種子擴大培養(yǎng)

1、種種 子子 擴擴 大大 培培 養(yǎng)養(yǎng)1、在空氣過濾除菌的過程中空氣儲罐的作用是、在空氣過濾除菌的過程中空氣儲罐的作用是 ，絲網除沫器的作用是絲網除沫器的作用是 ?？諝饧訜嵩O備的作用是 。2、空氣過濾器按過濾介質空隙大小分為 和和 。3、介質孔隙大于被攔截的微生物大小，但介質層有一定的厚介質孔隙大于被攔截的微生物大小，但介質層有一定的厚度，機理是靜電、擴散、慣性及攔截作用。度，機理是靜電、擴散、慣性及攔截作用。4、在實驗室或中試規(guī)模，空氣過濾器只設、在實驗室或中試規(guī)模，空氣過濾器只設 級，而大型發(fā)級，而大型發(fā)酵工廠大多采用酵工廠大多采用 級過濾。級過濾。5、工廠發(fā)酵生產中棉花活性炭過濾器一般用作、

2、工廠發(fā)酵生產中棉花活性炭過濾器一般用作 ，金屬燒結管和微孔膜過濾器一般用作 。緩沖空氣脈沖緩沖空氣脈沖除去除去 較小液滴較小液滴降低空氣的濕度降低空氣的濕度絕對過濾絕對過濾深層過濾深層過濾一一二二總過濾器總過濾器分過濾器分過濾器1、連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣。、連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣。VVM一般為一般為0.12.0 m3 。 2、空氣的壓強、空氣的壓強(表壓表壓)為為0.20.4 MPa。3、進入過濾器之前，空氣的相對濕度、進入過濾器之前，空氣的相對濕度70。4、進入發(fā)酵罐的空氣溫度可比培養(yǎng)溫度高、進入發(fā)酵罐的空氣溫度可比培養(yǎng)溫度高1030。 5、壓縮空氣的潔凈度，在設計空氣過濾器時，一般

3、取失敗概率、壓縮空氣的潔凈度，在設計空氣過濾器時，一般取失敗概率為為10-3為指標。為指標。 發(fā)酵用無菌空氣的基本要求發(fā)酵用無菌空氣的基本要求1、濕熱滅菌的條件是 。2、發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌中， 方法對滅菌的蒸汽壓力要求高。在分批滅菌過程中要先 通過 進行預熱，在通入蒸汽升溫到121。3、連消的特點是、連消的特點是 和和 ，適合，適合 發(fā)發(fā)酵罐。酵罐。夾套或蛇管夾套或蛇管121 30min 連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌快速快速高溫高溫大型大型對數穿透定律：對數穿透定律：對數殘留定律對數殘留定律對數生長定律對數生長定律比熱死速率比熱死速率過濾常數過濾常數比生長速率比生長速率發(fā)酵工程的流程發(fā)酵工程的流程空氣空氣凈化

4、處理保藏菌種斜面活化擴大培養(yǎng)種子罐發(fā)酵罐培養(yǎng)基制備滅菌培養(yǎng)基制備滅菌滅菌產物分離純化成品成品原料預處理原料預處理種種 子子 擴擴 大大 培培 養(yǎng)養(yǎng) 現代的發(fā)酵工業(yè)生產規(guī)模越現代的發(fā)酵工業(yè)生產規(guī)模越來越大，每只發(fā)酵罐的容積有幾來越大，每只發(fā)酵罐的容積有幾十立方米甚至幾百立方米，要使十立方米甚至幾百立方米，要使小小的微生物在幾十小時的較短小小的微生物在幾十小時的較短時間內，完成如此巨大的發(fā)酵轉時間內，完成如此巨大的發(fā)酵轉化任務，那就必須具備數量巨大化任務，那就必須具備數量巨大的微生物細胞才行。的微生物細胞才行。 一、概述一、概述 1、定義：菌種的擴大培養(yǎng)就是把保藏在砂菌種的擴大培養(yǎng)就是把保藏在砂土

5、管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產菌土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產菌種接入試管斜面活化，再經過扁瓶或種接入試管斜面活化，再經過扁瓶或搖搖瓶和瓶和種子罐，逐級擴大培養(yǎng)后達到一定的數量和種子罐，逐級擴大培養(yǎng)后達到一定的數量和質量的純種培養(yǎng)過程。這些純種的培養(yǎng)物稱質量的純種培養(yǎng)過程。這些純種的培養(yǎng)物稱為為種子。 2、作為生產用種子的準則1 1）菌種細胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐）菌種細胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，延滯期短。后能迅速生長，延滯期短。2 2）生理性狀穩(wěn)定）生理性狀穩(wěn)定3 3）菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的）菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求要求4 4）無雜菌污

