多西他賽PELGE納米粒的處方優(yōu)化、表征及其體外釋放和抗腫瘤活性的初步評價(jià)

1、    多西他賽pelge納米粒的處方優(yōu)化、表征及其體外釋放和抗腫瘤活性的初步評價(jià)    廖龍飛 楊青青 漆婷婷 邱悅 肖洪濤中圖分類號 r943;r944.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 a 文章編號 1001-0408（2021）20-2492-07doi 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.20.10摘 要 目的：優(yōu)化多西他賽（dtx）-聚乙二醇-（聚乳酸-羥基乙酸）-聚乙二醇三嵌段共聚物（pelge）-納米粒（nps）的處方，對其進(jìn)行表征，并評價(jià)其體外釋放特性及抗腫瘤活性。方法：采用開環(huán)共聚法合成pelge，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備dtx-

2、pelge- nps;采用高效液相色譜法測定dtx-pelge-nps中dtx的含量;以dtx用量、pelge用量、泊洛沙姆188濃度為自變量，包封率為因變量，采用box-behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化處方;采用激光粒度儀和透射電鏡測定dtx-pelge-nps的粒度和zeta電位;以dtx注射液為參照，采用離心超濾法測定體外釋放率;以dtx注射液不含dtx的pelge-nps為參照，采用噻唑藍(lán)法考察體外細(xì)胞毒性。結(jié)果：最優(yōu)處方為dtx用量2.80 mg，pelge用量20.60 mg，泊洛沙姆188濃度6%。優(yōu)化所得dtx-pelge-nps的包封率為（86.79±1.32）%，

3、載藥量為（10.21±0.78）%，平均粒度為（78.4±2.9）nm，多分散性指數(shù)（pdi）為（0.187±0.018），zeta電位為（-20.6±1.5）mv;電鏡下dtx-pelge-nps呈類球形，分布均勻。相較于dtx注射液（4 h時(shí)的累積釋放率約為92.3%），dtx-pelge-nps有明顯的緩釋效果（36 h時(shí)的累積釋放率約為78.6%）。0.150 g/ml的pelge-nps對人乳腺癌細(xì)胞mcf-7無明顯細(xì)胞毒性（p>0.05），而0.510 g/ml的 dtx-pelge-nps能夠顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞mcf-7的生長，且作

4、用（dtx-pelge- nps 10 g/ml組除外）顯著強(qiáng)于同濃度dtx注射液（p<0.05）。結(jié)論：優(yōu)化所得處方工藝穩(wěn)定、可行;所得dtx-pelge-nps粒度均勻，包封率較高，緩釋效果明顯，體外抗腫瘤活性強(qiáng)于dtx注射液。關(guān)鍵詞 多西他賽;聚乙二醇-（聚乳酸-羥基乙酸）-聚乙二醇三嵌段共聚物;box-behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法;高效液相色譜法;處方優(yōu)化formulation optimization and characterization of docetaxel pelge nanoparticles and preliminarily evaluation of its

5、 drug release and antitumor activity in vitroliao longfei1，yang qingqing2，qi tingting1，qiu yue1，xiao hongtao1（1. dept. of clinical pharmacy， sichuan cancer hospital/sichuan cancer prevention and control center/the affiliated cancer hospital of university of electronic science and technology of china

6、， chengdu 610041， china; 2. patent examination cooperation sichuan center， the patent office of cnipa， chengdu 610200， china）abstract   objective： to optimize the formulation of docetaxel （dtx）-mpeg-plga-mpeg （pelge）-nanoparticles （nps）， and to characterize it and evaluate its in vitro dru

7、g release and antitumor activity. methods： pelge were synthesized by ring-opening polymerization. dtx-pelge-nps were prepared by using emulsion solvent evaporation method. the content of dtx in dtx-pelge-nps was determined by hplc. box-behnken design-response surface methodology was applied to optim

8、ize the formulation of the nanoparticles using the amount of dtx， pelge and poloxamer 188 as independent variable， using entrapped efficiency as dependent variable. the particle size and zeta-potential of dtx-pelge-nps were characterized by laser particle size analyzer and transmission electron micr

9、oscope. the in vitro release of the dtx-pelge-nps was investigated by ultra-filtered centrifugation， using dtx injection as reference. in vitro cytotoxicity of the dtx-pelge-nps was investigated by mtt assay， using dtx and pelge-nps without dtx as reference. results： the optimal formulation included

