500L）于另一干凈離心管，加等體積氯仿，振蕩混勻抽提，離心(14 000 r/min，5min)，溶液將出現(xiàn)分層。9)移取上層水相溶液于另一干凈離心管，加入1/10體積的醋酸鈉（pH5.2）和2倍體積無水乙醇混勻，冰浴30min。10) 離心(14 000r/min，10min，4)，倒掉上清液。第6頁/共44頁11) 加0.5 ml 預(yù)冷的70% 酒精振蕩，洗DNA沉淀一次，離心5 min，倒掉上清液。12)真空抽干或室溫自

5、然干燥.13)加2030L TE緩沖液使DNA完全溶解，室溫放置10min，降解RNA雜質(zhì)，少量用于瓊脂糖凝膠質(zhì)量檢測(cè)，剩余質(zhì)粒-20保存?zhèn)溆谩?4) 1%瓊脂糖凝膠配制：稱取1g瓊脂糖粉末，加入100ml 0.5倍TBE溶液，加熱熔化，稍降溫后，加入5L溴化乙錠（EB），混勻，制備凝膠板，冷卻后備用。第7頁/共44頁15) 每位同學(xué)各取5L質(zhì)粒DNA加入1L 6loading buffer，混勻，進(jìn)行點(diǎn)樣。16)電泳條件：120v，40 min；電泳完成后，膠塊通過凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并拍照記錄。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀察并分析電泳圖片六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題

6、。第8頁/共44頁實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的片斷化及分離 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法鑒定DNA質(zhì)量 2、采用型限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析酶切效果。第9頁/共44頁二、實(shí)驗(yàn)原理 DNA吸收光譜峰在260 nm處，測(cè)定此波長(zhǎng)下DNA溶液的OD值，當(dāng)OD260=1時(shí)，雙鏈DNA含量約為50 g/mL，據(jù)此可用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液中DNA含量。由于蛋白質(zhì)吸收峰在280 nm處，在測(cè)定DNA含量時(shí)，通過計(jì)算OD260/OD280值，可了解所測(cè)DNA的純度，如該值為1.82.0時(shí)，DNA純度高。 已知型限制性核酸內(nèi)切酶能專一識(shí)別堿基序列，并在該處切斷雙鏈DNA，形成

7、一定長(zhǎng)度和序列的DNA片段。酶切反應(yīng)需Mg2+等金屬離子以及一定濃度的鹽離子，不同內(nèi)切酶對(duì)鹽離子有不同的要求，如鹽離子濃度使用不當(dāng)或甘油含量過高（5%），會(huì)使酶的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，產(chǎn)生星活性。絕大多數(shù)酶的反應(yīng)溫度37。第10頁/共44頁三、實(shí)驗(yàn)材料： 實(shí)驗(yàn)一提取的質(zhì)粒DNA四、試劑 限制性核酸內(nèi)切酶Xba I；緩沖液10M Buffer；0.1%BSA; 0.5TBE Buffer；1%瓊脂糖五、實(shí)驗(yàn)步驟 1、DNA的測(cè)定 空白測(cè)定(Blank)：吸取200 l TE緩沖液至比色杯，進(jìn)行空白測(cè)定。 DNA測(cè)定(Sample)：取質(zhì)粒DNA 1 l至一干凈的離心管，加入199 l TE緩沖液稀釋

8、混勻，所有溶液加入到干凈的比色杯中，測(cè)定260 nm及280 nm的光吸收值；計(jì)錄DNA濃度及OD260/OD280比值。第11頁/共44頁第12頁/共44頁2 2、酶切反應(yīng) 酶切反應(yīng)液的配制: : Xba I I 1l 10M buffer 2l 0.1%BSA 2l DNA 5l (根據(jù)質(zhì)粒濃度來確定用量) ddH2O 10l 酶切反應(yīng)條件：3737水浴2 23 3小時(shí)。3 3、電泳檢測(cè) 反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入2.5l 102.5l 10loading loading bufferbuffer，混勻，用以停止酶切反應(yīng)，所有22.5l22.5l樣品均點(diǎn)在同一個(gè)點(diǎn)樣孔中。電泳條件：120V

9、, 20120V, 20分鐘左右。第13頁/共44頁六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀察并分析電泳圖片。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。第14頁/共44頁實(shí)驗(yàn)三 大分子DNA的制備和質(zhì)量鑒定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法從植物組織中提取基因組DNA，并進(jìn)行DNA純度分析和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。第15頁/共44頁二、實(shí)驗(yàn)原理 核酸是生物有機(jī)體的重要成分，在細(xì)胞中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白形式存在。在制備核酸時(shí)，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。 在濃NaCl溶液(12mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很?。欢谙aCl

