蛋白質(zhì)濃度測(cè)定——考馬斯亮藍(lán)染色法(實(shí)驗(yàn)報(bào)告)

1、.蛋白質(zhì)濃度測(cè)定考馬斯亮藍(lán)染色法（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）實(shí)驗(yàn)日期： 2015 年 4 月 28 日實(shí)驗(yàn)溫度：室溫實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：生物化學(xué)與遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)老師： *班級(jí)： 2013 級(jí)生物技術(shù)1 班姓名： *學(xué)號(hào)： *I. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法；2.熟悉蛋白質(zhì)含量測(cè)定的影響因素。II. 實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的，這是一種迅速、可靠的通過(guò)染色法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)濃度的方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250 在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大吸收波長(zhǎng) 465nm，與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大吸收波長(zhǎng)595nm，在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。蛋白質(zhì)與考

2、馬斯亮藍(lán)G-250 結(jié)合，反應(yīng)2min 即可到達(dá)平衡，復(fù)合物在室溫下1h 內(nèi)保持穩(wěn)定。蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán) G-250 復(fù)合物吸光系數(shù)，使得在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高，可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量。III. 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器1.實(shí)驗(yàn)試劑-1-/4.(1) 100g/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液5mg 酪蛋白溶于50mL的 0.1mol/L 氫氧化鈉溶液 。(2)考馬斯亮藍(lán)G-250 試劑50mg 考馬斯亮藍(lán)G-250 溶于 25mL 的 95%乙醇中，加 85%的磷酸 50mL ，蒸餾水定容至 500mL 。(3)正常人血漿。2.實(shí)驗(yàn)器材可見(jiàn)分光光度計(jì)，100L微量移液器16 支， 5mL 刻度吸管 8 支，中試管

3、。IV . 實(shí)驗(yàn)操作步驟mL012345樣品1 樣品2標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液00.20.40.60.81.0-血漿00.80.60.40.200.40.40.1mol/LNaOH-0.60.6考馬斯亮藍(lán)試劑各 5.01.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取中試管8 支，按下表加入各種試劑混勻，室溫放置 5min 后即可比色。 以“ 0”號(hào)管為空白，記錄于下表，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制數(shù)據(jù)表012345樣 1樣 2標(biāo)準(zhǔn)蛋白 g 數(shù)020406080100-2-/4.A 59500.5170.8050.9411.1571.1921.4651.4402.樣品測(cè)定中試管 2 支分別加未知濃度蛋白質(zhì)（或人正常血漿） 0.4mL ，各加 5.0mL 考馬斯亮藍(lán)試劑搖勻，室溫放置 5min ，以“ 0”號(hào)管為空白比色，以所測(cè)A 595 于標(biāo)準(zhǔn)曲線查蛋白質(zhì)含量。V. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析結(jié)果分析： 實(shí)驗(yàn)未能達(dá)到預(yù)期的一條直線，原因可能為：血漿樣本放置時(shí)間太久，蛋白質(zhì)變性；實(shí)驗(yàn)比色杯由于使用后未及時(shí)擦洗，導(dǎo)致比色誤差（原因?。?；人為操作不當(dāng)，導(dǎo)致誤差。VI.注意事項(xiàng)1. 考馬斯亮藍(lán)試劑加入后室溫放置5 20min