6、染）無雜菌污染5 5）保持穩(wěn)定的生產能力）保持穩(wěn)定的生產能力編輯ppt11實驗室種子制備階段實驗室種子制備階段（一級種子培養(yǎng)）（一級種子培養(yǎng)）生產車間種子制備階段生產車間種子制備階段（二級種子培養(yǎng)、（二級種子培養(yǎng)、 三級種子培養(yǎng)）三級種子培養(yǎng)）二級發(fā)酵二級發(fā)酵 三級發(fā)酵三級發(fā)酵砂土孢子砂土孢子冷凍干燥孢子冷凍干燥孢子斜面孢子斜面孢子搖瓶液體培養(yǎng)搖瓶液體培養(yǎng)茄子瓶斜面培養(yǎng)茄子瓶斜面培養(yǎng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)一級種子罐一級種子罐二級種子罐二級種子罐發(fā)酵罐發(fā)酵罐二、種子制備工藝二、種子制備工藝編輯ppt12 生產菌種的制備 兩個過程：在固體培養(yǎng)基上生產大量兩個過程：在固體培養(yǎng)基上生產大量孢子的

7、孢子的孢子制備過程和在液體培養(yǎng)基上過程和在液體培養(yǎng)基上生產大量菌絲的生產大量菌絲的種子制備過程過程孢子制備放線菌孢子的制備放線菌孢子的制備 工藝過程工藝過程菌菌種種母母斜斜面面搖搖瓶瓶種種子子種種子子罐罐發(fā)發(fā)酵酵罐罐子子斜斜面面 注意事項限制碳源限制碳源(約約1%)和氮源和氮源(不超過不超過0.5%)；培養(yǎng)溫度多為培養(yǎng)溫度多為28 ，少數為，少數為37 ，培養(yǎng)時，培養(yǎng)時間為間為514天；天；采用孢子進罐：工藝簡單，批間差異小，便采用孢子進罐：工藝簡單，批間差異小，便于控制孢子質量；采用菌絲進罐：可縮短種于控制孢子質量；采用菌絲進罐：可縮短種子罐內的培養(yǎng)時間子罐內的培養(yǎng)時間(尤適生長緩慢的菌種尤

8、適生長緩慢的菌種)。霉菌孢子的制備霉菌孢子的制備 注意注意事項事項天然農產品因具有獨特的營養(yǎng)成分天然農產品因具有獨特的營養(yǎng)成分 和較大表面積而適合作霉菌的培養(yǎng)基和較大表面積而適合作霉菌的培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度多為培養(yǎng)溫度多為2528 ，培養(yǎng)時間為，培養(yǎng)時間為414天天細菌孢子的制備細菌孢子的制備 注意事項注意事項1.適合采用碳源限量而氮源豐富的培養(yǎng)基適合采用碳源限量而氮源豐富的培養(yǎng)基2.培養(yǎng)溫度多為培養(yǎng)溫度多為37 ，少數為，少數為28 ，培，培養(yǎng)時養(yǎng)時 間細菌菌體為間細菌菌體為12天，產芽孢的細天，產芽孢的細菌為菌為510天天種子制備概念：指將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出概念：指將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的的孢子

9、或菌體轉入到液體培養(yǎng)基轉入到液體培養(yǎng)基種培養(yǎng)，使其繁殖成大量種培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。的過程。 搖瓶種子搖瓶種子 種子罐種子種子罐種子搖瓶種子制備搖瓶種子制備 孢子發(fā)芽或菌絲孢子發(fā)芽或菌絲繁殖緩慢的菌種需的菌種需將孢子經搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進入種將孢子經搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進入種子罐，子罐，搖瓶具有濃縮種子罐的作用，其培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件與種子，其培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件與種子罐相似。罐相似。 種子培養(yǎng)基營養(yǎng)應豐富完全，易種子培養(yǎng)基營養(yǎng)應豐富完全，易被菌體利用，濃度不宜過高。被菌體利用，濃度不宜過高。種子罐種子制備種子罐種子制備A. 孢子或搖瓶菌絲被接入體積較小的種子罐中，培養(yǎng)孢子或搖瓶

