CRISPR核酸酶載體試劑盒說明書

1、CRISPR核酸酶載體試劑盒說明書目錄內(nèi)容和保存介紹產(chǎn)品信息方法實驗輪廓 設(shè)計單鏈DNA寡核苷酸產(chǎn)生雙鏈寡核苷酸連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli細(xì)胞分析轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞系附錄ACRISPR核酸酶載體試劑盒的圖譜和特點附屬產(chǎn)品技術(shù)支持參考附錄BCRISPR核酸酶表達(dá)細(xì)胞的富集內(nèi)容和含量1.1 雙鏈（ds）對照寡核苷酸序列 ds 克隆對照的寡核苷酸的序列如下所列。ds 克隆對照的寡核苷酸來自退火的，并在試劑盒中提供的50M的雙鏈寡核苷酸。 ds 克隆對照的寡核苷酸在應(yīng)用于連接反應(yīng)之前需要進(jìn)行再退火和稀釋。5 CATTTCTCAGTGCTATAGAGTTTT 33GTGGCGTAAAGAGTCACG

2、ATATCT 51.2感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率1×109 cfu/微克質(zhì)粒DNA1.3 TOP10細(xì)胞的基因型F-MCRA（MRR-hsdRMS-mcrBC）80lacZM15lacX74recA1 araD139（ARA-LEU）7697Galu galKpsL（STRR）endA1 nupG2 介紹2.1 產(chǎn)品信息2.1.1 介紹GENEART®CRISPR核酸載體試劑盒便于產(chǎn)生表達(dá)CRISPR RNA和tracrRNA的非編碼RNA以及在哺乳動物細(xì)胞中Cas9核酸酶介導(dǎo)的靶基因的裂解或基因編輯的結(jié)構(gòu)體。該Cas9核酸酶是基于從細(xì)菌化膿性鏈球菌II型CRISPR/ Cas系統(tǒng)

3、，并經(jīng)過精心設(shè)計的基因組編輯在哺乳動物系統(tǒng)（Jinek等人，2012;。Mali1等人，2013;。cong等人，2013） 。帶有OFP的GENEART®CRISPR核酸載體允許Cas9和CRISPR RNA的基于流式細(xì)胞儀表達(dá)的細(xì)胞群的分選，而帶有CD4的GENEART®CRISPR核酸載體使Cas9與CRISPR RNA為基礎(chǔ)的表達(dá)細(xì)胞的富集。線性GENEART®CRISPR核酸載體提供快速和有效的方式來克隆編碼所需CRISPR RNA靶到表達(dá)盒，允許Cas9核酸序列中的特定的方式靶向的雙鏈寡核苷酸。雖然該工具包被設(shè)計來表達(dá)Cas9和引導(dǎo)RNA的代表以最簡單

4、，最直接的方式，使用該試劑盒的基因組編輯和靶位點的特定靶序列裂解分析假設(shè)用戶熟悉的CRISPR系統(tǒng)，載體的原則為基礎(chǔ)的生產(chǎn)CRISPR RNA，并轉(zhuǎn)染哺乳動物系統(tǒng)。我們強(qiáng)烈建議用戶擁有CRISPR系統(tǒng)的工作知識。2.1.2該CRISPR系統(tǒng) 在CRISPR系統(tǒng)是一種使用RNA指導(dǎo)的DNA核酸酶沉默病毒核酸（Jinek等人，2012）原核適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。在細(xì)菌中CRISPR位點組成的串聯(lián)重復(fù)序列由外源DNA片段的分離（30bp的長度），稱為間隔件。的重復(fù)間隔件陣列被轉(zhuǎn)錄為一個長的前體和重復(fù)序列內(nèi)被處理，以產(chǎn)生用于指定由CRISPR核酸酶裂解的靶序列（也被稱為protospacers）小crRNA

