中南大學生物科學與技術(shù)學院分子生物學研究中心

1、中南大學生物科學與技術(shù)學院分子生物學研究中心教 案授課科目: 醫(yī)學分子生物學授課內(nèi)容: 疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)授課對象：臨床醫(yī)學七年制、八年制授課時數(shù)：4 學時授課教師：授課地點：湘雅醫(yī)學院新教學區(qū)授課時間：授課教材：醫(yī)學分子生物學（21世紀高等院校教材），胡維新主編，北京：科學出版社，2007年2月，第一版；醫(yī)學分子生物學（衛(wèi)生部8年制規(guī)劃教材），馮作化主編，北京： 人民衛(wèi)生出版社，2005，第一版第十一章 疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)一、目的求：掌握：基因突變的概念、類型及特點。熟悉：基因突變的發(fā)生機制；疾病相關(guān)基因的研究策略。了解：基因突變與疾病發(fā)生；血紅蛋白病等常見單基因病的發(fā)病分子機制。二、講授重

2、點： 基因突變的類型及特點。三、講授難點： 基因突變的分子機制。四、教學方法：多媒體教學、板書五、教 具：多媒體課件、多媒體設(shè)備、電子光標筆、粉筆、黑板、教材六、講授內(nèi)容： 第一節(jié) 基因結(jié)構(gòu)改變引起疾病一、基因結(jié)構(gòu)改變: 在基因的特定DNA序列中，其堿基組成及排列順序可因機體內(nèi)外因素的作用發(fā)生改變，導致DNA一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，改變基因結(jié)構(gòu)，形成基因突變（mutation）。如果基因突變使蛋白質(zhì)發(fā)生了質(zhì)的改變，即理化性質(zhì)、生物化學性質(zhì)、免疫學性質(zhì)及生物學功能的改變，或使蛋白質(zhì)量的改變超過了生理范圍，就會導致疾病的發(fā)生?；蛲蛔兊亩喾N類型：點突變是單個堿基的改變；可分為轉(zhuǎn)換（transition）

3、和顛換（transversion）兩種。轉(zhuǎn)換指同類型堿基之間的取代，即一種嘧啶堿基被另一種嘧啶堿基取代或一種嘌呤堿基被另一種嘌呤堿基取代形成的點突變。顛換指不同類型堿基之間的取代，即一種嘧啶堿基被一種嘌呤堿基取代或一種嘌呤堿基被一種嘧啶堿基取代形成的點突變。缺失（deletion）是一個或多個核苷酸的丟失；插入（insertion）是一個或多個核苷酸的增加；倒位是一段核苷酸序列方向倒轉(zhuǎn)：基因內(nèi)部的DNA序列可發(fā)生重組，使一段DNA序列的方向反置，如由原來的53方向排列整段倒置為35方向排列，或一段DNA序列在基因內(nèi)部位置遷移，使基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成的突變稱為倒位。 基因突變還分為配子突變與體

4、細胞突變；動態(tài)突變指串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)隨世代的傳遞而改變。二、基因突變的遺傳效應(yīng)不同的基因突變引起不同的遺傳效應(yīng)。(1)堿基置換突變(substitution mutation) a. 同義突變 (consense mutation or silent mutation) b. 錯義突變 (missense mutation) c. 無義突變 (nonsense mutation) d. 終止密碼子突變或延長突變 (terminator codon mutation or elongation mutation) e. 起始密碼子突變(initiation codon mutation) f. 非

5、編碼序列點突變(point mutation in noncoding sequence)例如：無義突變是突變后產(chǎn)生縮短的多肽鍵使它所編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生改變；錯義突變：由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變?yōu)闆Q定另一種氨基酸的密碼子的基因突變叫錯義突變。這種基因突變有可能使它所編碼的蛋白質(zhì)部分或完全失活，例如人血紅蛋白鏈的基因如果將決定第6位氨基酸（谷氨酸）的密碼子由CTT變?yōu)镃AT，就會使它合成出的鏈多肽的第6位氨基酸由谷氨酸變?yōu)槔i氨酸，從而引起鐮刀形細胞貧血病。(2) 缺失或插入突變(deletion or insertion mutation) a. 密碼子缺失或插入(co

6、don deletion or codon insertion) b. 移碼突變(frame-shift mutation) c. 整基因或大片段缺失 (deletion of a whole gene or a large segment) (3) 融合突變(fusion mutation) 細胞減數(shù)分裂時同源染色體不等交換而致基因間錯位配對， 產(chǎn)生兩種含不同等位基因的染色體。 (4) 基因突變影響 hnRNA 的剪接基因突變發(fā)生在 hnRNA 的一級結(jié)構(gòu)上特定的剪接位點上，導致 hnRNA 的剪接錯誤，產(chǎn)生異常的 mRNA，最終產(chǎn)生異常的蛋白表達產(chǎn)物，改變生物性狀。三、結(jié)構(gòu)基因改變導致蛋白

