用QuantityOne進行定量分析的方法

1、用 quantity one進行定量分析的方法牛物技術(shù)2009-09-06, 21:17葉林quantity one是bio-rad公司的凝膠電泳圖像獲取、處理以及定量分析軟件。功能很強大，到底多么強大在這就不 說了。用處很多，到底多么多在這也不說了，具體功能請參考quantity one使用說明及相關(guān)教程。下面只是quantity one用于dgge結(jié)果定量分析的一般操作方法:有下面這么一張dgge圖像，需要分析一下左邊第5條泳道的8個條帶対應(yīng)的dna在樣品中占的百分比各分別是多 少。第一步：建立泳道點擊菜單欄"lane-auto frame lanes?, 一般情況下quanti

2、ty one會自動識別并建立泳道。但也有很多時候不能自動建 立泳道，這就需要選擇菜單欄lane- frame lanes.w然后輸入要建立泳道的數(shù)目，手動建立泳道。泳道建立后需要調(diào) 整，在菜單欄uane-edit framed有拉伸、旋轉(zhuǎn)、移動、添加/刪除錨點等選項，通過這些選項可以對泳道進行調(diào)整， 調(diào)整后大致如下：第二步：消除泳道背景點擊菜單欄/zlane-lane background.w跳出一個對話框，"all lanes"中選擇第二個，然后點一下第5條泳道，"selected lane"的下面會顯示selected lan:#5(#5),然后選擇

3、"lane on" rolling disk size中填一個1020之間的數(shù)(可以多嘗試 兒個，看看效果)，最后點"done"完成操作。第三步：建立條帶點擊菜單欄z'band->detect bands."打開一個對話框，調(diào)整sensitivity和lane width的數(shù)值，使每個條帶都被檢測到， 如果條帶上面顯示的是一條紅線，可以在''band-band attributes"的style欄中選擇brackets,使之顯示為括號形式。 條帶建立后圖像顯示如下：第四步：生成報告點擊菜單欄"r

4、eport-lane report"然后點一下第五條泳道，在彈出的對話框的measurements 欄中選擇trace qty （個 人感覺選擇這個比較合適，也可以選擇其他的看看效果），然后點report,就看到了每個條帶的trace qty值，這個 值與dna的濃度呈正比，根據(jù)這個值計算百分比即可。以上僅僅是quantity one進行定量的簡單流程，非常不具體，一些具體的參數(shù)設(shè)置及軟件的其它功能請參考相關(guān)的 使用說明或教程。另外，不確定上面的操作是否有不當之處，如有請多指教。需要特別說明的一點是：對于一個從復雜的環(huán)境樣品中提取的dna,經(jīng)過pcr-dgge,然后用quantity

5、 one定量， 通過分析每條條帶的intensity來計算百分比，然后估計原始樣品中各個物種（比如細菌）的百分比，這樣的做法是 非常不準確的，這種數(shù)據(jù)發(fā)paper可能不會被接受，因為整個過程中存在很多bias。同理，t-rflp也存在類似問題。quantity one施用教程大全（轉(zhuǎn)貼）2010-11-11 09:531 -內(nèi)容簡介凝膠電泳是每個做份子有牛命的物質(zhì)學的同窗天天都要打交道的基木技術(shù)。電泳然后的信息處理 與電泳本身同樣重要。今朝有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，比較有名的比如bandscan. bandlcadcr> sigma gel等等。今口要向大家介紹的是來自bio-ra

6、d的ii）凝膠定量軟件quantity one （bio-rad述有一個做2d凝膠分析的軟件pdquest）。這個軟件的最新版本可以在bio-rad的主頁不 收費下載。今朝的最新版本是4. 52版2 - quantity one的定量方法quantity one的分析功能顧名思義首要用來舉行凝膠或培養(yǎng)皿的熒光定量分析。它的分析功能 或說分析方式首要有4種：泳道/條帶軌跡定量法；等高線直接定量法；菌落計數(shù)；份子量測定這三種方法中施用最為利便也是最為廣泛的應(yīng)該是等高線定量法（volunrn contour）。它經(jīng)由過 程半auto描繪電泳條帶的等高線邊沿來得到等高線區(qū)域內(nèi)部平面或物體表面的大，再將