10、 2.80 mg dtx， 20.60 mg pelge and 6% poloxamer 188. the entrapped efficiency of optimized dtx-pelge-nps was （86.79±1.32）%; drug-loading amount was （10.21±0.78）%， and average particle size was （78.4±2.9）nm; polydispersity coefficient was （0.187±0.018） and zeta potential was （-20.6&

11、#177;1.5） mv. furthermore， dtx- pelge-nps showed a regular spherical and uniform distribution under scanning electron microscopy. compared with dtx injection （accumulative release rate of 92.3% at 4 h）， dtx- pelge-nps had a significant sustained-release effect （accumu- lative release rate of 78.6% a

12、t 36 h）. 0.1-50 g/ml pelge-nps had no obvious cytotoxicity to human breast cancer cells mcf-7 （p>0.05）. 0.5-10 g/ml dtx-pelge-nps could significantly inhibit the growth of human breast cancer cells mcf-7， and its inhibitory effect （except for dtx-pelge-nps 10 g/ml group） was significantly stronge

13、r than that of dtx injection （pkeywords docetaxel; mpeg-plga-mpeg; box-behnken design-response surface methodology; hplc; formulation optimization多西他賽（docetaxel，dtx）為紫杉烷類微管抑制型抗腫瘤藥物，主要作用于處在有絲分裂階段的腫瘤細(xì)胞1。dtx所具有的抗腫瘤作用使其成為激素難治性前列腺癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌等的一線治療藥物2。但dtx水溶性較差，其注射劑中常添加吐溫-80和乙醇作為增溶劑，而增溶劑易導(dǎo)致患者發(fā)生嚴(yán)重過敏等不良反應(yīng)3

14、。此外，吐溫-80還會改變dtx的體內(nèi)行為，導(dǎo)致dtx呈非線性藥動(dòng)學(xué)特征，大大限制了該藥的臨床應(yīng)用3。因此，有研究者嘗試?yán)弥|(zhì)體、膠束、納米粒等新型給藥系統(tǒng)作為dtx的載體，以提高其靶向性、減輕不良反應(yīng)，并取得了一定成果，但這些納米材料包載藥物易導(dǎo)致其相關(guān)制劑具有毒性大、不穩(wěn)定等缺點(diǎn)4-5。聚乳酸-羥基乙酸共聚物poly（lactic-co-glycolic   acid），plga可在體內(nèi)分解、吸收，具有良好的生物相容性，但表面的疏水性易導(dǎo)致其納米粒在血液中被識別和清除，滯留時(shí)間較短6。而將聚乙二醇（polyethylene glycol，peg）接枝于plga兩端而合

15、成的新型高分子降解材料聚乙二醇-（聚乳酸-羥基乙酸）-聚乙二醇三嵌段共聚物（mpeg-plga-mpeg，pelge）不僅具有plga的生物相容性，而且強(qiáng)親水性的peg外層能夠有效地減少巨噬細(xì)胞的識別與攝取，從而增加藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間7。pelge避免了其他納米載體毒性大、不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，增加了藥物的溶解度和穩(wěn)定性，延長了藥物的循環(huán)時(shí)間，降低了不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，是一種優(yōu)良的藥物載體材料7?；诖?，本研究以pelge為dtx的載體材料，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備紫杉醇-聚乙二醇-（聚乳酸-羥基乙酸）-聚乙二醇三嵌段共聚物-納米粒（dtx-pelge-nps）;采用高效液相色譜（hplc）法測定d

16、tx含量;以包封率為考察因素，采用box-behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對處方進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對其藥劑學(xué)性質(zhì)及體外釋放規(guī)律進(jìn)行考察，并初步評價(jià)其體外抗腫瘤活性，旨在為相關(guān)制劑用于體內(nèi)抗腫瘤研究提供依據(jù)。1 材料1.1 主要儀器本研究所用主要儀器有nicolet 20 sxb 型紅外光譜（ir）儀、varioskan flash型熒光化學(xué)發(fā)光分析儀（美國 thermo fisher scientific公司），unity 500 mhz型核磁共振（nmr）儀（美國varian公司），1260型hplc儀及配套的四元溶劑混合系統(tǒng)、多功能泵、infinitylab benchtop液相色譜系統(tǒng)（美國ag