7、質(zhì)變化引起疾病： 血紅蛋白病的類型、特點與結(jié)構(gòu)基因的變化關(guān)系、珠蛋白(globin)基因的時、空特異性表達。血紅蛋白結(jié)構(gòu)：1. 血紅蛋白是由4條肽鏈（兩個和兩個鏈）組成的。每條肽鏈都類似于肌紅蛋白的肽鏈，都結(jié)合一個血紅素。2. 血紅蛋白的脫氧（T）和氧合（R）構(gòu)象在氧的親和性方面有很大區(qū)別。由于結(jié)構(gòu)上的相互作用是與它的三級和四級結(jié)構(gòu)有關(guān)，所以血紅蛋白在結(jié)合氧的過程中顯示出別構(gòu)效應(yīng)和協(xié)同性。3. 人類珠蛋白基因有典型的真核基因結(jié)構(gòu)特點。珠蛋白基因包括已鑒定的8個功能基因、3個假基因及一個新發(fā)現(xiàn)的基因。它們在染色體上成簇排列。珠蛋白基因的表達在時空上受到遺傳因素的精確調(diào)控。 血紅蛋白分子一級結(jié)構(gòu)上

8、的輕微差別就可能導致功能上的很大不同，正常成年人血紅蛋白中的鏈的第六位的谷氨酸殘基被纈氨酸取代就會導致鐮刀形細胞貧血病的異常血紅蛋白HbS 的生成。(1) 人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因結(jié)構(gòu)(2) 人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因結(jié)構(gòu) (按圖例講解) 血紅蛋白病類型： 異常血紅蛋白: 珠蛋白結(jié)構(gòu)(質(zhì))變異，導致貧血。 地中海貧血: 珠蛋白合成(量)減少，又稱珠蛋白合成障礙性貧血。 鐮狀紅細胞貧血癥是一種常染色體退化遺傳病。引起鐮狀紅細胞貧血癥的原因就是珠蛋白基因的第6位密碼子點突變，即編碼血紅蛋白鏈上一個決定谷氨酸的密碼子GAG變成了GTG，使得鏈上的谷氨酸變成了纈氨酸，引起血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生

9、了根本的改變（圖11-1）。與正常血紅蛋白相比，該病患者的紅細胞由正常的圓盤形變成了鐮刀形。血紅蛋白基因上單個核苷酸的替換（AT），恰好使該基因片段丟失了可被限制性內(nèi)切酶Mst II酶切開的一個位點CCTNAGG序列（N代表四個堿基中的任意一個）。由于基因突變改變了限制性酶切的結(jié)果，可用Southern印跡雜交分析方法和限制性片段長度多態(tài)性(簡稱RFLP)分析方法，對鐮狀紅細胞貧血癥胎兒進行產(chǎn)前診斷，或?qū)Πl(fā)病家族成員的基因型進行分析。圖11-1 鐮狀紅細胞貧血癥珠蛋白基因突變方框內(nèi)突變的核苷酸另常見單基因病如囊性纖維化病(cystic fibrosis, CF)舉例。囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)蛋白

10、(CFTCR)的基因突變所致，產(chǎn)生缺陷型蛋白，致使使氯離子的轉(zhuǎn)運障礙，黏液在呼吸道黏膜內(nèi)淤滯，黏膜形成囊性增生，造成呼吸道堵塞；因反復(fù)感染，導致患者呼吸衰竭而死亡。發(fā)病頻率(0.4 )，常染色體隱性遺傳；致病基因CFTR；典型癥狀：進行性肺損傷及其他。Gene therapy of CF：將重組CFTCR基因cDNA-病毒載體，用涂布鼻腔、或噴霧吸入氣管及肺部等方法，轉(zhuǎn)入患者呼吸道上皮細胞中，獲得正常CFTCR基因的表達，糾正Cl轉(zhuǎn)運缺陷，減少黏液分泌。病理生理變化過程：（如圖）四、調(diào)控序列變異導致基因表達水平變化基因調(diào)控序列也稱順式作用元件，是基因的重要組成部分，雖然其遺傳信息不會被表達傳遞

11、到蛋白質(zhì)的肽鏈中去，基因調(diào)控序列的突變也不會改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，但調(diào)控序列的突變會改變基因的表達強度，引起蛋白質(zhì)生物合成量的改變。這種量的改變超過一定的范圍，同樣會導致蛋白質(zhì)功能的紊亂，引起相應(yīng)的疾病。珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游30（-30）處有TATA盒、-90及-105處有CACACCC序列，它們都是珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，如TATA盒調(diào)控正常的轉(zhuǎn)錄起始及其效率。這些調(diào)控序列如果發(fā)生基因突變，就會使珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄效率降低，珠蛋白合成減少，引起-地貧。不僅是調(diào)控序列變異能影響基因的表達，使相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成減少，一些內(nèi)含子的變異也會影響蛋白質(zhì)的合成，使體內(nèi)相應(yīng)蛋白質(zhì)含量減少或缺失。第二節(jié)

12、 細胞間異常信號導致基因表達異常正常的細胞間信號，能保證基因表達的正常時間特異性、空間特異性以及正常的表達水平。相反，錯誤的細胞間信號，會破壞基因表達的時間特異性和空間特異性，使胚胎后細胞合成胚胎型蛋白質(zhì)、或使一種細胞合成另一種細胞特有的蛋白質(zhì)，還會使基因表達水平過高或過低，這些都會導致疾病的發(fā)生。細胞間信號異常導致基因表達異常從而引起疾?。喝梭w各細胞間通過激素、神經(jīng)遞質(zhì)、旁分泌信號等保持細胞間的聯(lián)系，調(diào)節(jié)彼此的代謝?；虮磉_也受到細胞間信號的調(diào)控。例如AFP接受異常的細胞增殖信號成為肝癌發(fā)生的重要因素。甲胎蛋白（AFP）是一種具有胚胎時間表達特異性的蛋白質(zhì)，胚胎發(fā)育過程中，AFP的增強子始終