7、該平面或物 體表面的大乘以區(qū)域內(nèi)平均光疏密程度值當?shù)綏l帶內(nèi)部總的信號量。固然這種分析方法的蠹弊顯而易 見：無法同等得排除不同泳道的配景亮度；等高線的繪制處于“半auto”狀態(tài)，即需要人為判斷作 為等高線標準的電泳條帶的邊沿；最致命的是在幾個電泳條帶距離十分接近的時辰幾乎無法繪制純一 條帶的輪廓（常出現(xiàn)持續(xù)的兒個條帶等高線相連而無法分離出獨自條帶的輪廓）。三種方法中個人感覺最為科學和嚴謹?shù)膽?yīng)該是泳道/條帶軌跡定量法（trace tracking） o這種 方法施用起來步調(diào)較為繁瑣，必需經(jīng)由過程泳道識別-一電泳條帶識別兩個持續(xù)的步調(diào)才氣舉行定量。 然而這種方式的最大長處在于它可以純粹丟棄人為主觀因

8、素舉行全auto定量。他的定量方式為：首 先根據(jù)不同電泳條帶的光疏密程度值繪制光疏密程度曲線，然后計算光疏密程度曲線下平面或物體表 面的大作為電泳條帶的定量根據(jù)。大家可能會問他能不能排除泳道配景？謎底是必定的，它能夠最大 程度的排除不同泳道之間的配景差異，讓各個泳道上的不同電泳條帶在一條幾乎不異的開始跑線上舉 行相比較。這個配景排除功能是等高線法無法做到的（等高線法也有基本的配景排除措施，但是和泳 道/條帶軌跡定量法的配景排除不是一個等級的。等高線法只能排除同一泳道上的配景，而不能均等 的排除不同泳道的配景)。另外泳道/條帶軌跡定量法還可以聯(lián)合gauss model bands對緊密相連的 電

9、泳條帶舉行分析，而這種條帶也是等高線法無法分析的。我們這次重點學習這個方法。第三個分析功能是菌落計數(shù)(colony counting)。這個功能其實很實用，可以分析藍白篩選的 結(jié)果。但是很奇怪my computer居然無法運行這個功能，因此無法向大家介紹了。另外quantity one還可以經(jīng)由過程回歸曲線測定份子量。下面讓我們了解一下quantity one經(jīng)常使用的基本菜譜操作。打開文件：由于quantity one是bio-rad的硬件組成一套軟件，因此quantity one可以auto 輸入來自bio-rad公司的凝膠分析儀的數(shù)據(jù)。具體支持哪些硬件大家可以在“edit-prefere

10、nce-imagers”里面設(shè)置。如果您的實驗室沒有接納bio-rad的硬件設(shè)施也沒瓜葛。 您只要將電泳圖片用acdsee等程序轉(zhuǎn)換為ttf圖片格式就能夠被quantity one識別了。注重 quantity one只支持8位和16位灰度的tif文件。quantity one彷佛有一個小bug,就是在按“open”然后并沒有立刻彈出資源管理器讓你選擇方 針文件的位置。其實你只要將鼠標在熒幕右下方點擊一下，資源管理器就會乖乖彈出來了.quantity one只能分析口的顏色配景玄色條帶的電泳圖。而我們正常環(huán)境下得到的一般都是玄 色配景白的顏色條帶的電泳圖。我們可以在"image-ln

11、vert data中將圖片顏色舉行反轉(zhuǎn)，然后即 可以用quantity one舉行分析了.文字注解：quantity one提供基本的文字注解功能。您可以在您的電泳圖片上記載您的分析結(jié) 果比如電泳條帶的份子量、光疏密程度值、事物的量等等。這個功能可以經(jīng)由過程“edit-text overlay tools"來使成為事實。在彈出的浮動工具欄入選擇“abc”或“”就能夠舉行文字輸入和畫 標志線的操作。光疏密程度工具：在"view-plot density"的下級菜譜中大家會見到幾個和電泳條帶光疏密程 度值相干的預示選項。大家可以別離選擇不同的選項感受一下它們z間的不同