5、s。 CRISPR間隔物，然后用于識別和沉默的RNA或DNA水平的外源遺傳元件。必不可少的裂解是一個序列基序緊接在目標(biāo)區(qū)的3'端，被稱為protospacer相鄰的基序（PAM）的下游。在PAM中存在的靶DNA，但不能靶向它的crRNA。2.1.3基因組編輯基因組編輯包括使用在與內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制一起使用的設(shè)計好的核酸，以從基因組DNA中的特定位置中插入，刪除或取代DNA序列。設(shè)計好的核酸酶在基因組中的特定位置誘導(dǎo)雙鏈斷裂（DSB），在這之后的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制通過非同源末端連接（NHEJ）或同源性定向修復(fù)修復(fù)斷裂。 II型CRISPR系統(tǒng)已被證明可作為在各種生物體，包括哺乳動物細(xì)胞的基因的編

6、輯工具。 （Mali1等人，2013;cong等人，2013）。 它由三部分組成：CRISPR相關(guān)Cas9核酸（雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶），靶互補(bǔ)CRISPR RNA（crRNA），和一個輔助反式激活crRNA（tracrRNA）。該crRNA和tracrRNA作為一個短導(dǎo)的RNA為目標(biāo)的Cas9核酸酶對特定基因組位點（圖1）。圖1 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的靶DNA裂解示意圖該crRNA和GENEART®CRISPR核酸載體的tracrRNA可以表示在一起為指導(dǎo)RNA，模仿在細(xì)菌系統(tǒng)自然crRNA-tracrRNA雜交。引導(dǎo)RNA的表達(dá)是由U6 polIII啟動型的啟動子（圖2）驅(qū)

7、動。在GENEART®CRISPR核酸載體圖2指南的RNA表達(dá)盒。該系統(tǒng)具有通用性，且易于使用，改變目標(biāo)專一只需要變更CRISPR RNA的設(shè)計即可。3 方法3.1 實驗輪廓下表和圖列出了創(chuàng)建你的GENEART®CRISPR核酸酶載體和表達(dá)它的細(xì)胞所需的步驟。步驟操作1設(shè)計的單鏈DNA寡核苷酸。 2退火單鏈寡核苷酸，以產(chǎn)生一個雙鏈寡核苷酸3稀釋雙鏈寡核苷酸對到工作濃度4克隆雙鏈寡核苷酸到CRISPR核酸載體上5轉(zhuǎn)化One Shot®化學(xué)感受態(tài)TOP10E.coli細(xì)胞，并選擇表達(dá)克隆6通過測序分析轉(zhuǎn)化子中存在的插入7制備純化的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)染所選擇的細(xì)胞系圖3 靶

8、定特異的ds寡核苷酸的克隆和分析退火編碼靶定特異的crRNA用T4 DAN連接酶克隆退火的oligo到線性化的Cas9 核酸酶報告載體上轉(zhuǎn)化到E.coli感受態(tài)細(xì)胞中，篩選想要的CRISPR克隆為基因編輯而進(jìn)行轉(zhuǎn)染、富集和篩選 3.2 設(shè)計單鏈DNA寡核苷酸 3.2.1 介紹 要使用GENEART®CRISPR核酸載體試劑盒，你首先需要設(shè)計帶有兩個單鏈DNA寡核苷酸突出段來與線性化的載體互補(bǔ); 一個編碼靶CRISPR RNA（正鏈寡核苷酸），而另一個與其互補(bǔ)（反向鏈寡核苷酸）。然后，將退火的頂部和底部鏈寡核苷酸，以產(chǎn)生一個雙鏈寡核苷酸（DS寡核苷酸）以適于克隆到試劑盒中提供的線性載體

9、中。 單鏈（ss）寡核苷酸的設(shè)計是兩個克隆過程的成功是至關(guān)重要的。一般準(zhǔn)則是提供在本節(jié)，以幫助您選擇了靶序列，并設(shè)計了ss的寡核苷酸。請注意，對于一個給定的靶基因，你可能需要產(chǎn)生和篩選多個crRNA序列，在其中找出一個在有效地裂解你的目標(biāo)基因位點是活躍的。3.2.2 選擇靶序列 當(dāng)執(zhí)行CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的DNA上的特定基因或基因位點雙鏈斷裂，您選擇靶序列可以顯著影響裂解觀察到的程度。當(dāng)選擇你的靶定序列時，我們推薦下面的指導(dǎo)方針。這些只是一般性建議;可能發(fā)生例外。長度：選擇的靶序列，從19到20個核苷酸長度的鄰近一個NGG原墊片相鄰的基序（PAM）的序列上的靶序列的3'末端。注意