13、處于激活狀態(tài),而沉寂子處于抑制狀態(tài),因此增強子的信號可以順利到達啟動子啟動AFP基因，AFP基因大量表達。AFP具有免疫抑制作用,可以保護胎兒免受母體的免疫攻擊。胎兒出生后,沉寂子活化,阻礙了增強子的啟動效應(yīng),使AFP表達受到抑制。但在異常細胞增殖信號的作用下，c-myc、c-fos和c-jun等癌基因表達異常增加，其表達產(chǎn)物與AFP基因順式作用元件相結(jié)合，激活A(yù)FP基因的表達，重新大量合成AFP。大量合成的AFP通過細胞膜上AFP受體介導,影響淋巴細胞或肝癌細胞的腫瘤壞死因子（TNF）家族及其受體的表達,導致肝癌細胞逃避機體免疫監(jiān)視,同時又能促進癌基因表達,引起肝癌細胞大量生長。可見，由于肝

14、細胞接受了異常的細胞增殖信號，破壞了AFP表達的時間特異性，使AFP在胚胎后肝臟異常表達，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用。再如粉塵刺激的細胞間信號異常導致基因表達異常引起矽肺發(fā)生：粉塵刺激 肺支氣管上皮、肺泡巨噬細胞 分泌TGF-1成纖維細胞 促細胞分裂和ECM 蛋白基因表達 ECM 增加矽肺發(fā)生 可見，矽肺發(fā)生的重要分子機制是成纖維細胞獲得了異常的細胞間信號，使多種ECM蛋白質(zhì)基因的表達增強，相應(yīng)的蛋白質(zhì)合成和分泌增加，造成ECM在肺組織病理性蓄積，最終形成矽肺。第三節(jié) 細胞內(nèi)因素導致基因表達異常引起的疾病1 基因的表達不僅受基因本身結(jié)構(gòu)和細胞間信號的影響，也受一些細胞內(nèi)因素的影響，這

15、些影響達到一定的強度或超過一定的范圍，或破壞基因表達的時間特異性和空間特異性，或使基因表達水平過高或過低，均可導致疾病的發(fā)生。細胞內(nèi)因素導致基因表達異常引起疾?。?異常的細胞內(nèi)信號導致基因表達異常引起疾病 高血糖 DAG 激活PKC 激活 ACE Ang 異常的DNA甲基化導致基因表達異常引起疾病DNA甲基化導致基因表達變化是腫瘤形成的重要原因。腫瘤細胞與正常細胞比較，DNA 甲基化模式顯著不同。不同的DNA甲基化模式，會產(chǎn)生不同的基因表達譜?；虮磉_譜失去平衡，就會導致疾病發(fā)生，如原癌基因過度擴增、表達異常增強，或/和抑癌基因的“沉寂”，相應(yīng)表達產(chǎn)物減少甚至消失，都會使細胞增殖平衡受到破壞而

16、引起惡性腫瘤的發(fā)生。 hCG5' 轉(zhuǎn)錄起始區(qū)低甲基化非滋養(yǎng)層細胞hCG 受體結(jié)合 激活胞內(nèi)cAMP信號傳導途徑 調(diào)節(jié)腫瘤細胞的其他“生長因子、細胞因子”的產(chǎn)生，Tumor 病原生物基因的體內(nèi)表達導致疾病的三種方式第四節(jié) 翻譯后加工運輸障礙引起疾病在機體細胞內(nèi)，通過mRNA指導的蛋白質(zhì)生物合成將基因DNA序列中所含的遺傳信息表達于蛋白質(zhì)中，并通過蛋白質(zhì)的生物功能體現(xiàn)機體的生命活動。但是，即使沒有任何突變、所含遺傳信息完全正確，剛剛合成的、未成熟的蛋白質(zhì)沒有生物活性，不能正確地完成其生物學功能。要使新合成的蛋白質(zhì)具有完整的生物學活性，還需對其進行翻譯后加工，其方式包括：除去信號肽、基團修飾

17、、蛋白質(zhì)的折疊、亞基聚合、運輸至發(fā)揮功能的靶部位等。其中任何一個環(huán)節(jié)的障礙，都會使蛋白質(zhì)功能紊亂，導致疾病的發(fā)生。酪氨酸酶是黑色素細胞中催化黑色素生成的限速酶,在黑色素的生成過程中起著關(guān)鍵的作用。酪氨酸酶肽鏈合成后，需先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行折疊，再從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸至高爾基體進行糖基化加工,然后由運轉(zhuǎn)囊泡將其轉(zhuǎn)運至黑色素體發(fā)揮作用。多種蛋白質(zhì)（包括酶蛋白）參與了酪氨酸酶的這一成熟及轉(zhuǎn)運過程。所以，不僅酪氨酸酶本身的基因變異會使酪氨酸酶功能紊亂，參與酪氨酸酶成熟和轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)基因變異，也可以導致酪氨酸酶不能成熟或不能運輸至靶部位，使酪氨酸酶功能紊亂，黑色素合成障礙，導致一些色素病的發(fā)生。I型泛發(fā)性白化病就是一