10、菌絲被接入體積較小的種子罐中，培養(yǎng)后形成的大量菌絲，這種種子稱為一級種子后形成的大量菌絲，這種種子稱為一級種子把一級種子轉入發(fā)酵罐中發(fā)酵，稱為二極發(fā)酵把一級種子轉入發(fā)酵罐中發(fā)酵，稱為二極發(fā)酵種子罐的級數主要決定于菌種的性質、菌體的生長種子罐的級數主要決定于菌種的性質、菌體的生長速度和發(fā)酵設備的合理應用速度和發(fā)酵設備的合理應用種子罐級數減少，有利于生產過程的簡化和發(fā)酵過種子罐級數減少，有利于生產過程的簡化和發(fā)酵過程的控制，減少因種子生長異常而造成的發(fā)酵波動程的控制，減少因種子生長異常而造成的發(fā)酵波動實驗室種子制備階段： 瓊脂斜面瓊脂斜面 固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng) 搖瓶液體培養(yǎng)搖瓶液體

11、培養(yǎng)生產車間種子制備階段： 種子罐擴大培養(yǎng)種子罐擴大培養(yǎng)對接種物的一般要求：1 1）應以高產菌株中分離獲得的純系作為出發(fā)菌）應以高產菌株中分離獲得的純系作為出發(fā)菌株。菌株純度高，性狀穩(wěn)定，不易發(fā)生變異。株。菌株純度高，性狀穩(wěn)定，不易發(fā)生變異。2 2）生理活性強。）生理活性強。 若以菌體細胞為接種物，應采取正在旺盛生若以菌體細胞為接種物，應采取正在旺盛生長的繁殖期細胞，菌體細胞應均勻，同步率高。長的繁殖期細胞，菌體細胞應均勻，同步率高。以孢子為接種物，應采用易于萌發(fā)的孢子。以孢子為接種物，應采用易于萌發(fā)的孢子。為了提高孢子的萌發(fā)率，有時需采取一些特殊措施 如： 丙酮丁醇梭菌的孢子在沸水中處理丙酮

12、丁醇梭菌的孢子在沸水中處理9090秒后在秒后在放入液體培養(yǎng)基底部，可獲得較高的發(fā)芽率。放入液體培養(yǎng)基底部，可獲得較高的發(fā)芽率。 有的孢子不被水浸潤，浮在液體培養(yǎng)基表有的孢子不被水浸潤，浮在液體培養(yǎng)基表面或貼在培養(yǎng)容器內壁，不形成懸液?？稍谂嗝婊蛸N在培養(yǎng)容器內壁，不形成懸液。可在培養(yǎng)基中加入少量無毒的表面活性劑，幫助形成養(yǎng)基中加入少量無毒的表面活性劑，幫助形成懸液。懸液。1、實驗室種子制備 對于產孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁對于產孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子；這樣操作簡孢子可直接作為種子罐的

13、種子；這樣操作簡便，不易污染雜菌。便，不易污染雜菌。 如：檸檬酸生產的制種，用麩皮培養(yǎng)基產如：檸檬酸生產的制種，用麩皮培養(yǎng)基產生大量孢子直接用于種子罐接種。生大量孢子直接用于種子罐接種。 對于產孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，對于產孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用可以用搖瓶液體培養(yǎng)搖瓶液體培養(yǎng)法。孢子接入含液體培法。孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，養(yǎng)基的搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。作為種子。 如：用灰色鏈霉菌生產鏈霉素如：用灰色鏈霉菌生產鏈霉素 用卡那鏈霉菌生產卡那霉素用卡那鏈霉菌生產卡那霉素 對于不產孢子的細菌，生產上一般采對于不產孢子的細菌，生

14、產上一般采用將試管斜面菌種接入茄瓶斜面或搖瓶培用將試管斜面菌種接入茄瓶斜面或搖瓶培養(yǎng)。養(yǎng)。 如：谷氨酸棒桿菌生產谷氨酸如：谷氨酸棒桿菌生產谷氨酸 實驗室制備的孢子或液體種子移種至種實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌子罐擴大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等。如果是需氧如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等。如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相

15、同的培養(yǎng)條件。獲得相同的培養(yǎng)條件。 2、生產車間種子制備、生產車間種子制備2）種子罐的作用： 主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達到一定體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產物的合成。的菌體量，以利于產物的合成。種子罐種子罐2）種子罐級數的確定種子罐級數是指制備種子需逐級擴大培是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數。養(yǎng)的次數。一般根據菌種一般根據菌種生長特性生長特性、孢子發(fā)芽孢子發(fā)芽及及菌菌體繁殖速度體繁殖速度以及所采用以及所采用發(fā)酵罐的容積發(fā)酵罐的容積而而定。定。細菌：細菌：生長快，種子用量比例少，級數生長快，種子用量比

