多羥基二苯甲酮類化合物的合成表征與生物活性研究-中山大學(xué)

1、多羥基二苯甲酮類化合物的合成表征與生物活性研究林其先 指導(dǎo)教師：古練權(quán) 馬林* 第五屆化學(xué)院創(chuàng)新化學(xué)研究基金，30(中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣州 510275)摘 要 本文合成了七個多羥基二苯甲酮類化合物，并用IR，HNMR，MS對其進行表征。首次研究了它們對蛋白質(zhì)非酶糖基化，-葡萄糖苷酶，腺苷脫氨酶的抑制作用，獲得滿意效果，最佳半抑制濃度分別達到22.6，67.8，76mol/L。關(guān)鍵詞 二苯甲酮、非酶糖基化、-葡萄糖苷酶、腺苷脫氨酶、半抑制濃度Preparation of Multi-hydroxyl Diphenyl Ketone Compound and Biological Ac

2、tivation ResearchLIN，Qi-Xian GU，Lian-Quan MA，Lin*（School of Chemistry and Chemical Engineering，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275）Abstract Seven kinds of multi-hydroxyl diphenyl ketone compound have been prepared. They were token with IR, HNMR and MS. The inhibitory action of diphenyl ketone to

3、 NEG，-glucosidase and ADA has been studied for the first time. Experimental result indicated that the multi-hydroxyl diphenyl ketone has a better suppression effect to NEG，-glucosidase and ADA. The best IC50 respectively achieves 22.3, 67.8 and 76 mol/L.Keywords diphenyl ketone NEG -glucosidase ADA

4、IC50二苯甲酮類化合物是指含有結(jié)構(gòu)的有機化合物，由于苯環(huán)上取代基的種類，數(shù)目和位置上的不同而使其呈現(xiàn)不同的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)。根據(jù)性質(zhì)上的差異，可將它們應(yīng)用于日常生活的諸多領(lǐng)域。例如二苯甲酮可用做光引發(fā)劑1，應(yīng)用于涂料、油墨、粘合劑、電子器件、光纖材料等行業(yè)。其他的二苯甲酮類光引發(fā)劑還有4-甲基二苯甲酮、2-甲基二苯甲酮、2,4,6-三甲基二苯甲酮等。2,4-二羥基二苯甲酮用做紫外線吸收劑2，可以吸收290400 nm的紫外光，廣泛應(yīng)用于塑料、油墨、油漆、化妝品等領(lǐng)域。二苯甲酮類化合物數(shù)量繁多，當苯環(huán)上的氫被一個或多個羥基取代時，生成一類新的化合物多羥基二苯甲酮。這類化合物用途廣泛，例如2,

5、2,4,4-四羥基二苯甲酮是一種高效水溶性紫外線吸收劑，屬于二苯甲酮類紫外線吸收劑的系列產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于塑料、樹脂、涂料、合成橡膠、感光材料及化妝品行業(yè)3-6。2,3,4, 4-四羥基二苯甲酮7，8是一種重要的有機中間體,用于微電子集成電路工業(yè)的光致抗蝕劑、醫(yī)藥中間體、紫外線吸收劑、樹脂穩(wěn)定劑、染料等。二苯甲酮類化合物的合成方法很多，主要有光氣法9，苯甲酰氯法10，三氯甲苯法11，苯甲酸法12，二苯甲烷法9，格氏試劑法13等，其中苯甲酸法是合成多羥基二苯甲酮化合物常用的方法，例如2,4-二羥基二苯甲酮可通過如下反應(yīng)合成：此法由苯甲酸與多羥基酚發(fā)生Friedel-Crafts反應(yīng)一步合成，具有操