18、種色素病,主要表現(xiàn)為眼、毛發(fā)、皮膚的色素缺失,易發(fā)生皮膚及眼部的腫瘤,由先天性酪氨酸酶基因缺陷引起。變異的酪氨酸酶蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊障礙是I型泛發(fā)性白化病的一種重要的分子機制。在酪氨酸酶的成熟及轉(zhuǎn)運過程中，一種被稱為P蛋白的蛋白質(zhì)起著重要的作用。P蛋白是一種含12跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白，參與酪氨酸酶蛋白從高爾基體到黑色素體的運輸。P蛋白基因突變，會使P蛋白的功能障礙，酪氨酸酶不能正確地轉(zhuǎn)運至黑色素體，導致酪氨酸酶功能紊亂，黑色素合成障礙，引起型泛發(fā)性白化病。第五節(jié) 蛋白質(zhì)降解異常引起疾病基因表達及蛋白質(zhì)合成是影響體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的重要因素，但不是唯一的因素。蛋白質(zhì)的降解也是調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的一個重

19、要因素，事實上，是蛋白質(zhì)的合成及降解之間的相對速度大小或量的多少決定體內(nèi)蛋白質(zhì)含量。某蛋白質(zhì)合成大于降解、則該蛋白在體內(nèi)的含量增加，反之亦然。一、 哺乳動物體內(nèi)蛋白質(zhì)降解有兩條基本途徑： 一是溶酶體，主要降解細胞吞入的胞外蛋白質(zhì)。 另一條是泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway；UPP），主要降解細胞內(nèi)泛素化的蛋白質(zhì)，是細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)依賴于ATP、非溶酶體途徑的蛋白質(zhì)降解通路,能高效并高度選擇性進行細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解,尤其降解半衰期短的功能蛋白、癌基因產(chǎn)物和變性、變構(gòu)蛋白等,應(yīng)急狀態(tài)下也降解細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白。二、 泛素-蛋白酶體途徑由泛素(ubiquitin

20、，Ub)、特異性泛素激活酶(ubiquitin- activating enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶( ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素連接酶( ubiquitin ligase，E3) 、蛋白酶體(proteasome) 組成，泛素-蛋白酶體途徑是在這些酶的順序作用下的底物蛋白泛素化過程及泛素化蛋白最后被降解為小肽。三、 在某些有害的環(huán)境，如氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和老化過程中，蛋白質(zhì)會受到損害而發(fā)生折疊錯誤；即使新合成的蛋白質(zhì)，在翻譯后修飾加工過程中，會發(fā)生異常裂解。 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)受損，蛋白質(zhì)從細胞內(nèi)降解清除，就會使其在細胞內(nèi)積聚，造成細胞功能障

21、礙、甚至死亡，引起相應(yīng)的疾病。 如果該系統(tǒng)功能異常增強，就會使一些正常功能或結(jié)構(gòu)蛋白被降解、導致蛋白質(zhì)的功能紊亂或細胞結(jié)構(gòu)破壞，引起疾病。一些蛋白質(zhì)，特別是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，它們在完成功能后，需及時被降解清除，以適應(yīng)機體代謝或其它功能調(diào)節(jié)的需要。這些調(diào)節(jié)蛋白的降解清除，也主要靠泛素-蛋白酶體系統(tǒng)來完成。如果該系統(tǒng)的功能異常，不能及時地降解清除這些調(diào)節(jié)蛋白，就會使這些調(diào)節(jié)蛋白持續(xù)地發(fā)揮作用，失去調(diào)節(jié)意義，導致機體功能紊亂，引起疾病。舉例1：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在維持正常載脂蛋白含量中起著重要的作用，該系統(tǒng)功能障礙，會導致載脂蛋白含量異常。Apo B100內(nèi)源性甘油三酯及膽固醇代謝中起著重要的作用，并直接

22、參與了血漿LDL 的清除，對維持正常的血漿LDL及LDL-膽固醇（LDL-C）水平具有十分重要的意義。用培養(yǎng)的倉鼠原代肝細胞建立肝脂質(zhì)代謝模型，發(fā)現(xiàn)大約40%新合成的apo B被泛素化并降解；在人的脂蛋白代謝模型中，脂質(zhì)核心再循環(huán)受到限制，原因是部分apo B 通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)被迅速降解。給予蛋白酶體抑制劑ALLN或MG132, apo B的多聚泛素化及降解都受到劑量依賴性抑制，提示蛋白酶體抑制劑可能抑制泛素化的apo B被降解。血漿apo E水平與動脈粥樣硬化的敏感性相關(guān),巨噬細胞源性的apo E可清除動脈壁的膽固醇而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。在RAW264.7單核巨噬細胞及HepG2細

23、胞轉(zhuǎn)入泛素使其過表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)apo E 明顯泛素化并降解, 而蛋白酶體抑制劑乳胱素可使apo E降解速率減慢，導致apo E聚集。舉例2：阿爾茨海默?。ˋD）是一種以進行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)的大腦變性疾病。其病理特征包括老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、海馬錐體細胞中顆?？张葑冃约把鼙诘矸蹣拥鞍壮练e。研究發(fā)現(xiàn), AD患者腦組織蛋白酶體活性的下降,尤其是在海馬、海馬旁回、顳上回、顳中回及頂下小葉,且蛋白酶體活性下降與其表達下降不一致,因此認為AD患者腦細胞蛋白酶體活性可能受到抑制。淀粉樣蛋白(amyloid protein，) 是細胞外淀粉樣斑的主要成分,并存在于神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)內(nèi),研究發(fā)現(xiàn)，