17、ilent公司），nano zs90 型激光粒度分析儀（英國malvern公司），h-600 型透射電鏡（日本hitachi公司），uph-10t型優(yōu)普超純水儀（成都超純科技有限公司），nanosep?超濾管（截留分子量為300 000，美國pall life science公司），透析袋（截留分子量為8 00012 000，美國sigma公司）等。1.2 主要藥品與試劑dtx原料藥（批號20180412，純度>99%）、dtx對照品（批號m0308as，純度>99%）均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;dtx注射液（批號190815an，純度>99%）購自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限股份公

18、司;乙酸乙酯（批號20190809）、丙酮（批號20180120）均購自天津市進(jìn)豐化工有限公司;泊洛沙姆188（批號190323）購自德國basf公司;吐溫-80（批號20190112）購自成都科龍化工試劑廠;胎牛血清（批號20190722）購自上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司;注射用青霉素鈉（批號190620，規(guī)格0.48 g/支）購自華北制藥股份有限公司;rpmi 1640培養(yǎng)基（批號20190508）購自美國hyclone公司;噻唑藍(lán)（mtt）購自美國sigma公司;乳酸（la，批號20190124）、乙醇酸（ga，批號20190205）、peg（批號20190130，相對分子質(zhì)量為550，

19、純度5%）均購自山東醫(yī)療器械研究所;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。1.3 細(xì)胞人乳腺癌細(xì)胞mcf-7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。2 方法與結(jié)果2.1 pelge的合成與表征根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參考文獻(xiàn)8-9，按la ga為7 3（摩爾比），采用開環(huán)共聚法制得pelge（純度>99%）。通過ir光譜和1h-nmr對pelge進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)驗(yàn)證。結(jié)果見圖1。在圖1a中，2 9003 000 cm-1處的吸收峰為ch的伸縮振動(dòng)峰，1 760 cm-1為酯基中c=o的伸縮振動(dòng)峰，1 090 cm-1為och2的伸縮振動(dòng)峰;pelge呈現(xiàn)出peg與plga的混合光譜特征

20、，其不同之處為pelge的光譜中未見peg光譜中羥基拉伸導(dǎo)致的3 400 cm-1處的寬吸收帶，表明peg的游離羥基已與羰基反應(yīng)8，由此初步判斷peg已成功接枝于plga。在圖1b中，1.65、5.10 ppm處的峰來自于plga中ch和ch3的質(zhì)子;peg中的ch2特征峰位于3.65 ppm處，而ga中ch2的特征峰位于4.78 ppm處，代表了plga和peg的共軛片段。與peg和plga相關(guān)特征峰的存在證實(shí)了聚合反應(yīng)后共聚物的結(jié)構(gòu)特征，提示pelge合成成功。2.2 dtx-pelge-nps的制備采用乳化溶劑揮發(fā)法制備dtx-pelge-nps。稱取dtx原料藥 2.0 mg、“2.1

21、”項(xiàng)下peleg 20 mg，加乙酸乙酯-丙酮混合溶劑（5 1，v/v）5 ml使溶解，作為油相，探頭超聲（功率200 w，工作5 s，間歇5 s，下同）1 min，將水5 ml緩慢均勻加入油相，形成油包水型初乳;將上述初乳加入至含有泊洛沙姆188 0.5 g的水相5 ml中，再次探頭超聲1 min后，于40 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h以除去乳液中的有機(jī)溶劑，經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜濾過，即得dtx- pelge-nps（含dtx 0.2 mg/ml、pelge 2 mg/ml、泊洛沙姆188 5%）。同法制備不含dtx的pelge-nps。2.3 dtx的含量測定2.3.1 色譜條件 以kromas

22、il c18（200 mm×4.6 mm，5 m）為色譜柱，以乙腈-水（60 40，v/v）為流動(dòng)相;檢測波長為 228 nm;流速為1.0 ml/min;柱溫為25 ;進(jìn)樣量為20 l。2.3.2 溶液的制備 （1）對照品溶液：精密稱取dtx對照品10.15 mg，置于100 ml量瓶中，加入甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為101.5 g/ml的對照品溶液。（2）供試品溶液：取“2.2”項(xiàng)下dtx-pelge-nps溶液1 ml，加入甲醇稀釋并定容至10 ml，超聲處理3 min破乳后，經(jīng)0.22 m微孔濾膜濾過，取濾液，即得。（3）陰性對照溶液：取“2.2”項(xiàng)下pelge-nps溶