6、作簡單，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品收率高，成本低等優(yōu)點。目前，多羥基二苯甲酮類化合物的研究主要集中在紫外線吸收劑和光引發(fā)劑上，而作為一種醫(yī)藥中間體，有關(guān)二苯甲酮類化合物生物活性的研究卻很少有報道。因此本文在合成系列多羥二苯甲酮類化合物的同時，研究了它們對蛋白質(zhì)非酶糖基化，-葡萄糖苷酶，腺苷脫氨酶的抑制作用?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)如下：化合物化合物化合物化合物化合物化合物化合物圖1 系列多羥二苯甲酮類化合物Fig 1 Multi-hydroxyl diphenyl ketone compound1 實驗部分1.1 儀器與試劑RF-5301PC型熒光分光光度計(日本島津公司)；FLS92型組合式熒光壽命與穩(wěn)態(tài)熒光光

7、譜儀(英國EDINBURGH公司)；UV-2450紫外分光光度計(日本島津公司)；LCMS-2010A液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；TENSOR37型紅外光譜儀(德國BRUKER公司)；MercuryPlus 300核磁共振波譜儀(美國VARIAN公司)；PHS-25型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠)間苯二酚(AR，汕頭市光華化學(xué)廠)；焦性末食子酸(AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；水楊酸(AR，廣州化學(xué)試劑廠)；間羥基苯甲酸鈉(CP，中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W(xué)試劑公司)；對羥基苯甲酸(CP，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；2,4-二羥基苯甲酸(CP，上海試劑三廠)；牛血清白蛋白(BSA，購自華美生物

8、工程公司)；對硝基苯酚葡萄糖苷(pNPG，Sigma公司)；酵母a-葡萄糖苷酶(Sigma公司)；腺苷脫氨酶(ADA，Sigma公司)；腺苷（購自上海伯奧生物科技公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純，所有測試用水為二次蒸餾水1.2化合物的合成稱取間苯二酚5.5 g (50 mmol), 2,4-二羥基苯甲酸8.56 g (55.6 mmol)于250 mL三頸瓶中，加入27.2 g無水氯化鋅(0.2 mol)，25 mL氧氯化膦，裝上回流冷凝管(帶氧化鈣干燥裝置)，70下攪拌回流2.5 h。將反應(yīng)液傾入少量碎冰中，不斷攪拌使氧氯化磷完全水解。于4冰箱中靜置過夜。反應(yīng)液抽濾，固體分別用蒸餾水，3% N

9、aCHO3溶液洗滌兩次，得粗產(chǎn)品。用適量沸水重結(jié)晶(必要時活性炭脫色)，得產(chǎn)品2, 2,4，4-四羥基二苯甲酮，即化合物，沸點197.0199.0。其他化合物可按類似方法得到，反應(yīng)時嚴格控制反應(yīng)物料比，酚酸催化劑 = 50.0 mmol55.6 mmol0.2 mol。1.3 非酶糖基化抑制研究參照Yuanxia Sun方法，稍有修改。牛血清白蛋白(BSA)終濃度為2g/L，NaN3終濃度為2.5mmol/L，果糖終濃度200 mmol/L，碳酸緩沖溶液（pH=9.0）終濃度20mmol/L，樣品終濃度分別為0，10，25，50，100，150mol/L，每個濃度設(shè)置2個平行樣；另設(shè)對照：以同

10、體積的緩沖溶液代替樣品; 不加果糖和樣品溶液的純蛋白組。溶液配制之后，置于50的恒溫箱避光孵育10天后取樣進行熒光光譜分析。取1.5mL的糖基化溶液用緩沖稀釋到3mL，用FLS920熒光光譜儀，激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為420nm，狹縫為1.5nm，掃描發(fā)射光譜，讀420nm的熒光強度得出樣品管A（F）值。應(yīng)用以下公式計算化合物對BSA糖基化反應(yīng)的抑制作用，用抑制百分率（IR）表示：然后以抑制百分率對抑制劑濃度作圖，根據(jù)抑制曲線求得各種化合物的IC50值。1.4 -葡萄糖苷酶抑制研究將一定量活力為U/mg 的a-葡萄糖苷酶（濃度為1 mg/mL）溶于pH = 7，0.05 M的磷酸鹽緩沖