16、例少，級數也較少，二級發(fā)酵。也較少，二級發(fā)酵。 茄子瓶茄子瓶種子罐種子罐發(fā)酵罐發(fā)酵罐 霉菌：霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵 孢子懸浮液孢子懸浮液一級種子罐（一級種子罐（27C,40小小時孢子發(fā)芽，產生菌絲時孢子發(fā)芽，產生菌絲 ）二級種子罐二級種子罐（ 27C,1024小時，菌體迅速繁殖，小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）粗壯菌絲體）發(fā)酵罐發(fā)酵罐 放線菌：放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵生長更慢，采用四級發(fā)酵酵母：酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子通常用一級種子 種子級數越少越好，可簡化工藝和控制，減種子級數越少越好，可簡化工

17、藝和控制，減少染菌機會；少染菌機會；種子級數太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，種子級數太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產率，增加染菌機會；降低發(fā)酵罐的生產率，增加染菌機會； 確定種子罐級數需注意的問題確定種子罐級數需注意的問題u對于生長快的細菌，種子用量比例小，故種對于生長快的細菌，種子用量比例小，故種子罐相應也少。子罐相應也少。如：如： 谷氨酸生產中，采用茄瓶斜面或搖瓶種谷氨酸生產中，采用茄瓶斜面或搖瓶種子接入種子罐于子接入種子罐于32培養(yǎng)培養(yǎng)710h，菌體濃度達，菌體濃度達108109個個/ml，即可接入發(fā)酵罐作為種子。，即可接入發(fā)酵罐作為種子。這稱為這稱為一級種子罐擴大培養(yǎng)，也稱

18、，也稱二級發(fā)酵。u 生長較慢的菌種，如青霉素生產菌種，其孢生長較慢的菌種，如青霉素生產菌種，其孢子懸浮液接入一級種子罐擴大培養(yǎng)于子懸浮液接入一級種子罐擴大培養(yǎng)于2727培養(yǎng)培養(yǎng)40h40h，此時孢子發(fā)芽，長出短菌絲，再移至含有，此時孢子發(fā)芽，長出短菌絲，再移至含有新鮮培養(yǎng)基的第二級種子罐，于新鮮培養(yǎng)基的第二級種子罐，于2727培養(yǎng)培養(yǎng)101024h24h，菌絲迅速繁殖，獲粗壯菌體，即可移至發(fā)，菌絲迅速繁殖，獲粗壯菌體，即可移至發(fā)酵罐作為種子。酵罐作為種子。這稱為這稱為二級種子罐擴大培養(yǎng)，也稱，也稱三級發(fā)酵。一般一般50m3發(fā)酵罐都采用三級發(fā)酵發(fā)酵罐都采用三級發(fā)酵 生長更慢的菌種，鏈霉素生產菌種

19、灰色鏈生長更慢的菌種，鏈霉素生產菌種灰色鏈霉菌，一般采用霉菌，一般采用三級種子罐擴大培養(yǎng)（四級發(fā)酵） 在小型罐（在小型罐（5 5500L500L）中進行實驗時，通常）中進行實驗時，通常采用直接將孢子或菌絲體接入罐中發(fā)酵，這可采用直接將孢子或菌絲體接入罐中發(fā)酵，這可稱為稱為一級發(fā)酵。種子罐的級數越少，越有利于簡化工藝和控種子罐的級數越少，越有利于簡化工藝和控制，并可減少由于多次移種而帶來的染菌的機制，并可減少由于多次移種而帶來的染菌的機會。會。 但也必須考慮盡量延長發(fā)酵罐生產產物的時但也必須考慮盡量延長發(fā)酵罐生產產物的時間，縮短由于種子發(fā)芽、生長而占用的非生產間，縮短由于種子發(fā)芽、生長而占用的非

20、生產時間，以提高發(fā)酵罐的生產率。時間，以提高發(fā)酵罐的生產率。 雖然種子罐級數隨產物的品種及生產規(guī)模雖然種子罐級數隨產物的品種及生產規(guī)模而定，但也與所選用工藝條件有關。而定，但也與所選用工藝條件有關。 如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級數。數。種子罐種子罐1 發(fā)酵罐發(fā)酵罐1 發(fā)酵罐發(fā)酵罐2 種子罐種子罐2 移種方式：移種方式：1）單種）單種 2）雙種）雙種 3）倒種）倒種 4）混種）混種1）單種：）單種：一一個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。 2）雙種：）雙