23、液1 ml，按上述供試品溶液的制備方法處理，即得。2.3.3 專屬性考察 分別取“2.3.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，dtx的保留時(shí)間約為5.8 min，而陰性對照溶液在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)無色譜峰出現(xiàn);待測成分峰與相鄰色譜峰間的分離度均大于 1.5，且主峰與雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離，陰性對照對測定無干擾。結(jié)果見圖2。2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.2（1）”項(xiàng)下對照品溶液，加甲醇稀釋，制得dtx質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、20、40、50 g/ml的系列線性溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色

24、譜圖。以dtx質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、峰面積（a）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，dtx的回歸方程為a=17.626c-8.354（r 2=0.999 6），表明dtx在2.550 g/ml線性范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.3.2（1）”項(xiàng)下對照品溶液，加甲醇稀釋，制得dtx質(zhì)量濃度分別為5、20、40 g/ml的樣品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件于1 d內(nèi)分別重復(fù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，考察日內(nèi)精密度;再連續(xù)3 d共6次進(jìn)樣測定，記錄峰面積，考察日間精密度。結(jié)果顯示，3個(gè)質(zhì)量濃度樣品溶液的日內(nèi)rsd分別為1.73%、1.56%、1.13%（n=6

25、），日間rsd分別為1.01%、0.97%、1.21%（n=6），表明儀器精密度良好。2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下dtx-pelge-nps溶液，共6份，按“2.3.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，dtx含量的rsd為1.36%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.3.2（2）”項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫下放置 0、2、4、8、12、24 h 時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，dtx峰面積的rsd為0.61%（n=6），表明供試品溶液于室

26、溫條件下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.3.8 回收率試驗(yàn) 精密量取“2.3.2（1）”項(xiàng)下對照品溶液，加甲醇釋釋，制得dtx質(zhì)量濃度分別為5、20、40 g/ml的樣品溶液，分別加入“2.3.2（3）”項(xiàng)下質(zhì)量濃度分別為50、200、400 g/ml的陰性對照溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。每個(gè)濃度測定3次。結(jié)果顯示，3個(gè)質(zhì)量濃度溶液的回收率分別為（99.2±1.5）%、（98.9±0.9）%、（100.1±1.3）%，rsd分別為1.51%、0.91%、1.30%（n=3），表明方法準(zhǔn)確度良好。2.3.9 

27、60;樣品含量測定   取“2.2”項(xiàng)下dtx-pelge-nps溶液，按“2.3.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。2.4 包封率和載藥量的測定取“2.2”項(xiàng)下dtx-pelge-nps 溶液1 ml，加入超濾管中，以6 500 r/min離心50 min，取上清液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定3次，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算dtx含量并按公式計(jì)算dtx-pelge-nps的包封率和載藥量：包封率（%）=（w總-w游離）/w總×100%，載藥量（%）=（w總-w游離）/w制劑

28、×100%。式中，w總表示dtx-pelge-nps溶液中dtx的總含量，w游離表示超濾液中游離的dtx含量，w制劑表示dtx-pelge-nps溶液中dtx-pelge-nps的含量9。結(jié)果顯示，包封率和載藥量分別為（72.45±2.72）%、（6.92±0.53）%，rsd分別為3.75%、7.66%（n=3）。2.5 處方的box-behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化2.5.1 box-behnken設(shè)計(jì) 在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，本研究選擇對dtx-pelge-nps包封率影響較大的3個(gè)因素：dtx用量（a）、pelge用量（b）、泊洛沙姆188濃度（c）為自

29、變量，包封率（y）為因變量，采用design-expert v8.0.6軟件進(jìn)行3因素3水平設(shè)計(jì)。dtx-pelge-nps處方的因素與水平見表1，其實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。2.5.2 模型擬合與方差分析 采用design-expert v8.0.6軟件建立擬合方程。結(jié)果顯示，二次多元方程為y=7.93-0.60×a+2.08×b+0.22×c-0.15×a×b-0.85×a×c-0.35×b×c-3.39×a 2-2.59×b 2-2.74×c 2（r 2=0.957 2），