24、可選擇性地抑制20S 蛋白酶體糜蛋白酶樣活性,且在病理狀態(tài)下可通過抑制26S蛋白酶體活性來影響泛素依賴性蛋白的降解?？梢姡核?蛋白酶體系統(tǒng)的功能紊亂在AD的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。第六節(jié) 病原生物基因引起的疾病人體疾病可以由外源性基因，也就是病原生物的感染引起。由于不同的外源性基因各有特點，相應(yīng)病原生物的生活特性也各不相同，不同的病原生物基因引起人類疾病的機理也各有特點。 外源性基因通過病原生物的感染進入體內(nèi)，在人體的特定組織器官表達，病原生物得以生成、繁殖，引起機械或生物學損傷。 病原生物基因在人體內(nèi)大量表達，病原生物大量繁殖，與人體爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，造成人體營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，引起疾病。 病原生

25、物基因在人體表達，可產(chǎn)生生物毒素作用于人體細胞，使細胞的一些生理功能或代謝異常，引起疾病。 病原生物的基因還可以整合到人體基因組中，改變一些基因的結(jié)構(gòu)，或改變機體原有基因表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能、或改變機體原有基因的表達水平、或引起新的異常蛋白的表達，引起疾病的發(fā)生。第七節(jié) 疾病分子機制的研究策略針對如此復(fù)雜的疾病發(fā)生分子機制，對不同的疾病就要采取不同的研究策略。一、通過結(jié)構(gòu)分析確定基因變異在疾病發(fā)生中的作用基因結(jié)構(gòu)改變即基因突變是人類疾病發(fā)生的重要原因之一。對于由基因結(jié)構(gòu)改變引起的疾病，弄清其發(fā)病機制的基本策略是突變基因的結(jié)構(gòu)分析，并通過對突變基因的結(jié)構(gòu)分析找到致病突變。主要方法有：核糖核酸酶切

26、分析、雜合雙鏈分析、化學切割錯配、酶促切割錯配等。（講解課件上的圖例）1.核糖核酸酶切分析 基本原理: 在一定條件下，異源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中錯配堿基可被核糖核酸酶RNase識別并切割，通過凝膠電泳分析酶切片段的大小，即可確定錯配的位置。 Watterson et al., J Clin Microbiol (1998) Mutation scanning ； Cleave with RNase 1 and T1 (not RNase A)；Inner promoter primers SP6 and T7； Gel detection; could include i

27、sotope incorporation 缺點： 當RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割； 分析DNA的一條鏈，突變檢出率為 30%；同時分析DNA的兩條鏈，突變檢出率為 70%； 需要制備特異性的RNA探針2.雜合雙鏈分析法（heteroduplex analgsis, HA）直接在非變性凝膠上分離雜交的突變型-野生型DNA雙鏈。由于突變型和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成單鏈環(huán)形突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應(yīng)同源雙鏈DNA不同的遷移率?；瘜W切割錯配法（Chemical cleavage of mismatch, CCM）基本原理：將待

28、測含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或RNA片段混合變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯配的C能被羥胺和哌啶切割，錯配的T能被四氧化鋨切割，經(jīng)變性凝膠電泳可確定是否存在突變。 特點： 突變檢出率高； 如使用熒光檢測系統(tǒng)，靈敏度較高； 可檢測長度達 2Kb的核酸片段； 步驟多、費時、有毒； 碳化二亞胺檢測法3.酶促切割錯配 (enzyme mismatch cleavage ) polymorphisms can be identified by EMC in DNADNA heteroduplexes. T4 Endo nuclease VII Enzymes cleave adjace

29、nt to the mismatch and products are resolved via gel or capillary electrophoresis. the cleavage enzymes often nick complementary regions of DNA as well. ( increases background noise, lowers specificity, reduces the pooling capacity of the assay) 二、基因表達水平分析基因表達分析的主要方法包括Northern印跡雜交法、消減雜交技術(shù)、差異顯示法、定量RT

30、-PCR、基因表達芯片、基因表達系列分析技術(shù)等，在這里主要討論差異顯示法、消減雜交技術(shù)和基因表達系列分析技術(shù)。1. 差異顯示技術(shù)(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR) 指在不同的生長時期、在個體的發(fā)育與分化的不同階段、在生物體對疾病的反應(yīng)以及不同的環(huán)境下調(diào)控基因的表達是不同的，這就是基因的差別表達（differential expression）。原理：利用兩組特殊的引物對差別表達的基因進行擴增。3端引物：利用mRNA的poly A尾巴設(shè)計。根據(jù)mRNA結(jié)構(gòu)分析知道，poly A尾巴之

31、前的兩個堿基只有12種可能的排列組合：根據(jù)這12種排列組合，設(shè)計12種不同的引物，這樣就將所有mRNA分成了12組。這些引物由1112個T及兩個其它的堿基組成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。這種引物稱錨定引物。5端引物：5端為10個堿基（10-mer）組成的隨機引物。每一個隨機引物都可能與總mRNA中的某一些分子發(fā)生雜交，雜交位點也可能在mRNA的不同位點上。用一種3錨定引物和一種5隨機引物進行擴增，可獲得50100條100500bp的DNA擴增帶。為了要尋找更多的DNA差異帶，應(yīng)使用全部的12種錨定引物以及盡可能多的5隨機引物。

32、2. 抑制性差減雜交 (suppressive subtractive hybridization, SSH)基本原理：SSH是差減雜交與PCR結(jié)合的快速分離差異基因的方法。運用雜交動力學原理，豐度高的單鏈DNA退火時產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA，使不同豐度的單鏈DNA得到均衡；抑制PCR利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點，使非目的基因片段兩端反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補結(jié)構(gòu), 無法作為模板與引物配對，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增，從而使目的基因得到富集、分離。方法：提取實驗組和對照組mRNA合成雙鏈cDNA，經(jīng)識別 4 堿基的限制性內(nèi)切酶切割；實驗組cDNA平均分為2