10、：需要從U6 polIII啟動子轉(zhuǎn)錄起始的5'G是已經(jīng)包含在突出端，并且不需要被包括在靶序列中。 同源性：確保靶序列不包含顯著的同源性的其他基因，因為這可以增加脫靶效應(yīng)。最近發(fā)表的工作表明，指導(dǎo)gRNA-Cas9復(fù)合物有可能容忍高達(dá)1-3的不匹配。更多見解的選擇靶序列參見刊登的文章。 （Fu等，2013;。Mali2等人，2013）。 定位：您可以選擇靶序列編碼靶基因的有義序列或反義序列。因此，您可以在提供其符合在3'端PAM的需求兩個可能的方向產(chǎn)生CRISPR RNA。3.2.3 需要定向克隆的序列 選擇19-20個堿基對的靶序列后，繼續(xù)設(shè)計crRNA特異性寡核苷酸引物。 重

11、要！在寡核苷酸引物中不包括PAM序列。 要啟用DS的定向克隆寡核苷酸進(jìn)入GENEART®CRISPR核酸載體，你必須添加以下5個核苷酸到相應(yīng)的ss寡核苷酸的3'端： 上鏈低聚核苷酸 加入GTTTT到所述寡核苷酸的3'末端。該GTTTT是互補(bǔ)的突出端序列，CAAAA，在線性CRISPR核酸載體（參見圖3），并構(gòu)成tracrRNA的前5個堿基。底鏈寡核苷酸：底部鏈寡核苷酸應(yīng)該是靶序列的反向互補(bǔ)。加CGGTG到所述寡核苷酸的3'末端。這個序列是互補(bǔ)的突出端序列，CACCG，在線性GENEART®CRISPR核酸載體（參見圖3），并構(gòu)成U6啟動子的最后4個堿

12、基和所需polIII啟動轉(zhuǎn)錄起始位點的第一個堿基。退火兩條單鏈寡核苷酸產(chǎn)生帶有為克隆入GENEART®CRISPR核酸載體合適末端的雙鏈寡核苷酸。3.2.4 制備雙鏈寡核苷酸3.2.41 介紹 退火每單鏈寡核苷酸的相等量，以產(chǎn)生一個雙鏈（ds）的寡核苷酸。 退火后，稀釋ds等分寡核苷酸從50M到5nm的工作濃度。 3.2.42所需材料 正向鏈寡核苷酸（200uM的水或TE緩沖液） 反向鏈寡核苷酸（200微米的水或TE緩沖液） 50uM的庫存的ds對照寡核苷酸（融冰） 10X寡核苷酸退火緩沖液 DNA酶/ RNA酶的水（用試劑盒中提供） 1.5毫升無菌離心管 95熱塊3.2.43 退火

13、過程 1、在室溫下在干凈的微量離心管中加入以下試劑。 正鏈寡核苷酸（200微米） 5微升 反向鏈寡核苷酸（200微米） 5微升10X寡核苷酸退火緩沖液 2L DNA酶/ RNA酶的水 8L 總量 20L2，重新退火的DS克隆控制寡。短暫離心（5秒），轉(zhuǎn)移5L到一個干凈的離心管中，然后繼續(xù)下一個步驟。注意：此過程也適用于當(dāng)重新退火等50uM 的ds寡核苷酸。3，在加熱塊孵育管中于95進(jìn)行4分鐘。4，從散熱塊中取出管，并讓反應(yīng)混合物冷卻至25進(jìn)行5-10分鐘。5，離心管短暫（約5秒）。輕輕混勻。6，繼續(xù)進(jìn)行稀釋雙鏈寡核苷酸對于長期儲存，保持50MDS寡核苷酸貯備液在-20°C。3.2.4