30、模型顯著（p=0.006 30.05），表明模型成立，能滿足實(shí)驗(yàn)要求;各自變量與因變量之間非簡單的線性關(guān)系，存在相互作用。對擬合模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，因素b、a 2、b 2、c 2對包封率有顯著影響（p0.05）;3個(gè)因素對包封率影響的大小順序?yàn)閎>a>c。結(jié)果見表3。2.5.3 交互作用的響應(yīng)面分析 采用design-expert v8.0.6軟件繪制包封率的響應(yīng)面三維圖。結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著dtx用量、pelge用量和泊洛沙姆188濃度的增加，包封率有明顯的上升趨勢。當(dāng)三者到達(dá)最佳臨界點(diǎn)后，包封率均呈小幅下降。由“2.5.2”項(xiàng)下所建模型預(yù)測的最優(yōu)處方dtx用量為2.

31、81 mg，pelge用量為20.62 mg，泊洛沙姆188濃度為6%，預(yù)測包封率為87.15%。2.5.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)際操作的可行性得到最優(yōu)處方為dtx用量2.80 mg，pelge用量20.60 mg，泊洛沙姆188濃度6%。按上述最優(yōu)處方制備3批dtx-pelge-nps進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，dtx-pelge-nps的包封率為（86.79±1.32）%（rsd=1.52%，n=3），載藥量為（10.21±0.78）%。與模型包封率預(yù)測值的偏差較小（0.36%），表明所得最優(yōu)處方穩(wěn)定、可行。2.6 dtx-pelge-nps的體外評價(jià)2.

32、6.1 粒度和zeta電位的測定 按“2.5.4”項(xiàng)下最優(yōu)處方制備dtx-pelge-nps，加水稀釋，采用激光粒度分析儀于25 、測量角90 °條件下測定粒度和zeta電位，重復(fù)測定3次，并通過多分散性指數(shù)（pdi）分析粒度的均勻程度。結(jié)果顯示，dtx-pelge-nps的平均粒度為（78.4±2.9）nm，pdi為（0.187±0.018），zeta電位（-20.6±1.5）mv（n=3）。粒度和zeta電位分布圖形均為對稱單峰，峰形較窄，且pdi值較低，表明納米粒的粒度和電位分布均勻。結(jié)果見圖4a、圖4b。2.6.2 形態(tài)觀察 按“2.5.4”項(xiàng)下

33、最優(yōu)處方制備dtx- pelge-nps，取1 ml，加水稀釋50倍后，滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，靜態(tài)吸附10 min，用2%磷鎢酸溶液染色40 s，用濾紙吸干多余液體后，采用透射電鏡觀察其形態(tài)。結(jié)果顯示，dtx-pelge-nps呈類球形，大小均一，表面光滑，且粒度在80 nm左右，與“2.6.1”項(xiàng)下粒度測定結(jié)果基本一致。結(jié)果見圖4c。2.6.3 體外釋放度的考察 采用離心超濾法進(jìn)行考察。取dtx注射液和按“2.5.4”項(xiàng)下最優(yōu)處方制備的dtx-pelge-nps 各1 ml，分別置于透析袋中并扎緊袋子兩端，將透析袋置于含有0.5%且濃度為1 mol/ml吐溫-80的磷酸鹽緩沖液（pbs，p

34、h 7.4）400 ml中，于37 條件下持續(xù)振蕩（100 r/min），分別于0、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h時(shí)取透析液1 ml（同時(shí)補(bǔ)加同溫等量上述pbs）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按公式計(jì)算累積釋放率：累積釋放率（%）=cn×v+i=1n-1ci×vi/wdtx×100%。式中，wdtx表示透析袋中dtx的總含量;vi表示每次吸取透析液的體積;v表示緩沖液的總體積;ci、cn表示dtx的濃度，其中i、n為取樣次數(shù)。結(jié)果顯示，dtx-pelge-nps的釋放速率比dtx注射液慢：dtx注射液在4