21、種：為為加大接種量，兩個種子罐接種到加大接種量，兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。一個發(fā)酵罐中。 3）倒種：）倒種：種子罐染菌又無備用種子時或種子種子罐染菌又無備用種子時或種子質量不理想可采樣質量不理想可采樣倒種倒種法，以適宜的發(fā)酵罐法，以適宜的發(fā)酵罐倒出部分給另一發(fā)酵罐。倒出部分給另一發(fā)酵罐。4）混種：）混種：一部分種子來源于種子罐，一部分一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。來源于發(fā)酵罐。2）種齡種齡種齡種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。選擇適當種齡的菌種接種十分重要選擇適當種齡的菌種接種十分重要通常，

22、種齡以菌體處于生命力極為旺盛的對數通常，種齡以菌體處于生命力極為旺盛的對數期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達到最高峰時，較期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達到最高峰時，較為合適。為合適。 過于年輕的種子接入發(fā)酵罐后，往往會出過于年輕的種子接入發(fā)酵罐后，往往會出現前期生長緩慢、發(fā)酵周期延長、產物開始形現前期生長緩慢、發(fā)酵周期延長、產物開始形成的時間推遲，造成異常發(fā)酵的情況。成的時間推遲，造成異常發(fā)酵的情況。 過老的種子會引起生產能力下降，菌體過過老的種子會引起生產能力下降，菌體過早自溶。早自溶。 不同品種或同一不同品種或同一品種的工藝條件不品種的工藝條件不同，其菌齡也不一同，其菌齡也不一樣，一般要經過多樣，一般

23、要經過多次試驗，考察其發(fā)次試驗，考察其發(fā)酵罐中產量的多少酵罐中產量的多少來確定最適種齡。來確定最適種齡。嗜堿性芽孢桿菌種齡對產酶嗜堿性芽孢桿菌種齡對產酶（堿性蛋白酶）的影響（堿性蛋白酶）的影響3）接種量接種量接種量是指移入的種子液體積和接種后是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。培養(yǎng)液體積的比例。大多數抗生素發(fā)酵的最適接種量為大多數抗生素發(fā)酵的最適接種量為7 715%15%，有，有時可增加到時可增加到20 20 25%25%；而由棒狀桿菌生產谷氨；而由棒狀桿菌生產谷氨酸酸 接種量只需接種量只需1%1%。 除了始于斜面培養(yǎng)的初次接種外，發(fā)酵過程的除了始于斜面培養(yǎng)的初次接種外，發(fā)酵過程的各

24、階段接種量一般均需各階段接種量一般均需0.50.510%10%的接種量。的接種量。 接種量的大小取決于生產菌種在發(fā)酵中生長接種量的大小取決于生產菌種在發(fā)酵中生長繁殖的速度。繁殖的速度。 采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌體繁殖到達高峰的時間，使產物的形成提前體繁殖到達高峰的時間，使產物的形成提前到來。到來。 近年來，不少廠家以加大種子量及采用豐近年來，不少廠家以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產的措施；有的產品采用富培養(yǎng)基作為獲得高產的措施；有的產品采用兩個種子罐接一個發(fā)酵罐的雙種法。兩個種子罐接一個發(fā)酵罐的雙種法。 如卡那霉素生產中采用雙種比單種的發(fā)酵如

25、卡那霉素生產中采用雙種比單種的發(fā)酵單位提高單位提高8%8%，且達到產量高峰的時間提前。，且達到產量高峰的時間提前。 但如果接種量過大，往往使菌體生長過快、但如果接種量過大，往往使菌體生長過快、培養(yǎng)液黏度增加，造成溶氧不足，從而影響產培養(yǎng)液黏度增加，造成溶氧不足，從而影響產物的合成。物的合成。 如由嗜堿芽孢桿菌生產堿性蛋白酶的發(fā)酵，如由嗜堿芽孢桿菌生產堿性蛋白酶的發(fā)酵，1%1%接種量產酶活最高，在接種量產酶活最高，在0.50.54%4%之間雖有差之間雖有差別，但影響不大；如超過別，但影響不大；如超過4%4%則酶產量明顯下則酶產量明顯下降。降。3、種子質量的判斷 為了保證各級種子移種前的質量，除為

26、了保證各級種子移種前的質量，除了保證規(guī)定的培養(yǎng)條件外，在過程中還要了保證規(guī)定的培養(yǎng)條件外，在過程中還要定期取樣測定一些參數以觀察基質的代謝定期取樣測定一些參數以觀察基質的代謝變化及菌體形態(tài)是否正常。變化及菌體形態(tài)是否正常。1、細胞或菌體、細胞或菌體 菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀單細胞：單細胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；霉菌、放線菌：霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內含物情況好。內含