14、4準(zhǔn)備稀釋的雙鏈寡核苷酸 單鏈寡核苷酸和克隆控制寡核苷酸退火后，進(jìn)行兩個稀釋：50M的ds100倍連續(xù)稀釋寡核苷酸庫存，制備500nM的DS寡核苷酸原液（100倍稀釋），和一個為5nM的ds寡核苷酸工作溶液（10,000倍稀釋）。 準(zhǔn)備500 nM的原液 準(zhǔn)備一個500uM 的ds寡核苷酸原液稀釋50MDS寡核苷酸庫存100倍。 1，混合下列試劑在一個干凈的離心管中： 50M ds寡核苷酸庫存 1LDNA酶/ RNA酶的水 99L總量100L2，旋渦混勻。對于長期儲存，保持500 nM的DS寡核苷酸貯備液在-20°C。3.2.45 準(zhǔn)備5 nM的工作液 準(zhǔn)備一個5 nM的ds通過稀釋

15、500 nM的DS寡核苷酸原液100倍寡核苷酸工作液。 注意：為5nM的ds 寡核苷酸工作溶液不適于長期儲存，并應(yīng)在每次新鮮制備。 1，混合下列試劑在一個干凈的離心管中： 500 nM的DS寡核苷酸溶液 1L； 10X寡核苷酸退火緩沖液 10L ；DNA酶/ RNA酶的水 89L； 總成交量 100L 2，旋渦混勻。處理雙鏈寡核苷酸的溶液 在冰上解凍冷凍的ds寡核苷酸的溶液。 切勿加熱或允許的ds寡核苷酸溶液溫度上升高于室溫。 ds的加熱寡核苷酸中部分變性的溶液的效果，并且在克隆效率的降低。 o如果500nM的儲備液，或5 nM的工作液溫度過高，準(zhǔn)備新的稀釋溶液。 o如果50MDS寡核苷酸庫存

16、變熱，再退火的寡核苷酸。3.2.46 處理雙鏈寡核苷酸溶液解凍冷凍DS寡核苷酸在冰上的溶液。切勿加熱或允許的DS寡核苷酸溶液溫度上升高于室溫。ds的加熱寡核苷酸中部分變性的解決方案的效果，并且在克隆效率的降低。o如果500nM的儲備液，或5 nM的工作液溫度過高，準(zhǔn)備新的稀釋溶液。o如果50uM的ds 寡核苷酸庫存變熱，再退火寡核苷酸。4 連接反應(yīng)4.1 介紹 一旦你生成你的ds寡核苷酸，并準(zhǔn)備相應(yīng)的儲備液，克隆ds寡核苷酸進(jìn)入GENEART®CRISPR核酸載體。 4.2 所需材料 雙鏈寡核苷酸（5uM的1X寡核苷酸退火緩沖液，在解凍后使用冰） 雙鏈控制寡核苷酸（5uM的1X寡核苷

17、酸退火緩沖液，在解凍后使用冰） 線性GENEART®CRISPR核酸向量（使用前解凍冰） 5X連接緩沖液（用試劑盒中提供） DNA酶/ RNA酶的水（用試劑盒中提供） T4 DNA連接酶（與試劑盒中提供）4.3 對照我們建議，包括試劑盒提供的陽性對照在你的結(jié)扎實驗DS控制寡核苷酸。在DS控制的寡核苷酸被提供作為在1X寡核苷酸退火緩沖液為50M的股票，并且需要被重新退火和稀釋10,000倍的連接反應(yīng)使用之前。如果你想有一個陰性對照，建立一個單獨(dú)的連接反應(yīng)，但省略了DS寡核苷酸。4.4 連接步驟在室溫下對于每個ds寡核苷酸被克隆的建立具有20L的連接反應(yīng)。1、按照顯示的順序加入下列試劑到