11、溶液中，振蕩1 min，于37下恒溫30 min, 加入底物對-硝基苯酚葡萄糖苷（濃度為2 mg/mL），混合均勻后于= 400 nm處測量吸光度隨時間變化的曲線。改變底物濃度按同樣方法測試，以反應(yīng)進程線的直線斜率為反應(yīng)速率，將反應(yīng)速率的倒數(shù)設(shè)為縱坐標，以底物濃度倒數(shù)為橫坐標作圖，得1 / V 1 / S 曲線，即酶反應(yīng)動力學(xué)曲線，求得米氏常數(shù)Km值和最大反應(yīng)速率Vm。在抑制劑存在下，按相同方法測試a-葡萄糖苷酶的活力，以反應(yīng)進程線的直線斜率為反應(yīng)速度，將該反應(yīng)速度值設(shè)為縱坐標，以抑制劑濃度為橫坐標作圖，得 V I 曲線，求得抑制劑對a-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50 值。本實驗條件下以每分鐘

12、釋放1.0mol PNP為一個酶活力單位。1.5 腺苷脫氨酶抑制研究取pH=7.5磷酸鹽緩沖溶液750l到1.5ml的塑料樣品管中，加入100l腺苷溶液(0.1mg/mL)， 50l乙醇，混均，加入100lADA溶液，測量在265nm出吸光度的變化，掃描90秒。以50l的抑制劑-乙醇溶液代替乙醇進行測試，將兩次測得的結(jié)果進行比較，通過掃描直線斜率的變化確定化合物有無抑制活性。按照1.4類似方法測試，計算二苯甲酮化合物對腺苷脫氨酶的半抑制濃度IC50 值。2 結(jié)果討論2.1 蛋白質(zhì)非酶糖基化抑制研究實驗發(fā)現(xiàn)：未加任何抑制劑的糖基化溶液隨著放置時間的增長，溶液顯棕黃色，而未加果糖的純蛋白溶液透明無

13、色，這說明溶液中的蛋白和果糖發(fā)生了非酶糖基化反應(yīng)。由于糖基化終末產(chǎn)物棕黃色物質(zhì)能夠在一定條件下產(chǎn)生熒光，當我們在糖基化溶液中加入了一定量的被測化合物，熒光強度發(fā)生變化，對于大部分的被測化合物而言，熒光強度變小，并且隨著化合物濃度的升高，熒光強度在逐漸減小，我們初步推斷這些化合物對非酶糖基化反應(yīng)具有抑制作用，我們研究了糖基化抑制程度與化合物濃度之間的定量關(guān)系。得到了二苯甲酮化合物對蛋白質(zhì)非酶糖基化的半抑制濃度IC50 值，如表1所示。由表1可以看出，五種二苯甲酮（2,2',3,4'-四羥基二苯甲酮、2',3,4'-三羥基二苯甲酮、2,2',4-三羥基二苯甲

14、酮、2,2',4,4',6-五羥基二苯甲酮、2,2',3,4,4'-五羥基二苯甲酮）對非酶糖基化有不同程度的抑制作用。其中， 2,2',4-三羥基苯甲酮、2',3,4'-三羥基苯甲酮和2,2',4,4',6-五羥基苯甲酮三種化合物的抑制活性是2,2',3,4'-四羥基苯甲酮的兩倍，2,2',3,4,4'-五羥基苯甲酮的三倍。后兩者在結(jié)構(gòu)上有一致性，苯環(huán)上都有鄰位酚羥基，而前三者沒有鄰位酚羥基，這說明：酚羥基的位置對其抑制活性起到非常重要的作用，相反，此時酚羥基的數(shù)目對其活性沒有顯著的影響。另