35、 h時(shí)的累積釋放率約為92.3%，已接近完全釋放;dtx-pelge-nps在36 h時(shí)的累積釋放率約為78.6%，趨近完全釋放，之后逐漸到達(dá)穩(wěn)定?？梢?，兩者的釋藥行為存在明顯差異，dtx-pelge- nps的釋放曲線平緩，無突然釋放現(xiàn)象;相比于dtx注射液，dtx-pelge-nps顯示出了明顯的緩慢釋放效果。結(jié)果見圖5。2.7 體外抗腫瘤活性的評價(jià)采用mtt法考察dtx注射液、pelge-nps和dtx-pelge-nps對人乳腺癌細(xì)胞mcf-7的細(xì)胞毒性作用。選取處于對數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞mcf-7，用含10%胎牛血清和1%青霉素的rpmi 1640培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）制

36、成懸液，計(jì)數(shù)后按5×104個(gè)/ml以100 l接種于96孔板中，于37 、5%co2條件下培養(yǎng)24 h（培養(yǎng)條件下同）。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組和給藥組，空白對照組加入完全培養(yǎng)基100 l，給藥組分別加入含pelge-nps 0.1、0.5、1、5、10、20、50 g/ml（以pelge-nps計(jì)，質(zhì)量濃度設(shè)置參考前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果10）或含dtx、dtx-pelge-nps 0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 g/ml（均以dtx計(jì)，根據(jù)pelge-nps組濃度結(jié)合最優(yōu)處方比例換算而得）的完全培養(yǎng)基100 l，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，加入500 ng/

37、ml mtt溶液50 l;繼續(xù)孵育4 h，棄去mtt溶液，用pbs清洗后加入二甲基亞砜100 l，采用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定各孔的光密度（od）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=odn/od0×100%。式中，odn為給藥組細(xì)胞的od值，od0為空白對照組細(xì)胞的od 值。采用spss 19.0軟件對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。結(jié)果顯示，pelge-nps組細(xì)胞的存活率較高，且其值與質(zhì)量濃度無關(guān)，與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），即pelge-nps對人乳腺癌細(xì)胞mcf-7的生長幾乎無影響，表明pelge-nps作

38、為載體的毒性較低、安全性較高。當(dāng)dtx質(zhì)量濃度<0.05）。這表明將dtx包載于pelge-nps中可增強(qiáng)dtx對人乳腺癌細(xì)胞mcf-7的體外抑制作用。結(jié)果見表4。3 討論dtx于228 nm波長處有最大吸收，但是因其注射液中的輔料吐溫-80在此波長處也有吸收，若采用紫外光譜法測定dtx含量會有較大誤差，故本研究利用hplc法的分離功能消除輔料的干擾，并選擇228 nm作為dtx含量的檢測波長，具有較強(qiáng)的專屬性11。同時(shí)，本課題組在綜合考慮峰位、柱效、峰對稱性、雜質(zhì)檢出及儀器管路清洗等多種因素后，最終確定以乙腈-水（60 40，v/v）為流動(dòng)相。本課題組前期已制備出性質(zhì)穩(wěn)定且大小均一的p

39、elge-nps，并且通過調(diào)節(jié)超聲頻率、時(shí)間和次數(shù)等條件將粒徑控制在理想范圍（50200 nm）內(nèi)7。同時(shí)，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，超聲條件是影響dtx-pelge-nps粒度和pdi的關(guān)鍵因素，而粒度和pdi不受dtx用量、   pelge用量和泊洛沙姆188濃度的影響，因此在考察最優(yōu)處方時(shí)未將粒度和pdi作為處方優(yōu)化的指標(biāo)。包封率反映了藥物被載體包載的程度，是納米粒質(zhì)量控制的一個(gè)重要指標(biāo)12，高包封率對提高納米制劑療效、降低藥物不良反應(yīng)具有重要意義13，故本研究以包封率為衡量處方優(yōu)化是否成功的標(biāo)志。本研究通過box-behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法構(gòu)建了dtx-pelge-nps的