18、一個干凈的離心管中： 5X連接緩沖液 4L線性GENEART®CRISPR核酸載體 2LDS寡核苷酸（5納米） 2LDNA酶/ RNA酶的水 11LT4 DNA連接酶 1L總量 20L2、混合反應(yīng)：向上和向下吹打。注：PEG的存在和甘油（由連接緩沖液和T4 DNA連接酶提供）將造成反應(yīng)混合物的粘性。一定要通過上下吹打調(diào)勻反應(yīng)。不要旋渦。3，孵育10分鐘，在室溫下（25-27）。注意：孵育時間可以延長到2小時，并可能導(dǎo)致較高的產(chǎn)率的菌落。4，置于冰上反應(yīng)，并進(jìn)行TransformOne shot®TOP10感受態(tài)大腸桿菌。注意：您可以儲存剩余的連接反應(yīng)在-20過夜2.5 轉(zhuǎn)化

19、感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞 2.5.1 介紹 一旦你已經(jīng)完成了連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化One Shot®TOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌與由此產(chǎn)生的CRISPR核酸結(jié)構(gòu)。 One Shot®TOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌是理想的高效率克隆和質(zhì)粒傳播。他們允許高拷貝數(shù)質(zhì)粒穩(wěn)定復(fù)制。 TOP10細(xì)胞的基因型是類似于DH10B菌株。 為每個連接反應(yīng)， One Shot®TOP10大腸桿菌需要一管。2.5. 2 所需材料 連接反應(yīng)（從第4步，第8頁） （可選）pUC19控制（帶試劑盒中提供） One Shot®TOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞（用試劑盒中提供） S.O.C.培養(yǎng)基（暖至

20、室溫后再使用） 含有100微克/毫升氨芐青霉素的LB平板（2個：為每個轉(zhuǎn)化;溫暖，在37，30分鐘） 42水浴 37振蕩和非振蕩培養(yǎng)箱2.5. 3 One Shot®TOP10轉(zhuǎn)化程序1，解凍One Shot®TOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌，并繼續(xù)進(jìn)行下一步的細(xì)胞解凍后立即使用。2，添加連接反應(yīng)3L（從第4步，第8頁）One Shot®TOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌的小瓶中，并通過渦旋或輕敲管輕輕輕輕混勻。不要上下吹打混勻。注意：如果執(zhí)行陽性對照的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化1L的的pUC19質(zhì)粒。3，將管立即放置在冰上，并孵育10-30分鐘。注意：長時間孵育似乎對轉(zhuǎn)化效率的影響最

21、小。在培養(yǎng)的長短是在用戶的決定。4，熱激細(xì)胞30秒，在42°C，無晃動。5，緊隨管轉(zhuǎn)移到冰。6，加入250L的的室溫S.O.C.培養(yǎng)基。7，蓋上管緊密，搖管水平（200轉(zhuǎn)），在37下1小時。8，差價50微升來自于含有100微克/毫升氨芐青霉素的一個預(yù)熱的LB瓊脂平板上的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。鍍上的第二預(yù)熱的LB瓊脂平板上反應(yīng)的剩余部分。過夜孵育所述板在37下注意：我們建議放置兩種不同的體積，以保證至少有一個板具有良好的間距菌落。如果你正在改變的pUC19對照，在含100g/ mL氨芐青霉素的預(yù)熱的LB平板放置20-100L的轉(zhuǎn)化。9，一個高效的連接反應(yīng)可在總共產(chǎn)生了100個的菌落。挑選5-10菌

22、落進(jìn)行分析（見分析轉(zhuǎn)化，第10頁）。34 分析轉(zhuǎn)化子341確認(rèn)陽性克隆通過測序在陽性轉(zhuǎn)化子中確認(rèn)ds寡核苷酸插入的身份。分析每個CRISPR核酸結(jié)構(gòu)來驗證：該DS寡核苷酸插入存在，并且在正確的方向該ds寡核苷酸插入有正確的序列注：限制分析是推薦的，由于ds寡核苷酸插入的小尺寸。342 分析轉(zhuǎn)化子1，在含有100微克/毫升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37下挑選5-10個氨芐青霉素抗性菌落并培養(yǎng)它們過夜2，使用您選擇的方法提取質(zhì)粒DNA。我們建議使用的PureLink®HQ迷你質(zhì)粒純化試劑盒。3，進(jìn)行使用U6正向引物（與試劑盒提供）的CRISPR核酸結(jié)構(gòu)的測序。4，制作所需的CRISPR核酸