27、物情況好。2、生化指標、生化指標 通常測定的參數有：1 1）pH pH 2 2）培養(yǎng)基滅菌后磷、糖、氨基氮的含量變化）培養(yǎng)基滅菌后磷、糖、氨基氮的含量變化3 3）菌體形態(tài)、菌體濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、）菌體形態(tài)、菌體濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等）顆粒等）4 4）其它參數，如某種酶的活力）其它參數，如某種酶的活力 如土霉素發(fā)酵中，種子液的淀粉酶活力與發(fā)如土霉素發(fā)酵中，種子液的淀粉酶活力與發(fā)酵單位有一定關系，可通過測定種子液中淀酵單位有一定關系，可通過測定種子液中淀粉酶的活力判斷種子質量。粉酶的活力判斷種子質量。細菌菌體濃度的測量方法有細菌菌體濃度的測量方法有 。霉菌濃度的測量方法有霉菌濃度的測

28、量方法有 。霉菌或放線菌孢子測量的方法有霉菌或放線菌孢子測量的方法有 。OD600測干重測干重血球板計數血球板計數稀釋平板計數稀釋平板計數測干重測干重離心測體積離心測體積血球板計數血球板計數稀釋平板計數稀釋平板計數 細菌培養(yǎng)溫度多為細菌培養(yǎng)溫度多為 ， 發(fā)酵。霉菌發(fā)酵。霉菌培養(yǎng)溫度多為培養(yǎng)溫度多為 ， 發(fā)酵，放發(fā)酵，放線菌培養(yǎng)溫度多為線菌培養(yǎng)溫度多為 。 發(fā)酵。酵發(fā)酵。酵母母 發(fā)酵發(fā)酵 A.25-28 B. 28 C. 37 A.二級二級 B.三級三級 C.四級四級 二級發(fā)酵二級發(fā)酵二級二級二級二級3725-28 283、產物生成量、產物生成量 在抗生素發(fā)酵中，產物生成量是考察在抗生素發(fā)酵中，

29、產物生成量是考察種子質量的重要指標，因為種子液中產種子質量的重要指標，因為種子液中產物生成量的多少間接反映種子的生產能物生成量的多少間接反映種子的生產能力和成熟程度。力和成熟程度。4、酶活力、酶活力 種子液中某種酶的活力，與目的產種子液中某種酶的活力，與目的產物的產量有一定的關聯。物的產量有一定的關聯。種子異常分析種子異常分析 菌種生長速度，過快或過慢菌種生長速度，過快或過慢 菌絲結團菌絲結團 菌絲粘壁菌絲粘壁 影響孢子質量影響孢子質量的因素的因素及控制及控制培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間培養(yǎng)時間和和冷藏時間冷藏時間三、影響種子質量的因素三、影響種子質量的因素1、培養(yǎng)基生產過程中經常出現

30、種子質量不穩(wěn)定的現生產過程中經常出現種子質量不穩(wěn)定的現象，其主要原因是象，其主要原因是原材料質量波動。原材料質量的波動，起主要作用的是其中的無機離子含量不同。如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質量。1、培養(yǎng)基生產過程中經常出現種子質量不穩(wěn)定的現生產過程中經常出現種子質量不穩(wěn)定的現象，其主要原因是象，其主要原因是原材料質量波動。如：如： 四環(huán)素、土霉素生產中，配制產孢斜面培養(yǎng)基四環(huán)素、土霉素生產中，配制產孢斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產地、品種、加工方法及用量的用的麩皮，因小麥產地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質量均有一定影響。不同對孢子

31、質量均有一定影響。 制備霉菌用的大米，其產地、顆粒大小、均勻程制備霉菌用的大米，其產地、顆粒大小、均勻程度不同，孢子質量也不同。度不同，孢子質量也不同。 蛋白胨加工原料不同（如魚胨或骨胨）對孢子影蛋白胨加工原料不同（如魚胨或骨胨）對孢子影響也不同。響也不同。 水質的硬度、污染程度對生產均有影響水質的硬度、污染程度對生產均有影響 水質的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質波動，影響水源污染，均可造成水質波動，影響種子質量。種子質量。 菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現多種不同菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現多種不同代謝類型的菌落，代謝類型的菌落，氮源品種越多氮源品種越多，出，出現的

32、菌落類型也越多，不利于生產的現的菌落類型也越多，不利于生產的穩(wěn)定。穩(wěn)定。 措施培養(yǎng)基所用原料要經過發(fā)酵試驗合格才可使用培養(yǎng)基所用原料要經過發(fā)酵試驗合格才可使用嚴格控制滅菌后培養(yǎng)基的質量嚴格控制滅菌后培養(yǎng)基的質量斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當溫度下放置一定斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當溫度下放置一定時間時間供生產用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，供生產用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復雜的有作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復雜的有機氮源機氮源2、培養(yǎng)條件1）溫度2）濕度 不同濕度對龜裂鏈霉菌（產土霉素）斜面生長的影響相對濕度相對濕度 斜面外觀斜面外觀 活孢子數活孢子數（