12、。選擇方法是點擊響應(yīng) 的下級菜譜比如“plot cross section” ,然后將變成帶一個藍色感慨號的鼠標移到您想懂得光疏密 程度的位置，點擊一下就會預示該處的光疏密程度和干信息。鄙人面這幅圖片中我們可以看見兩條黃 線交叉處的電泳條帶的相干信息。上方的一串曲線是不同泳道之間在同一平行線上的光疏密程度比率 曲線；左邊是黃線交叉處地點泳道的幾個電泳條帶的光疏密程度漫衍環(huán)境。3d viewer：在“view-3d viewer”菜譜中大家會看到一個有趣的功能叫做3d viewer。這個玩 意按照bio-rad的說法可以輔助鑒別兒條緊密相連在一路的電泳條帶的漫衍環(huán)境。大家只要選擇了這 個號令后鼠

13、標就會一個“”型，然后將 型移動到您感興趣的位置，拖動鼠標畫出一個正方形區(qū)域, 然后用鼠標雙擊，quantity one就會將這塊區(qū)域按照gauss漫衍規(guī)律渲染成一個三維模子，頗有意 思。但個人感覺這個功能噱頭多于實用。4 - quantity one的基本配景排除功能最起頭的時辰我們就說過quantity one的等高線定量模式也有一種比較基本的配景排除方法。 這個方法同樣也合用于泳道/條帶定量模式。此刻我們就來學習這個方法。基本配景排除的功能位于“ image-subs tract backgroud. ”和 “image-filter wizard. w 這兩個菜譜。image-filt

14、er wizard：這個功能是對原始圖片做一些開真?zhèn)€加工，主如果祛除一些圖片上的“斑 點”。這些斑點首要有兩種類型：一種是深色的“胡椒面”型和淡色的“食鹽”型，兩種斑點都可以 毫不猶豫地去除。從uimage-filter wizard. ”菜譜調(diào)出向?qū)Р俗V后選擇"pepper"和“salt” , 下面兩個選項可以按照程序默許的選項，然后“0k”就能夠完成這第一步的降噪歷程。image-substract backgroud：這個功能是真正對圖片配景舉行清理的工具(區(qū)別于 "image-filter wizard.的降噪模式)。只是這種清理是一種“全局”型的清理,即

15、它以不異的 參量對每條泳道舉行配景清理。然而在清理方式上它照舊可以分成兩種不同的方式：backgroud box： 一種是以一個局部小平面或物體表面的大為標準配最，將整張電泳圖片上所有 比該區(qū)域光疏密程度值低的區(qū)域全部漂白。這種發(fā)型稱為“backgroud box”。操作時用鼠標選中對 話框下部左側(cè)的“backgroud box”按鍵，然后用鼠標在電泳圖片上選擇一塊顏色近乎配景色，色澤 比較勻稱的區(qū)域，用鼠標拖動畫出一個正方形。開釋鼠標后程序就會當即對電泳圖片舉行降低配景的 處理；backgroud stripe：相對于“backgroud box”來講是一種更加智能化的處理方式。它出格合用

16、于梯度凝膠，即凝膠濃度由上至下依次變化。由于梯度膠的光疏密程度值在一定距離內(nèi)不斷變化，因 此如果接納“backgroud box”的方法除配景就會發(fā)生偏差。quantity one此吋提供一種隨著凝膠濃 度變化而變化的除配景方式就是ubackgroud stripe”。和ubackgroud box”近似，選擇右下角的 “backgroud stripe”按鍵，然后用鼠標沿著電泳泳道拖放形成一個狹長的剪影帶(stripe),這個 剪影帶內(nèi)部的光疏密程度值順著泳道逐漸升高或降低。quantity one根據(jù)這個stripe可以動態(tài)的對 整張圖片的配景舉行剪影。比如泳道肇始處光疏密程度低，那末qu