23、表達(dá)質(zhì)粒的甘油庫存（見長期儲存）。5，繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染（第11頁）。343 測序指導(dǎo)如果一個特定的CRISPR核酸結(jié)構(gòu)是很難順序，遵循這些建議，以改進(jìn)的結(jié)果： 使用高品質(zhì)，純化的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序。我們建議使用的PureLink®HQ迷你質(zhì)粒純化試劑盒（貨號K2100-01）制備DNA。 添加DMSO，測序反應(yīng)，以5的最終濃度。 增加模板的測序反應(yīng)（至正常濃度的兩倍）的使用量。 在你的測序反應(yīng)使用的dITP：三磷酸的7:1摩爾比。344 長期儲存 一旦正確的CRISPR核酸構(gòu)建體被識別，甘油庫存用于長期存儲。1，在含有100微克/毫升氨芐青霉素的LB平板在原始菌落上加上f 的條紋，孵育過

24、夜在37°C 2，分離單個菌落，接種于1-2毫升含100g/ mL的氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中。3，在37°C，直到培養(yǎng)物達(dá)到穩(wěn)定期。4，混合0.85毫升培養(yǎng)與0.15毫升無菌甘油和轉(zhuǎn)移到離心管。5，存放甘油于-803.5 哺乳動物細(xì)胞系轉(zhuǎn)染 3.51 轉(zhuǎn)染的方法 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞系的方法包括磷酸鈣（Chen和Okayama，1987;。Wigler等人，1977），脂質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)（Felgner等人，1989; Felgner和Ringold，1989），以及電穿孔（儲等。 對于范圍廣泛的哺乳動物細(xì)胞系的高效率轉(zhuǎn)染，我們建議使用陽離子脂質(zhì)為基礎(chǔ)的脂質(zhì)體®20

25、00試劑（貨號11668-027）（Ciccarone等，1999）。 ，1987; Shigekawa和道爾，1988）。 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的最佳方法查閱相關(guān)文獻(xiàn)或者供應(yīng)商。要特別注意培養(yǎng)基的要求，何時傳遞細(xì)胞，以及在什么稀釋分裂細(xì)胞。3.52 質(zhì)粒制備的轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞質(zhì)粒DNA必須是純凈，不受苯酚和氯化鈉的污染。我們建議您使用高品質(zhì)的maxi 準(zhǔn)備的DNA用于轉(zhuǎn)染。商店質(zhì)粒DNA庫存在-20°C。3.53轉(zhuǎn)染指引以下一般原則，建議在一個標(biāo)準(zhǔn)的6孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染®2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染與大多數(shù)細(xì)胞系。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天種子細(xì)胞達(dá)到70的匯合。注：結(jié)果將隨與細(xì)胞類型接種密度而變化。有3

26、微克CRISPR/Cas9表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染執(zhí)行。注意：結(jié)果將依賴于細(xì)胞類型和傳代數(shù)量，和脂質(zhì)：DNA的最適濃度取得最佳效果是需要的。富集的種群使用任何OFP或CD4報告轉(zhuǎn)GENEART®CRISPR核酸載體的詳細(xì)信息，請參閱附錄B（第18頁）。3.54 對照我們建議您包括陽性對照和陰性對照（模擬轉(zhuǎn)染）在實驗來評估你的的結(jié)果。3.55 故障排除 觀察的現(xiàn)象原因解決方法選擇性平板獲得的氨芐青霉素抗性菌落數(shù)少 單鏈寡核苷酸設(shè)計不正確對于克隆到GENEART®CRISPR核酸載體，確保每個單鏈寡核苷酸3'末端包含5個核苷酸頂部鏈寡核苷酸：包括3'端GTTTT。 底部鏈

27、寡核苷酸：包括3'端CGGTGDS寡核苷酸降解 存放5 nM的DS寡核苷酸股票在1X寡核苷酸退火緩沖液。 避免重復(fù)冷凍/解凍循環(huán)。分裝在5 nM的DS寡核苷酸庫存并儲存于-20°C。寡核苷酸退火反應(yīng)效率低 確保按照指示（第6頁）進(jìn)行退火反應(yīng)。 如果環(huán)境溫度>25°C至27°C，在25培養(yǎng)箱中孵育退火反應(yīng)。4附錄A GENEART®CRISPR核酸載體的圖譜和特點41 GENEART®CRISPR核酸載體下圖顯示了GENEART®CRISPR核酸載體的功能。該載體被提供線性化的核苷酸在7335和7356（CD4）或6732