33、份，分別連接2個接頭；進行2輪差減雜交和抑制性PCR；獲得富集的目的基因。 優(yōu)點 采用兩次差減雜交和PCR，保證了高特異性 (假陽性率可降至 6); 在雜交過程中可使不同豐度基因均衡化，獲得低豐度差異 表達基因;操作相對簡便，是目前分離新基因的主要方法。 缺點 起始材料需要 mg 級量mRNA; SSH差減克隆片段較小，獲取 cDNA全長序列有一定難度。3. 基因表達系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)是一種用于定量、高通量基因表達分析的實驗方法(Velculescu et al., 1995)。SAGE原理: 分離每個轉(zhuǎn)錄本的特定位置的

34、較短的單一的序列標簽（約9-14個堿基對），這些短的序列被連接、克隆和測序，特定的序列標簽的出現(xiàn)次數(shù)就反應(yīng)了對應(yīng)基因的表達豐度。三、基因功能研究以確定基因在疾病中的作用弄清基因的生物學功能，才能明確基因在疾病發(fā)生中的具體作用、弄清疾病發(fā)生的分子機制。常用的基因功能分析策略包括轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除技術(shù)、反義技術(shù)、基因誘導超表達技術(shù)和RNA干擾技術(shù)等。（一）轉(zhuǎn)基因技術(shù)確定基因在疾病中的作用轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過的外源基因?qū)肱囵B(yǎng)細胞和/或生物體內(nèi)，通過導入基因的表達改變細胞或生物體的性狀，形成性狀的可遺傳性修飾。通過對這些性狀改變的分析，就能了解導入基因的生物學功能。舉例:如有人用大鼠彈力

35、蛋白酶I基因的增強子與激活的H-ras基因重組成融合基因并導入小鼠，制備的轉(zhuǎn)基因小鼠幾乎100%都產(chǎn)生胰腺癌。用這種方法直接證明了原癌基因的突變是腫瘤發(fā)生的重要原因。用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究基因的功能或確定基因在疾病中的作用可以在細胞水平進行，也可以通過轉(zhuǎn)基因動物在整體水平進行，基本策略都是細胞的基因轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染基因包括質(zhì)粒DNA、RNA和寡核苷酸。轉(zhuǎn)染分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染將外源基因?qū)胨拗骷毎藘?nèi)但不整合到染色體中；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不僅將外源基因?qū)胨拗骷毎藘?nèi)，還將其整合到宿主細胞的染色體中或形成附加體。轉(zhuǎn)染的方法有物理方法(如電穿孔法)、化學方法(如磷酸鈣法、陽離子脂質(zhì)體法、非脂質(zhì)體脂類法)和

36、生物學方法(如逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒介導法)。非脂質(zhì)體脂類轉(zhuǎn)染試劑對一些細胞的毒性比一般陽離子脂質(zhì)體的要小,可提高轉(zhuǎn)染效率和擴大使用細胞的范圍。影響轉(zhuǎn)染效率的因素較多，如培養(yǎng)細胞的密度、核酸（外源基因）的用量、核酸與轉(zhuǎn)染試劑的比例、轉(zhuǎn)染時間、轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時間等；所以，要獲得理想的轉(zhuǎn)染效率，通常要對這些轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染的因素：細胞培養(yǎng)物，如細胞培養(yǎng)代數(shù)、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基中血清的含量等；載體，包括載體大小及形式(超螺旋或線性)；導入基因，包括其核酸的純度、雜質(zhì)的種類及含量；轉(zhuǎn)染方法，不同的轉(zhuǎn)染方法在不同的細胞有不同的轉(zhuǎn)染效率。（二）基因敲除技術(shù)確定基因在疾病中的作用基因敲除(gene knoc

37、kout)又被稱為基因打靶(gene targeting)，是一種通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組、精細地定點修飾和改造染色體基因片段的技術(shù)?；蚯贸窃谂咛ジ杉毎夹g(shù)和同源重組技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門新興生物技術(shù),具有位點專一性強、打靶后目的片段可以與染色體DNA共同穩(wěn)定遺傳的特點,不僅是一種較理想的改造生物遺傳物質(zhì)的實驗方法，也是研究基因的功能、確定基因在疾病發(fā)生中的作用最直接和最有效的方法之一?；蚯贸畛Ｊ褂玫募毎切∈笈咛ジ杉毎?embryonic stem cells，ES細胞),因為ES細胞在體外有白血病抑制因子(LIF)的條件下培養(yǎng),可增殖并維持多潛能未分化狀態(tài),具備

38、發(fā)育成胚系各種組織的能力。用轉(zhuǎn)染的方法將重組載體導入ES細胞中，使之與ES細胞染色體上的靶基因發(fā)生同源重組,把突變或缺失的外源基因置換到ES細胞中,從而使內(nèi)源性目的基因的轉(zhuǎn)錄子中斷,阻斷ES細胞中目標基因的表達,從表達的角度講，這個目標基因就被剔除了。轉(zhuǎn)染ES細胞后，通過外源基因上的篩選標記篩選出發(fā)生同源重組的ES細胞并將其在體外擴增，再將帶有此ES細胞的囊胚移植到假孕鼠的子宮內(nèi),使之發(fā)育成一個嵌合體。然后將這些ES細胞植入假孕小鼠的子宮內(nèi)，產(chǎn)生F1代嵌合鼠，F(xiàn)1代小鼠互相交配就可能產(chǎn)生雜合子和純合子基因敲除小鼠。研究雜合子和純合子基因敲除小鼠的表型改變,就能了解敲除的目的基因的功能、確定目的