17、antity one在此處的剪影值也降 低；隨著stripe向前延長，光疏密程度值逐漸升高，quantity one也同樣不斷加人剪影的強度。這 樣一來就能夠排除由于梯度膠帶來的配景不相符的影響因素。5 - quantity one的電泳泳道分析功能創(chuàng)建泳道前面說過quantity one之所以強犬是因為它具有的泳道/條帶軌跡定量法。此刻我們就來學習一 下如安在電泳圖片上創(chuàng)建泳道(lane)和怎樣舉行針對不同泳道的配景排除。創(chuàng)建泳道：首先打開我們要分析的電泳圖片(以卵口質(zhì)電泳為例)。然后選擇ulane-auto frame lanes”。這時候如果您的電泳圖片比較標準的話，quantity o

18、ne就會auto識別出每條電泳泳道的 位置，而且將各個泳道的路徑用一條紅線標畫出來；如果您對軟件auto標志的泳道不其對勁，您可以經(jīng)由過程“kme-edit frame”下級各個子菜譜 提供的功能對泳道框架位置、大小等舉行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)方法就是經(jīng)由過程鼠標的拖放來使成為事實，大 家可以本身體驗一下；如果您只消分析此中幾個泳道的數(shù)據(jù)而不想其它泳道的標志滋擾您的眼看東西假想線，您可以經(jīng) 由過程"lane-single lane-remove lane”刪除您不需要的泳道的標志。不是所有的電泳圖片的泳道都能夠被quantity oneauto識別。在不能auto識別的環(huán)境下,quantity

19、one就會彈出對話框告訴您它不能識別泳道。這時候大家就需要手工繪制電泳泳道。方法 和上邊同樣，同過ulane-single lanc-crcat lane”來使成為事實。只要用鼠標在您的電泳圖片上 順著待標志的泳道的中軸線拖放就能夠繪制岀該泳道的標志紅線.6 - quantity one的電泳泳道分析功能排除配景前面說過quantity one z所以強大是因為它具有的泳道/條帶軌跡定量法。此刻我們就來學習一 下如安在電泳圖片上創(chuàng)建泳道（lane）和怎樣舉行針對不同泳道的配景排除。排除配景：首先請大家注重，這個排除配景和前面我們在“image”菜譜中施用的“substruct backgrou

20、d"有所不同。后者排除配最的對象是全般電泳圖片而非將各個電泳泳道的配最別離舉行排 除。此刻我們要學習的這個號令可以幫忙我們別離排除各個泳道（也能夠?qū)⑷坑镜烙貌划悩藴逝e行 排除）的不同的光疏密程度配景。這個功能對我們以后的分析影響甚大，大家一定好好學習。首先我們要將我們的電泳圖片舉行前面談到的泳道識別，不論是auto方式照舊手工識別。然后 選擇"lane-lane backgroud. . "號令。選擇該號令后，鼠標即變成一個綠顏色的“”,將鼠標移 到您籌算舉行配最排除的泳道（比如下圖中的第4泳道），點擊左鍵一下，立刻就會彈出如下圖所示 的對話框。此屮"

21、optical density”預示得是該泳道光疏密程度值的漫衍環(huán)境。大家會注重到這個漫衍曲 線其實不是緊貼著縱軸，而是位于縱軸上方漫衍。造成這個“懸在空中現(xiàn)象”的緣故原由就是該泳道 自身存在著一定的光疏密程度“配最”。這個配景的存在導致該泳道上各個電泳條帶之間不能處于同 一水平舉行相比較；如果思量到相鄰的其它泳道更是因為不同配景的存在而無法相比較不同泳道上的 不同屯泳條帶。怎樣去除這個配景呢？我們繼續(xù)看右面的“l(fā)ane backgroud substruction”對話框。 這個對話框的上方"all lancs"表示可以對所有泳道舉行一次性處理；下方的“selected

22、lane”表 示僅針對這次選中的這個泳道舉行處理（我們選中的是第4泳道）。我們用鼠標選擇“selected lane” 的“l(fā)ane on”選項。然后鄙人面的"rolling disk size”里填上“5” ,再按“回車”鍵。好！大 家再來看看此刻“optical density"中出現(xiàn)了一條緊緊沿著光疏密程度曲線漫衍的深赭色曲線。這 條曲線將泳道的配景與電泳條帶的光疏密程度漫衍十分精確的區(qū)分清楚隔來。大家可能會好奇這搭的“rolling disk size”指得是啥子意思？我們可以將quantity one提供 的去除配景功能想象成是一個骨碌的小球。如果這個小球的半徑越