28、和6752（OFP）與每條鏈上所指示的5個堿基對的3'突出端。載體的完整序列是可以從我們的網(wǎng)站（）下載或聯(lián)系技術(shù)支持（請參見第16頁）GENEART®CRISPR核酸載體的特點 GENEART®CRISPR核酸酶載體（9822 bp的CD4和9219 bp的OFP）包含以下元素。所有的特點進(jìn)行了功能性測試和載體的完全測序特點優(yōu)點tracrRNA輔助反式激活crRNA允許載入Cas9核酸到gRNA復(fù)制的F1原點復(fù)制起點pA TK聚腺苷酸化信號CD4基于富集的微珠報告基因，當(dāng)用熒光標(biāo)記的抗CD4抗體（睫狀體等人，1995）染色，可用于監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率OFP基于分選的流式細(xì)胞

29、儀報告基因，熒光蛋白質(zhì)也可用于監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率2A肽連接 一種自我裂解肽接頭物，可以將CD4或OFP報道基因連接到Cas9核酸酶的C-末端。緊接翻譯，2A肽側(cè)翼的彼此分隔。CMV啟動子允許Cas9核酸酶和CD4或OFP報告基因的表達(dá)人U6啟動子允許RNA聚合酶 - 依賴的指導(dǎo)RNA（gRNA）的表達(dá)U6正向引物位點 允許插入片段的測序3'突出端 允許感興趣的雙鏈寡核苷酸的連接酶介導(dǎo)的定向克隆聚合酶III終止子可有效終止的RNA聚合酶III-依賴的轉(zhuǎn)錄氨芐青霉素抗性基因 允許在大腸桿菌中選擇質(zhì)粒pUC的復(fù)制起點在大腸桿菌中允許高拷貝和維持5.附錄B GENEART®CRISPR核酸

30、酶表達(dá)細(xì)胞富集5.1 介紹GENEART®CRISPR核酸載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（與OFP或CD4記者）的種群可以使用熒光激活細(xì)胞分選（FACS）富集，或者在CD4報告基因載體的情況下，采用Dynabeads®CD4磁珠。5.2 流式細(xì)胞儀富集請遵循以下準(zhǔn)則，以富集轉(zhuǎn)染有GENEART®CRISPR核酸酶（OFP記者）載體的細(xì)胞：收獲活的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，為正在使用的細(xì)胞系重懸在FACS緩沖液。例如，0.2微米的無菌過濾的FACS緩沖液（1X PBS中含有1mM EDTA，25mM的HEPES，1FBS），可以很好地用于粘附細(xì)胞系，如HEK 293。OFP有548 nm的峰值激

31、發(fā)和560 nm發(fā)射。o一個488 nm激光被推薦用于高效率的激發(fā)。o標(biāo)準(zhǔn)530/30, 574/26 和 603/48 發(fā)射器被推薦用于檢測。最優(yōu)收集緩沖器，將取決于所選擇的下游應(yīng)用，但含2FBS和FACS緩沖液（見上文）的RPMI培養(yǎng)基都是可行的方案。 。圖1 由GENEART®CRISPR核酸OFP載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞時由488激光激發(fā)，并通過不同的檢測器測得的MFI（平均熒光強(qiáng)度）請遵循以下準(zhǔn)則，以豐富GENEART®CRISPR核酸酶（CD4報告）轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞：收獲活轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，為正在使用的細(xì)胞系重懸在FACS緩沖液。染色細(xì)胞與CD4抗體結(jié)合到你所選擇的熒光團(tuán)（根據(jù)制造商的說明）。一旦染色，GENEART®CRISPR核酸酶（CD4報告）載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以通過流式細(xì)胞儀（見上文）富集。5.3使用CD4磁珠富集 GENEA