第七章 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、第七章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)是指從生物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存、生長(zhǎng)和繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞其結(jié)構(gòu)和功能接近體內(nèi)情況，便于使用各種技術(shù)和方法進(jìn)行研究，并能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)直接觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化過(guò)程中的形態(tài)和功能變化，而且可同時(shí)提供大量生物學(xué)性狀相似的細(xì)胞作為研究對(duì)象，因此，細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中一項(xiàng)非常重要的技術(shù)。但是，細(xì)胞培養(yǎng)作為一種研究技術(shù)也有其局限性，主要是細(xì)胞離體以后失去與其周圍環(huán)境的密切關(guān)系，其生物學(xué)性質(zhì)必然會(huì)發(fā)生某些改變，該因素也不可忽略。 近年來(lái)，細(xì)胞培養(yǎng)

2、技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞工程、老年學(xué)、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)以及臨床學(xué)科基礎(chǔ)研究，并取得了豐碩成果。 細(xì)胞培養(yǎng)不但是一門(mén)技術(shù)，而且是一門(mén)科學(xué)，它有基本理論、基本知識(shí)和基本方法。為了使學(xué)生更好地掌握這門(mén)技術(shù)，我們?cè)诒菊轮兄饕榻B以下內(nèi)容：細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)；細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；培養(yǎng)細(xì)胞的一般觀察方法；培養(yǎng)細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)方法和培養(yǎng)細(xì)胞的凍存技術(shù)等內(nèi)容。第一節(jié) 細(xì)胞培露的基本原理與技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)不但是一門(mén)技術(shù)也是一門(mén)科拿，有專門(mén)的理論、技術(shù)和方法。要想更好地學(xué)習(xí)和掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，應(yīng)該首先學(xué)習(xí)細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理與基本技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)

3、的基本技術(shù)目的要求 (1)掌握體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件。 (2)熟悉培養(yǎng)用品的清洗與消毒原則。 (3)初步了解無(wú)菌操作的基本要領(lǐng)和要求。實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞培養(yǎng)是一種程序復(fù)雜、要求嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞在體外長(zhǎng)期生存，必須模擬體內(nèi)環(huán)境，供給細(xì)胞存活所必須的條件，如水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖、生長(zhǎng)因子(8rowth 5actor)等，還要受到溫度、滲透壓、pH等多種因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)用品的清洗、培養(yǎng)用液的配制、除菌等均有嚴(yán)格的要求，持別是無(wú)菌操作，是細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。為此本次實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行，理論部分重點(diǎn)介紹體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件、培養(yǎng)用品的清洗與消毒、無(wú)菌操作基本要領(lǐng)和要求及細(xì)胞培養(yǎng)用液

4、；實(shí)踐部分分別在細(xì)胞培養(yǎng)室、細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備室進(jìn)行。試驗(yàn)用品 co 2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、電冰箱、離心機(jī)、倒置相差顯微鏡、普通顯微鏡、水純化裝置、拍濾裝置、電子天平、液氯題、洗刷裝置、各類培養(yǎng)用品等。t內(nèi)容與方法(一)培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件 體外培養(yǎng)細(xì)胞所需要的生存條件和物質(zhì)代謝生存環(huán)境的改變也會(huì)出現(xiàn)一定的差異。 1.水的質(zhì)量 水對(duì)維持培養(yǎng)細(xì)胞的生命活動(dòng)是十分重要的。體外培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)水的質(zhì)量非常敏感，在培養(yǎng)用液中任何對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)都會(huì)影響培養(yǎng)細(xì)胞的生存。因此，要求培養(yǎng)細(xì)胞用液必須使用新鮮三蒸水或去離子水配制。 2天蓖環(huán)境 防止污染是保證細(xì)胞在體外存的基本條件之一。在培養(yǎng)環(huán)境中不得有細(xì)菌、病毒、支原體

5、、真菌或其他微生物的存在，因此，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中要努力做到最大限度的無(wú)菌。要保持無(wú)菌環(huán)境，必須嚴(yán)格做到：細(xì)胞培養(yǎng)用品要經(jīng)高壓滅菌處理后才能使用，培養(yǎng)用液要經(jīng)過(guò)除菌處理，實(shí)驗(yàn)過(guò)程要嚴(yán)格按照無(wú)菌操作規(guī)程進(jìn)行。 3溫度 適宜的溫度是保證細(xì)胞在體外生存的重要條件，人和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞員適宜的培養(yǎng)溫度為365土o5，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受性比對(duì)高溫要強(qiáng)。溫度不超過(guò)39時(shí)，細(xì)胞代謝的強(qiáng)度與溫度呈正比。培養(yǎng)溫度高至4142時(shí)，細(xì)胞只能生存很短的一段時(shí)間，10一24h后即行退變或死亡。培養(yǎng)溫度低至2535時(shí)，細(xì)胞仍能生存和生長(zhǎng)，但速度緩慢。細(xì)胞在4能

6、存活數(shù)天，若溫度降至冰點(diǎn)以下，則細(xì)胞可因胞質(zhì)結(jié)冰而死亡。 4滲透壓 人血漿滲透壓約290 mm01L(290 mOsmk8)，可視為培養(yǎng)細(xì)胞的理想滲透壓。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，滲透壓在260一320mm01兒(260一320 mOsm兒8)范圍都適宜。 多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞的適宜pH為7o一74，偏離此范圍會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生有害影響。但各種細(xì)胞對(duì)pH的要求也不完全相同，一般情況下原代培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)pH的變動(dòng)耐受差，連續(xù)性細(xì)胞系(株)耐受性強(qiáng)?？偟膩?lái)說(shuō)，細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些。 細(xì)胞培養(yǎng)中02和cO s是細(xì)胞生存所需要的重要條件。02參與三羧酸循環(huán)可為細(xì)胞提供能量。c02既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，并與維持培養(yǎng)液的pH有直接關(guān)系。 體外培養(yǎng)的細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)必須從培養(yǎng)液中獲取。當(dāng)前在細(xì)胞培養(yǎng)中，廣泛使用合成培養(yǎng)基，其主要成分由氨基酸、維生意、碳水化臺(tái)物、無(wú)機(jī)鹽和其他一些輔助物質(zhì)組成。根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象和目的不同，已設(shè)計(jì)出多種培養(yǎng)基，常用的有：Tcl99、RPMI1640、Ea日1es MEM、DMEM、HamsFl0與F12等*對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞的生存，要想使細(xì)胞更好地生長(zhǎng)和繁殖，