23、小，那末它沿著光疏密程度曲線骨 碌時滾過的路徑就越發(fā)精致，具體反映在深赭色曲線的軌跡越發(fā)靠近玄帶顏色的光疏密程度漫衍曲線 的基線。因此從理論上來講“rolling disk size"的取值越小，它的去除配景效果越好。大家可以 試著選擇一個較大的值比如80,再來看看此時深赭色曲線的軌跡。固然也不能取過小的值。因為如 果取值過小，大家可以想象這個十分微小的球就會滾入光疏密程度曲線內(nèi)部，造成有用陽性信號的損 失。個人感覺520是一個比較好的取值范圍.0k!我們再在 lane backgroud substruction"對話框的最下方鉤選"show lane trac

24、e with backgroud substmctcd” ,再來看看是否泳道上所有的配景都被消弭了？各個電泳條帶是否純粹聯(lián) 合到縱軸上在同一水平舉行比較了？我們對其它泳道也能夠依葫蘆畫瓢舉行近是的配景排除工作。如果大家覺得可以施用同樣的標 準，即不異的"rolling disk size”舉行排除,那末我們可以在alane backgroud substructionw 對話框入選擇上方的"all lanes on （same level）”選項。然后在"rolling disk size”中填上一 個合適的值，點擊“done”按鍵確認就能夠了。此時該電泳圖片上所

25、有的泳道都以不異的標準舉行了 配景去除。不信你可以本身將鼠標點擊其它泳道（比如第8道或第1道），你會發(fā)明所有泳道的配景 均已去除。7 - quantity one的電泳泳道分析功能 相比較泳道剛才我們已經(jīng)對電泳圖片上的泳道舉行了識別和配景去除。此刻我們可以利用quantity one提 供的泳道相比較功能對同一張凝膠相片上的不同泳道舉行相比較，看看每條泳道上電泳條帶的漫衍環(huán) 境。泳道相比較：首先將打開的電泳相片舉行前面談到的泳道識別和去除配景步調(diào)。然后選擇 "lane-compare lanes"號令，鼠標變成“藍色感慨號”然后將鼠標移動到您但愿舉行相比較的泳道 _e（比如

26、下圖的第3泳道），左鍵點擊，quantity one就會立刻探出一張玄色配景的“conipare lanes” 對話框。在這個對話框中紅色的曲線代表您選擇的泳道的光疏密程度漫衍曲線。曲線的波峰部門表示 位于泳道上的不同電泳條帶；波峰的凹凸象征電泳條帶光疏密程度值的人?。徊ǚ宓膶捳笳麟娪緱l 帶的寬度；波峰由左至右表示各個電泳條帶順著泳道由后向前的漫衍。大家請注重這個紅色曲線。它不僅只提供給我們關(guān)于泳道上光疏密程度的漫衍環(huán)境，更重要的是 鄙人一步我們對電泳條帶舉行定量的時辰，我們將以每個波峰的曲線下平面或物體表面的大作為定量 的標準.我們還可以用鼠標點擊其它我們感興趣的泳道（比如下圖中第六、9、

27、14泳道），這時候再轉(zhuǎn)到 ucompare lanes”對話框我們會發(fā)明quantity one已經(jīng)幫我們用不同顏色在同一張圖片上繪制出了 這4條泳道的相比較圖。是不久短常pp?8 - quantity one的電泳條帶分析功能 創(chuàng)建條帶前面我們已經(jīng)識別和分析了電泳圖片的泳道，下面我們起頭研究電泳條帶的問題。首先在這搭明 確兩個名詞翻譯：“l(fā)ane”指電泳泳道；“band”指電泳條帶。鄙人類社會文化中一例施用這兩個英 文名詞來表示這兩個意思。屯泳條帶的識別：和前面研究sne同樣，首先我們要對lane ±的band舉行識別。識別方式同 樣分為auto識別和人工識別。auto識別的時辰選