15、外一種苯甲酮（2,2',4,4'-四羥基苯甲酮）在340nm的激發(fā)波長的激發(fā)條件下，其在發(fā)射光譜的400450nm具有較強的吸收峰，因此我們無法通過分析熒光強度的辦法研究該化合物對非酶糖基化的抑制作用。表1 二苯甲酮類化合物對AGEs的抑制情況(P0.01)Table 1 Inhibitory action of diphenyl ketone to NEG(P0.01)CompoundsIC50(mM)CompoundsIC50(mM) 22.6 29.2a*46.5>75b*22.3注：化合物a*,b*數(shù)據(jù)由本實驗室李滿妹師姐提供2.2 -葡萄糖苷酶抑制研究實驗研究了

16、七個二苯甲酮化合物(2,2',4-三羥基二苯甲酮、2,3',4-三羥基二苯甲酮、2,4',4-三羥基二苯甲酮、2,2',3,4-四羥基二苯甲酮、2,2',4,4'-四羥基二苯甲酮、2,3,4,4'-四羥基二苯甲酮、2,2',3,4,4'-五羥基二苯甲酮)對a-葡萄糖苷酶的抑制作用。得到其半抑制濃度IC50 值，如表2所示。表 2 二苯甲酮類化合物對a-葡萄糖苷酶的抑制情況Table 2 Inhibitory action of diphenyl ketone to -glucosidaseCompoundsIC50(mM)

17、CompoundsIC50(mM) 199.15144.07144.07173.73 67.8105.9370.34注：本數(shù)據(jù)是由王渝芳師姐協(xié)助完成結(jié)果表明，化合物和的抑制效果最好，IC50分別為67.8和70.34mmol/L，是化合物的1.5倍，化合物和的3倍，化合物和的2倍。構(gòu)效關(guān)系表明，抑制效果不僅與苯環(huán)上取代羥基的數(shù)目有關(guān)，還與其取代的位置有關(guān)。其中羥基越多，抑制效果越好，且間位羥基取代為必需，各取代位置對抑制效果的貢獻為：間>鄰>對，具有鄰苯三酚結(jié)構(gòu)的二苯甲酮其抑制效果最好。2.3 腺苷脫氨酶抑制研究實驗研究了六個二苯甲酮化合物(2,2',4-三羥基二苯甲酮、2

18、,3',4-三羥基二苯甲酮、2,4',4-三羥基二苯甲酮、2,2',3,4-四羥基二苯甲酮、2,3,4,4'-四羥基二苯甲酮、2,2',3,4,4'-五羥基二苯甲酮)對腺苷脫氨酶的抑制作用。得到其半抑制濃度IC50 值，如表3所示。表 3 二苯甲酮類化合物對腺苷脫氨酶的抑制情況Table 3 Inhibitory action of diphenyl ketone to ADACompoundsIC50(mM)CompoundsIC50(mM) -8185- >10076注：本數(shù)據(jù)由代陪鋼師兄協(xié)助完成結(jié)果表明，化合物、和抑制效果較好，化合物

19、較差，化合物和幾乎滅由抑制作用。構(gòu)效關(guān)系表明，苯環(huán)上酚羥基的位置對抑制活性起主要作用，酚羥基數(shù)目對其活性影響較小。不同取代羥基對抑制效果貢獻為：間(略)>對>>鄰。致 謝本文是在古練權(quán)老師、馬林老師、王渝芳師姐的悉心指導(dǎo)下完成的，在此特向他們表示由衷的敬意和至深的感謝！同時要感謝化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院第五屆創(chuàng)新化學(xué)實驗與研究基金。最后還要感謝實驗過程中每一位給予過我支持與幫助的老師、同學(xué)和朋友。參 考 文 獻1 李鴻州、高天星，光引發(fā)劑的發(fā)展概況，甘肅化工，2000，2：542 程其時、馬永國，二苯甲酮類紫外吸收劑的發(fā)展趨勢，中國塑料，1996，6：33 NeumannP，AumuellerA，Process for preparation of 2,4-dihydroxybenzophenone PUS：4990680，1991-02-054 BEAUJP，Process for the manufacture of hydroxyalkoxybenzoph