10、溶液(0.14mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的NaCl溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來。CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低濃度鹽溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高濃度鹽溶液中CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。 分離得到核蛋白后，可用氯仿等將蛋白等雜質(zhì)除去。第16頁/共44頁有效制備大分子DNA的兩個(gè)原則：1）防止和抑制內(nèi)源DNase對(duì)DNA的降解。2）盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞；所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。 第17頁/共44頁三、實(shí)驗(yàn)材料：植物葉片約0.2克四、實(shí)驗(yàn)試劑 1M

11、Tris-HCl (pH8.0)(提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞) CTAB分離緩沖液：2% CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.2%巰基乙醇 (EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl 提供高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解，存在于液相中；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易從基因組DNA中除去) 洗滌緩沖液：76%乙醇，10mmol/L乙酸銨 氯仿-異戊醇(24:1 )、異丙醇、TE緩沖液 液氮第18頁/共44頁五、實(shí)驗(yàn)步驟1. CTAB分離緩沖液置于60水浴中

12、預(yù)熱；2. 2人一組，摘取0.5g葉片，置于研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎；3. 取約0.2g葉片粉末加入到2.0mL離心管中，加入1ml預(yù)熱的CTAB分離緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻；4. 樣品置于65保溫30min；5. 加等體積(1mL)的氯仿-異戊醇，輕輕顛倒混勻； 6. 室溫下14000 rpm離心10min；第19頁/共44頁7. 上層水相吸入另一干凈1.5mL離心管中，加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置5min，使核酸沉淀下來；8. 室溫下10000 rpm離心10min；9. 棄去上清液，加入500L洗滌緩沖液，懸浮混勻；10.4條件下，14000 rpm離心10min；11

13、.在室溫下使DNA沉淀干燥至周圍透明，中間有少許白色為止；12.將DNA沉淀溶于20L TE中，-20保存?zhèn)溆茫?13.取5uL DNA溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢查所提取DNA的完整性；14.利用核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行DNA濃度和純度檢測(cè)。 （方法同實(shí)驗(yàn)二）第20頁/共44頁六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 基因組DNA的濃度和純度；觀察并分析電泳圖片七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。第21頁/共44頁實(shí)驗(yàn)四 PCR反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技術(shù)。第22頁/共44頁二、實(shí)驗(yàn)原理PCR技術(shù)是通過模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地?cái)U(kuò)增出來的技術(shù)。 PCR的過程：

14、高溫變性：將反應(yīng)體系置于高溫下變性，使模板雙鏈DNA解鏈為兩條單鏈。低溫退火：引物與模板鏈結(jié)合，形成部分雙鏈DNA。中溫延伸：Taq DNA聚合酶使引物從5端向3端延伸，4種dNTP摻入合成新的DNA互補(bǔ)鏈。 反復(fù)進(jìn)行這種變性、退火和聚合反應(yīng)循環(huán)，可使兩端引物限定范圍內(nèi)的DNA序列以指數(shù)形式擴(kuò)增。第23頁/共44頁三、實(shí)驗(yàn)材料 質(zhì)粒： pEGFP 四、試劑1. 10 PCR buffer 、rTaq 酶2. dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各2.5mM3.引物(2.5M) GFP-F: 5: 5 -TAGTCGACT-TAGTCGACTATGATGGT

15、GAGCAAGGGCGAGGAG-GTGAGCAAGGGCGAGGAG-5 5 (Tm=65.5) GFP-R: 5: 5 -GCGTCTAGA-GCGTCTAGATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-CTTGTACAGCTCGTCCATG-3 3 (Tm=61.5)4. 2.0% 瓊脂糖凝膠 第24頁/共44頁五、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR反應(yīng)混合液的配制 (50l) 10 PCR buffer 5l dNTP mixture 4l 前向引物 (P1) 8l 反向引物 (P2) 8l DNA 模板 0.5l rTaq酶 0.5l 滅菌蒸餾水 24l 所有試劑后，輕輕混勻，稍離心后即可，

16、為了防止反應(yīng)混合液蒸發(fā)，可添加30l礦物油覆蓋。 第25頁/共44頁2、PCR儀的參數(shù)設(shè)置 94 4 min 94 30sec 40 cycles 61 30sec 72 50sec 72 5 min3、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 反應(yīng)結(jié)束后，取5l PCR產(chǎn)品，加入1l 6loading buffer，混勻后點(diǎn)樣，電泳20min。 其余45l PCR產(chǎn)品保存在-20冰箱中，下次實(shí)驗(yàn)使用。第26頁/共44頁六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀察并分析電泳圖片七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。第27頁/共44頁實(shí)驗(yàn)五 PCR產(chǎn)品純化及克隆一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，掌握基因工程操作技術(shù)中