40、參數(shù)模型，初步研究并探討了各因素之間的相互作用。結(jié)果顯示，隨著dtx用量、pelge用量、泊洛沙姆188濃度的增加，包封率均呈先增后減的趨勢。筆者分析其原因?yàn)楫?dāng)dtx和pelge達(dá)到一定量時(shí)，載體材料包載藥物達(dá)到飽和，不再繼續(xù)包載，導(dǎo)致未被包載的游離藥物逐漸增多，包封率下降;此外，在乳化溶劑揮發(fā)法中，初乳的穩(wěn)定性是決定包封率的關(guān)鍵因素14，而高濃度乳化劑會導(dǎo)致制劑的粒度偏小，影響初乳的穩(wěn)定性，從而降低包封率15。因此，在達(dá)到最優(yōu)乳化劑濃度后繼續(xù)增加乳化劑用量，包封率會呈現(xiàn)下降趨勢。體外評價(jià)結(jié)果顯示，dtx-pelge-nps呈類球形，大小均一且表面光滑。體外釋放度考察結(jié)果顯示，dtx- pel

41、ge-nps的釋放率比dtx注射液慢，且曲線較為平滑，展現(xiàn)出良好的緩釋效果。這些特點(diǎn)是由dtx-   pelge-nps自身結(jié)構(gòu)所決定的，包裹于內(nèi)部的藥物在納米表面溶蝕后逐漸釋放，其釋放率較為穩(wěn)定，藥物突然釋放的可能性較低;同時(shí)，具有親水性和柔性的peg的空間位阻作用可阻止納米粒之間的摩擦和碰撞，以減少納米粒聚集所造成的結(jié)構(gòu)破壞，從而達(dá)到緩釋的效果16-17。在0.055 g/ml范圍內(nèi)，dtx-pelge-nps的細(xì)胞毒性顯著強(qiáng)于游離的dtx。其主要原因?yàn)榧{米粒能夠通過腫瘤細(xì)胞的內(nèi)吞作用而促進(jìn)藥物被攝取，尺寸較小且peg成分含量較高的納米粒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的能力更強(qiáng)，而游離藥

42、物則只能通過細(xì)胞膜被動(dòng)擴(kuò)散18。由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞在固定作用時(shí)間（4 h）內(nèi)攝取納米粒的能力有限，因此在高質(zhì)量濃度狀態(tài)下，dtx- pelge-nps和dtx的細(xì)胞毒性接近。理論上，在體內(nèi)環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，則可能更有利于dtx-pelge-nps被攝取，但需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。綜上所述，優(yōu)化所得處方穩(wěn)定、可行，所得dtx- pelge-nps粒度均勻，包封率較高，緩釋效果明顯，體外抗腫瘤活性強(qiáng)于dtx注射液。參考文獻(xiàn) 1 zhang e，xing r，liu s，et al. current advances in  development of new do

43、cetaxel formulationsj. expert opin drug deliv，2019，16（3）：301-312. 2 farhan s m，mubashar r，shoaib s h，et al.   advancements in the oral delivery of docetaxel：chal- lenges，current state-of-the-art and future trendsj. int j nanomedicine，2018，13：3145-3161. 3 alken s，kelly c m. benefit risk ass

44、essment and update on the use of docetaxel in the management of breast cancerj. cancer manag res，2013，5：357-365. 4 alibolandi m，abnous k，hadizadeh f，et al. dextran-poly lactide-co-glycolide polymersomes decorated with folate-antennae for targeted delivery of docetaxel to breast adenocarcinoma in vit

45、ro and in vivoj. j control release，2016，241：45-56. 5 chen f，zhang j，wang l，et al. tumor ph（e）-triggered charge-reversal and redox-responsive nanoparticles for docetaxel delivery in hepatocellular carcinoma treatmentj. nanoscale，2015，7（38）：15763-15779. 6 aggarwal p，hall j b，mcleland c b，et al. nanopa

46、rticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution，biocompatibility and therapeutic efficacyj. adv drug del rev，2009，61（6）：428-437. 7 chang c w，choi d，kim w j，et al. non-ionic amphiphilic biodegradable peg-plga-peg copolymer enhances gene delivery efficiency in rat ske

47、letal musclej. j controlled release，2007，118（2）：245-253. 8 ashjari m，khoee s，mahdavian a r，et al.    selfassembled nanomicelles using plga-peg amphiphi- lic block copolymer for insulin delivery：a physicochemical investigation and determination of cmc valuesj. j mater sci mater med，2012，23（4）：943-953. 9 zhang t，zheng，peng q，et al. a novel submicron emulsion system loaded with vincristine-oleic acid ion- pair complex with improved anticancer effect：in vitro and