39、基因在疾病發(fā)生中的作用。如小鼠是一種對動脈粥樣硬化有抗性的動物，當把小鼠的載脂蛋白（apo E）基因敲除后，純合子apo E基因敲除小鼠在普通飼料或脂肪含量稍高的飼料喂養(yǎng)23月，血漿殘粒脂蛋白膽固醇含量大大升高，主動脈和冠狀動脈出現(xiàn)明顯的動脈粥樣硬化板塊，從而證實了apo E促進殘粒脂蛋白代謝、抗動脈粥樣硬化的作用。基因敲除技術(shù)的不足：操作復(fù)雜,實驗周期長,費用昂貴；存在基因不完全敲除(incomplete knockout)而導致泄漏突變(leaky mutation)。在基因敲除過程中,被阻斷表達的只是染色體中靶基因的某一個或幾個外顯子而不是該基因的全部編碼區(qū),殘留的編碼序列可能獲得新的未

40、知功能,給表型分析帶來麻煩；基因敲除過程中的染色體片段破壞會導致其它基因的編碼區(qū)或調(diào)控元件破壞,造成多基因刪除或死表型；基因的冗余和代償機制也會給表型分析帶來很大困難；同一個打靶載體在不同遺傳背景下進行基因敲除獲得的表型會有很大差異。（三）反義技術(shù)確定基因在疾病中的作用反義技術(shù)(antisense technique)是根據(jù)堿基互補原理,用人工或生物合成特異的互補DNA或RNA片段(反義核酸)，使之能特異地與目的核酸片段互補結(jié)合，從而特異地抑制甚至阻斷目的基因的表達的一種技術(shù)。根據(jù)所采用的反義核酸的不同，反義技術(shù)又可分為反義寡核苷酸技術(shù)、反義RNA 技術(shù)和核酶技術(shù)等。1.用反義寡核苷酸技術(shù)確定

41、基因在疾病中的作用反義寡核苷酸(antisense oligonuleotides，ASON)技術(shù)根據(jù)堿基互補結(jié)合原理、人工或生物合成與目的DNA或RNA互補的寡核苷酸,將其導入細胞后與胞內(nèi)目的DNA或RNA特異地結(jié)合，從而抑制甚至阻斷目的基因的表達或目的RNA的翻譯,達到人工調(diào)控表達基因的目的。目的基因被抑制后會發(fā)生表型的變化，通過表型改變的分析，就能了解被抑制基因的功能、確定其在相關(guān)疾病發(fā)生中的作用。ASON主要通過以下幾種機理抑制或阻斷目的基因的表達：通過與染色體DNA的互補結(jié)合，ASON摻入基因組特異區(qū)域并形成三股螺旋DNA(triplex DNA)或D環(huán)(D-loop)結(jié)構(gòu)、或通過對

42、轉(zhuǎn)錄因子的套圈作用,封閉目的基因，使目的基因不能被復(fù)制，也不能被轉(zhuǎn)錄成RNA。ASON進入細胞后，與細胞內(nèi)目的mRNA互補結(jié)合，形成DNA·RNA具有雙鏈結(jié)構(gòu)的異源雜交體。ASON能與核內(nèi)不均一RNA（hnRNA）互補結(jié)合，使其不能被正確地被剪切，阻斷mRNA的成熟，相應(yīng)的基因在轉(zhuǎn)錄后不能被翻譯成蛋白質(zhì)，基因的表達被阻斷。ASON能與核糖體rRNA的mRNA結(jié)合位點互補結(jié)合，阻止mRNA與rRNA結(jié)合，進而阻止蛋白質(zhì)翻譯的正確啟動，相應(yīng)基因的表達就會被阻斷。真核細胞RNA轉(zhuǎn)錄完成后需經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾并移至胞漿的特定部位才能被翻譯。特異的ASON與mRNA互補結(jié)合后能阻止其進入正確的翻譯

43、部位，mRNA不能被翻譯成蛋白質(zhì)，相應(yīng)基因的表達被阻斷。由于ASON進入機體或細胞后很容易被降解,為提高其穩(wěn)定性、延長其半壽期，在實際運用過程中往往要對ASON進行修飾。如將ASON磷酸骨架上的氧用硫原子或乙基、甲基代替，形成硫化、乙基化、甲基化的反義寡核苷酸，是第一代修飾方式，其中以硫代修飾使用最多。修飾后的ASON雖然增加了穩(wěn)定性、延長了其半壽期，但也同時增加了其細胞毒性、還降低了其細胞吸收率。近年來發(fā)現(xiàn)，以2-氨基乙基甘氨酸為基本骨架的多肽鏈是一種核酸類似物，每個氨基酸殘基間由酰胺鍵連接到多肽骨架上,堿基通過亞甲基羰基連接到多肽骨架上。與核酸不同的是,這種多肽鏈不含任何戊糖或磷酸成分,而

