實(shí)驗(yàn)四 凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

1、實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 凱氏定氮法 是測(cè)定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣餾出并為過量的酸液吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)酸滴定，就可計(jì)算出樣品中的氮量。由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計(jì)算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法 【目的】 了解凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法、意義及應(yīng)用【原理】 蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。蛋白質(zhì)與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的

2、消耗量計(jì)算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)的換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)的含量。 1.有機(jī)物中的銨根在強(qiáng)熱和催化劑及濃H2SO4作用下，消化生成（NH4）2SO4，反應(yīng)式為：2NH2+H2S04+2H+(NH4)2S04（其中CuSO4做催化劑） 2.在凱氏定氮儀器中與堿作用，通過蒸餾釋放出NH3，收集于H3BO3 溶液中，反應(yīng)式為: (NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O 3. 用已知濃度的HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)HCl消耗的量計(jì)算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)的換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)的含量，反應(yīng)式為： (NH4)2B4O7+2HCl+5

3、H2O2NH4Cl+4H3BO3【操作步驟】 基本步驟如下：取樣消化蒸餾滴定計(jì)算 稱取適量樣品（約相當(dāng)?shù)?0mg40mg）,移入干燥的消化管中，加入0.2g硫酸銅，6g硫酸鉀及20ml濃硫酸，置于消化爐上小心加熱， 待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全消失后，加大火力，并保持管內(nèi)液體內(nèi)微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)0.5h1h。取下放冷待蒸餾用。 （建議：消化爐溫控時(shí)間及溫度：1階段選擇溫度范圍280左右，時(shí)間為20分鐘左右； 2階段選擇溫度范圍450左右，待顏色變藍(lán)綠色后繼續(xù)加熱0.5h1h。 1.樣品消化NaOH、H2O注入管口，用橡膠管套如后分別置于NaOH、H2O盛器桶內(nèi)，加液時(shí)按面板上

4、相應(yīng)開關(guān)，液體經(jīng)電磁泵自動(dòng)流入消化管內(nèi)，注入毫升數(shù)視標(biāo)尺所注位置而定。 2.蒸餾蒸餾過程：（1）觀察蒸發(fā)爐內(nèi)水位，不能超過不銹鋼電極（如果超過，要先排完水）。（2）關(guān)掉排水閥，打開加熱電源，打開冷卻水（自來水開關(guān)），打開綠色蒸汽開關(guān)（只需打開任意一組），然后，觀察電流表；等電流表升到4A左右，關(guān)掉蒸汽開關(guān)。待其回到0A后再打開蒸汽開關(guān)。電流升到4A后再關(guān)掉，這樣反復(fù)開關(guān)（0-10）左右直到蒸汽從塑料管內(nèi)噴出，讓其噴半分鐘左右，關(guān)掉蒸汽開關(guān)，儀器進(jìn)入正常的待機(jī)狀態(tài)。 （3）250ml三角接收瓶中加入2% H3BO3 50ml和23滴混合指示劑，將接收瓶套在蒸餾器的接收管上，并且讓管口浸沒在H3B

5、O3溶液中。 （4）把需要蒸餾的消化管固定在蒸餾器托物架上，然后按面板上NaOH、H2O開關(guān)，分別向消化管注入蒸餾水（10ml左右）及NaOH溶液（硫酸用量的5倍,約100ml），然后開啟蒸汽開關(guān)，向試管內(nèi)注入蒸汽、進(jìn)行蒸餾。 待接收瓶?jī)?nèi)液面高于150ml時(shí)將接收瓶下移，使接收管離開液面、用少量H2O沖洗出氣口，繼續(xù)蒸餾半分鐘，然后取下接收瓶，待滴定用。 甲基紅乙醇溶液和溴甲酚綠乙醇配溶液指示劑，顏色由酒紅色變成綠色。 用0.05mol/LHCl滴定接收瓶?jī)?nèi)的溶液，滴定至(暗)灰色時(shí)為止，記下消耗HCL的毫升數(shù)。 3. 滴定按下列式子計(jì)算蛋白含量：X樣品中蛋白質(zhì)的含量，%V1樣品消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml；V2試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml；N硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液當(dāng)量濃度；0.0141N硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml相當(dāng)于氮克數(shù)；m樣品的質(zhì)量（體積），g（ml）；F蛋白質(zhì)系數(shù)，按16%計(jì)算乘以6.25即為蛋白質(zhì)。 【結(jié)果及計(jì)算】100014. 0)(21mFNVV蛋白質(zhì)X %式中：測(cè)定范圍：含氮在0.1200mg測(cè)定品種：糧食、飼料、食品、乳制品、飲料、土壤、水、藥物、沉淀物和化學(xué)品等。 加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