33、108/支）支）16.516.519 19 上部稀薄，下部稠，略黃上部稀薄，下部稠，略黃 1.21.2252536 36 上部薄，中部均勻，發(fā)白上部薄，中部均勻，發(fā)白 2.32.3404045 45 一片白，孢子豐富，稍皺一片白，孢子豐富，稍皺 5.75.73）通氣量一般需保證充足的通氣一般需保證充足的通氣溫度對多數品種斜面孢子溫度對多數品種斜面孢子質量有顯著影響。質量有顯著影響。如如 ：土霉素生產種子，在高于：土霉素生產種子，在高于3737培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后表現出培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后表現出糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等。絲過早自溶

34、，效價降低等。制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數量和質量有較大影響。的數量和質量有較大影響。3、培養(yǎng)時間和冷藏時間（1）培養(yǎng)時間）培養(yǎng)時間 一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因為衰老的孢子已在逐步進入發(fā)芽階段，核物為衰老的孢子已在逐步進入發(fā)芽階段，核物質趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會導致生質趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會導致生產能力的下降。產能力的下降。 措施：孢子培養(yǎng)的時間應該控制在措施：孢子培養(yǎng)的時間應該控制在孢子量多、孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產量正常孢子成熟、發(fā)酵產量正常的階段終止培養(yǎng)。的階段終止培養(yǎng)。（2）斜面冷藏時

35、間）斜面冷藏時間斜面冷藏對孢子質量的影響與孢子成熟程斜面冷藏對孢子質量的影響與孢子成熟程度有關。度有關。如土霉素生產菌種孢子斜面培養(yǎng)如土霉素生產菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即天左右即于于4C冰箱保存，發(fā)現冷藏冰箱保存，發(fā)現冷藏78天菌體細胞天菌體細胞開始自溶。而培養(yǎng)開始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，天以后冷藏，20天未發(fā)天未發(fā)現自溶。現自溶。冷藏時間對孢子的生產能力也有影響。冷藏時間對孢子的生產能力也有影響。如在鏈霉素生產中，斜面孢子在如在鏈霉素生產中，斜面孢子在6冷藏冷藏2個月后的發(fā)酵單位比冷藏個月后的發(fā)酵單位比冷藏1個月降低個月降低18%，冷藏冷藏3個月后降低個月后降低35%。4、接種量接種量大小

36、影響到培養(yǎng)基中孢子的數量，接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數量，進而影響菌體的生理狀況。進而影響菌體的生理狀況。編輯ppt65影響種子質量影響種子質量的因素及控制的因素及控制接種量接種量種齡種齡孢子的質量孢子的質量培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件四、種子質量的控制措施四、種子質量的控制措施1、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基 營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要；營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要；選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基；選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基；營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；營養(yǎng)成分要適當豐富和完全，氮源和維生素營養(yǎng)成分要適當豐富和完全，氮源和維生素含量要高。含量要高。

37、 營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。2、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)條件（1）溫度溫度（2）通氣量通氣量: 在種子罐中培養(yǎng)的種子除保在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質量。氣量可以提高種子質量。例如，青霉素的生產菌種在制備過程中將通氣充例如，青霉素的生產菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內，它們的發(fā)酵單位可相差內，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。倍。但也有例外，例如土霉素生產菌，一級種子罐的但也有例外，例如土霉素生產菌，一級種子罐

38、的通氣量小對發(fā)酵有利。通氣量小對發(fā)酵有利。3、種齡、種齡 種齡：種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。 通常種齡是以處于生命力極旺通常種齡是以處于生命力極旺盛的盛的對數生長期，對數生長期，菌體量還未菌體量還未達到最大值時的培養(yǎng)時間較為達到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。時間太長，菌種趨于老合適。時間太長，菌種趨于老化，生產能力下降，菌體自溶；化，生產能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。緩慢。 不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不同菌種或同一菌種工藝條件不

39、同，種齡是不一樣的，一般需經過多種實驗來確定。不一樣的，一般需經過多種實驗來確定。 嗜堿性芽孢桿菌生產堿性蛋白酶，嗜堿性芽孢桿菌生產堿性蛋白酶，12小時最小時最好。好。4、接種量、接種量 接種量：接種量：是指移入的種子是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。的比例。 接種量的大小決定于生產菌接種量的大小決定于生產菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達到縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達到高峰的時間，使產物的形成高峰的時間，使產物的形成提前到來，并可減少雜菌的提前到來，并可減少雜菌的生長機會。生長