44、是以酰胺鍵連接骨架取代核酸中以磷酸二酯鍵連接骨架。由于這種多肽鏈能與RNA或DNA互補結(jié)合形成穩(wěn)定的多肽鏈:DNA或RNA雜合鏈，所以這種多肽鏈被稱為肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)。PNA具有較強的蛋白酶、核酸酶抗性，在機體內(nèi)或細胞中具有較強的穩(wěn)定性，當它與DNA或RNA結(jié)合后，能阻止其轉(zhuǎn)錄或翻譯，從而阻斷相應(yīng)基因的表達，是較好的反義抑制劑,被稱為第三代反義核酸。2反義RNA技術(shù)確定基因在疾病中的作用反義RNA（antisense RNA）是一類自身沒有編碼功能,但能通過配對堿基間氫鍵與目的RNA、特別是mRNA的特定區(qū)域互補結(jié)合，抑制目的RNA功能、調(diào)控相應(yīng)基因

45、表達的小分子RNA。反義RNA技術(shù)就是采用反義RNA抑制目的基因表達，然后通過表型改變的分析，探討目的基因的功能及其在疾病發(fā)生中的作用的一種研究手段。反義RNA的作用機理比較復(fù)雜，它對基因表達在多水平、多作用點發(fā)揮抑制作用。在反義RNA技術(shù)中，針對目的mRNA設(shè)計并合成人工反義RNA是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，選擇目的mRNA特異靶序列是設(shè)計高效、特異反義RNA的第一步。一般認為，在原核細胞中，反義RNA針對目的mRNA的SD序列和AUG區(qū)域比針對編碼區(qū)有更強的抑制作用；而針對編碼序列不同區(qū)域的反義RNA，其抑制程度的差別比較大。在真核系統(tǒng)中，靶序列的選擇較復(fù)雜，可根據(jù)目的mRNA的特點，選擇針對其不同

46、區(qū)域的反義RNA。針對mRNA前體5末端的反義RNA能阻止加“帽”反應(yīng)及翻譯；針對外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)域的反義RNA能阻止剪接；針對3末端的反義RNA能阻止mRNA的加尾作用，并阻止mRNA由胞核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)運；針對編碼區(qū)的反義RNA能直接阻止核糖體與mRNA的結(jié)合與翻譯的延伸過程。通過這些反義RNA能抑制目的mRNA的基因表達、翻譯成蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)合成被阻斷后，就會產(chǎn)生相應(yīng)的表型改變。分析這些表型改變，就能確定被抑制基因在疾病發(fā)生中的作用。3核酶技術(shù)確定基因在疾病中的作用核酶就是具有生物催化活性的RNA，能按堿基互補原理識別特定核苷酸序列并特異地剪切底物RNA分子。根據(jù)分子大小可以分成大分子核

47、酶和小分子核酶兩類。大分子核酶包括第一型內(nèi)含子(group I intron), 第二型內(nèi)含子(group II intron)和核糖核酸酶P的RNA亞基,它們都是由幾百到幾千個核苷酸組成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子。小分子核酶可按結(jié)構(gòu)分為多種,其中包括錘頭型 (hammerhead)、發(fā)夾型(hairpin)、肝炎病毒D (hepatitis delta virus)和VS核酶(Varkud satellite ribozyme)，其大小多在35155個核苷酸之間。由于核酶能識別目的RNA的特定序列并使RNA降解而無法進行轉(zhuǎn)錄和翻譯, 所以核酶是一種具有催化活性的特殊反義RNA,用核酶抑制基因表達的核

48、酶技術(shù)是研究基因的功能及其在疾病發(fā)生中作用的一種有效手段。在核酶技術(shù)的應(yīng)用過程中，一般都采用小分子核酶。由于錘頭核酶的結(jié)構(gòu)最為簡單,易于人工設(shè)計,對其進行的研究也最多；所以應(yīng)用最廣；其次是發(fā)夾核酶,因為其催化效率較高,受金屬離子和pH值變動的影響也較小。在實際應(yīng)用過程中，現(xiàn)根據(jù)核酶的結(jié)構(gòu)特點和目的RNA的特異序列特征，設(shè)計并合成針對目的RNA特異序列核酶的基因，構(gòu)建表達載體，然后將其導入細胞。核酶基因就會表達產(chǎn)生核酶，通過特異序列識別并降解目的RNA,使其不能翻譯成蛋白質(zhì)，相應(yīng)基因的表達被抑制。（四）RNA干擾技術(shù)確定基因在疾病中的作用RNA干擾（RNA interference，RNAi）的

49、概念:是指由雙鏈RNA分子介導的、特異的mRNA降解，導致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）現(xiàn)象，廣泛存在大腸桿菌、真菌、線蟲、果蠅、植物、動物卵和哺乳動物等細胞中，是生物在長期進化過程中形成的抵御外來核酸入侵和抑制轉(zhuǎn)座子誘導基因組DNA突變的重要途徑?；虺聊顾拗鲗⑼庠春怂嶙鳛閷ψ陨碛泻Φ男蛄卸鴮⑵浣到?阻止外源核酸在宿主細胞內(nèi)發(fā)揮毒性作用。這種降解作用具有很強的序列特異性，能有效地保持宿主細胞基因組的完整性。RNAi過程:分為起始和效應(yīng)兩個階段。 起始階段，dsRNA被dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(dsRNA-specific endonuclease)Dicer切割為2125個核苷酸的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs，siRNA)。 效應(yīng)階段，siRNA與螺旋酶、特定的核酸內(nèi)切酶等結(jié)合在一起形成RNA誘導沉默復(fù)合物（RNA-ind