17、最常用的T-A克隆方法。第28頁/共44頁二、實(shí)驗(yàn)原理 PCR產(chǎn)物一般都含有過量的引物、Taq酶及dNTP等成分，直接影響后續(xù)的DNA連接酶的連接反應(yīng);實(shí)驗(yàn)中可采用苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿依次使反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)變性的方法純化DNA產(chǎn)品，然后在酸性條件下用無水乙醇沉淀DNA。 利用普通的Taq DNA聚合酶所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的3-端具有一個(gè)A突出末端，T載體的5-端具有一個(gè)T突出末端，二者正好互補(bǔ)，然后用T4 DNA連接酶在體外將目的片段與線性化載體連接的方法稱為T-A克隆。 第29頁/共44頁三、實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)四的 PCR產(chǎn)品 pMD19-T Vector四、試劑TE 緩沖液苯酚/氯仿/

18、異戊醇(25/24/1)、氯仿醋酸鈉（pH5.2）、無水乙醇、70%乙醇T4 DNA連接酶混合物(Solution I)第30頁/共44頁第31頁/共44頁五、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR產(chǎn)品純化 將PCR產(chǎn)品（約45l）小心轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加入55l TE緩沖液至總體積100l，混勻； 加入100l苯酚/氯仿/異戊醇，渦旋混合1 min，14000 rpm離心5 min； 將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入100l氯仿，渦旋混合1 min，14000 rpm離心5 min； 再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加10l醋酸鈉（pH=5.2）和250l無水乙醇，顛倒混勻，將離心管插入冰中放置 30 min；

19、第32頁/共44頁 在4，14000 rpm離心10 min，棄去上清液，觀察DNA沉淀； 加入500l預(yù)冷 70乙醇，洗滌DNA沉淀, 4 14000 rpm離心5min，棄去上清液；空氣干燥DNA沉淀，加5l無菌水溶解 DNA。2、連接反應(yīng) 經(jīng)純化的PCR產(chǎn)品4.5l轉(zhuǎn)移到PCR管中，加入0.5l pMD19-T載體，再加入5l T4 DNA連接酶混合物（ Solution I ），輕輕混勻，稍加離心即可； 連接反應(yīng)混合物放置在PCR儀中，16連接過夜； 連接產(chǎn)物用于下次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。第33頁/共44頁六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須等到下次實(shí)驗(yàn)完成后才能確定是否連接成功。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 按實(shí)驗(yàn)內(nèi)

20、容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。 （下周不用交報(bào)告，實(shí)驗(yàn)六完成后再交）第34頁/共44頁實(shí)驗(yàn)六 感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。2.學(xué)習(xí)用氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法。3.學(xué)習(xí)外源DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細(xì)胞的方法。第35頁/共44頁二、實(shí)驗(yàn)原理 轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株(R-，M-)，這些變異株可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。 受體細(xì)胞經(jīng)過一些化學(xué)試劑如CaCl2、 RbCl等處理后，細(xì)胞膜的通透性會(huì)發(fā)生暫時(shí)性的改變，成

21、為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。第36頁/共44頁 三、實(shí)驗(yàn)材料 E. coli DH5菌株：R-，M-，Amp- 實(shí)驗(yàn)五的連接產(chǎn)物：pMD19 /GFP四、試劑 1、含氨芐青霉素(Amp, 100mg/L)的LB固體培養(yǎng)基 2、X-gal儲(chǔ)存液（20mg/ml） 3、IPTG儲(chǔ)存液（200mg/ml） 4、0.10 mol/L CaCl2溶液第37頁/共44頁五、實(shí)驗(yàn)步驟1、受體菌的培養(yǎng) 從LB平板上挑取新鮮活化的E. coli DH5單菌落，接種于3-5mL LB液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。 將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)2-3h至OD600 =0.5左右。 (實(shí)驗(yàn)老師已幫大家完成)第38頁/共44頁2、感受態(tài)細(xì)胞的制備 (CaCl2法) 吸取1.5mL培養(yǎng)液到一滅菌的離心管中，將離心管插入冰中放置10min，然后于4下10 000 rpm離心10min。 棄去上清，用1mL預(yù)冷的0.10mol/L CaCl2 溶液輕輕懸浮細(xì)胞，將離心管插入冰中