40、機會。 但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產物合成；而且會大會引起溶氧不足，影響產物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經濟；過小會延長過多移入代謝廢物，也不經濟；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產率。培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產率。 通常接種量，細菌通常接種量，細菌15%，酵母菌，酵母菌510%，霉菌霉菌715%、有時、有時2025%。種子質量的控制措施種子質量的控制措施 種子質量的最終指標是考察其在發(fā)酵罐種子質量的最終指標是考察其在發(fā)酵罐中所表現出來的中所表現出來的生產能力生產能力。 首先必須保證生產菌種的穩(wěn)定性，其次首先必須保

41、證生產菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。侵入，以獲得優(yōu)良種子。 菌種穩(wěn)定性的檢查菌種穩(wěn)定性的檢查無（雜菌）檢查無（雜菌）檢查五、生產發(fā)酵罐的無菌接種技術生產規(guī)模發(fā)酵罐的接種，包括兩個方面：生產規(guī)模發(fā)酵罐的接種，包括兩個方面：從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器中移種入從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器中移種入一個種子罐；一個種子罐；從一個種子罐移入另一個生產發(fā)酵罐中。從一個種子罐移入另一個生產發(fā)酵罐中。 壓差法壓差法 接種瓶接種瓶 壓力差壓力差 火焰封口法火焰封口法 在種子罐接種口周圍設有溝槽，溝槽內注在種子罐接種口周圍設有溝槽，溝槽

42、內注入少量酒精，點燃酒精使接種口被圍在一圈入少量酒精，點燃酒精使接種口被圍在一圈火焰之中；在火焰圈中即可將菌懸液倒入種火焰之中；在火焰圈中即可將菌懸液倒入種子罐中。子罐中。 從種子罐到發(fā)酵罐的接種，是通過接種管道，在壓力作用下進行的。從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器接種從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器接種從種子罐接種從種子罐接種編輯ppt83第二節(jié)第二節(jié) 實例實例一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴大培養(yǎng)一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴大培養(yǎng)斜面菌種斜面菌種一級種子培養(yǎng)一級種子培養(yǎng)二級種子培養(yǎng)二級種子培養(yǎng)發(fā)酵罐發(fā)酵罐1、斜面菌種的培養(yǎng)、斜面菌種的培養(yǎng)l菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長而不產酸，并要菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種

43、生長而不產酸，并要求斜面菌種絕對純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培求斜面菌種絕對純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機氮而不養(yǎng)條件應有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機氮而不含或少含糖為原則。含或少含糖為原則。(1) 斜面培養(yǎng)基組成斜面培養(yǎng)基組成 葡萄糖葡萄糖 0.1 蛋白陳蛋白陳 1.0 牛肉膏牛肉膏 1.0 氯氯化鈉化鈉 0.5 瓊脂瓊脂 2.02.5 PH 7.0 7.2 （傳（傳代和保藏斜面不加葡萄糖）代和保藏斜面不加葡萄糖）(2) 培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：3334，培養(yǎng)，培養(yǎng)1824h。編輯ppt842、 一級種子培養(yǎng)一級種子培養(yǎng)l一級種子培養(yǎng)的目的在于大量繁

44、殖活力一級種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強的菌體，培養(yǎng)基組成應以少含糖分，強的菌體，培養(yǎng)基組成應以少含糖分，多含有機氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長多含有機氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長菌考慮。菌考慮。(1) 培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成葡萄糖葡萄糖 2.5 尿素尿素 0.5硫酸鎂硫酸鎂 0.04 磷酸氫二鉀磷酸氫二鉀 0.1玉米漿玉米漿 2.53.5(按質增減按質增減)硫酸亞鐵、硫酸錳硫酸亞鐵、硫酸錳 各各2ppmPH 70編輯ppt85(2) 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 用用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基三角瓶裝入培養(yǎng)基200mI，滅菌后置于沖程，滅菌后置于沖程7.6cm、頻率、頻率96次次min的往復式搖床上振蕩培養(yǎng)的往復式搖床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度3334(3) 一級種子質量要求一級種子質量要求種齡：種齡：12h pH值：值：6.4 0.1光密度：凈增光密度：凈增OD值值0.5以上以上殘?zhí)牵簹執(zhí)牵?.5以下以下 無菌檢查：無菌檢查：(-)噬菌體檢查