28、擇uband-detect bands. ”號令。這時候quantity one會auto彈出一個“detect bands”的對話框（如下圖）。首屆用quantity one的朋友可能會發(fā)明您的bands識別以后僅只是畫出了一條紅色的粗線，而 在上邊的演習圖片中倒是上下括號的形式。其實大家可以在uband-band attributes”選項中設(shè)置 bands的預示形式。鄙人方的“style”選項卡入選擇“brackets”就會將原來的粗線改為括號形式 了.在上邊的對話框中，我們可以指定識別的參量。如果要auto識別所有l(wèi)anes _t的bands就鉤選lands后面的“all”選項；如果僅

29、只想auto識 別某一條lane ±的bands就鉤選“one” ,然后在后面的輸入框中填上您想識別的泳道號碼；如果僅只想識別泳道上部門光疏密程度值最強的bands,可以在“bands”后面的選項入選擇 “l(fā)imit” ,然后填上響應(yīng)的數(shù)目（比如10） o quantity one就會僅識別該泳道上光疏密程度最大的 10 條 bands；如果您發(fā)明auto識別的bands寬度太窄，圈定band的紅色括號內(nèi)范圍小于玄色的光疏密程度影。 此時可以施用“l(fā)ane width”號令來調(diào)整bands識別的寬度。用鼠標點擊“l(fā)ane width”后面的向上 箭頭就會發(fā)明紅色括號逐漸變寬，最后要求

30、其范圍略為寬過其包繞的band影跡；如果您發(fā)明auto識別功能沒有識別您想要的band或誤識別了您不想要的band,您還可以施用 上邊的工具欄舉行調(diào)整。將您的鼠標指向每個圖標，quantity one就會懂得彈出一個*的提示信息告 訴您這個按鍵的功能。在此再也不繼續(xù)闡述了。9 - quantity one的電泳條帶分析功能高斯建模與結(jié)果分析此刻我們已經(jīng)完成為了泳道識別、配景去除、條帶識別的任務(wù)。接下來我們要對bands舉行一些 處理，然后就能夠舉行最終的結(jié)果分析了。高斯建模：大家學過計數(shù)學知識后都懂得高斯（gauss）漫衍是個啥子意思，在此我就未幾作解 釋了。quantity one認為一個理

31、想狀態(tài)的band內(nèi)部的光疏密程度漫衍應(yīng)該也服從高斯曲線的特性， 正如前面向大家展示的31） viewer屮的圖片那樣。在我們同樣平常的電泳泳道屮時常出現(xiàn)幾個相隔很 近的bands （即份子量很接近的幾個卵白或核酸）在泳道的某個區(qū)域成串出現(xiàn)。此時我們很難經(jīng)由過 程會自等高線的措施精確的描繪出每條band自力的輪廓。這個時辰我們就需要對這些擁擠在一路的 bands舉行高斯建模處理。quantity one能夠依據(jù)高斯曲線的特性，配合有用的配景去除，將各條緊 靠在一路、界限彼此融合的bands描繪成具有自力光疏密程度漫衍的彼此疊合的曲線。如下圖所示， 原來彼此融合的22、23兩條bands經(jīng)過高斯建

32、模然后變成為了兩個具有自力漫衍曲線，彼此疊合的 bandso高斯建模必需建立在有用的泳道配景去除然后。配景去除的方法可以參見我們前面的方法，即經(jīng) 由過程ulane-lane backgrouds”的方式舉行去除配景。去除配景的吋辰最佳選擇rolling disk size 小一些的方案。這樣配景去除后的光疏密程度漫衍曲線和高斯建模后的光疏密程度漫衍曲線才氣比較 好的吻合。另外高斯建模其實不是一個必需的步調(diào)。它僅只在出現(xiàn)多條bands緊密擺列在一路，以至 于無法分辯它們之間的間隔的時辰才最有用。如果bands在泳道上松散的漫衍則可以不施用高斯建 模.那末怎樣舉行高斯建模呢?很簡單！只要執(zhí)行“ba

33、nd一gauss model bands. ”號令就能夠，執(zhí) 行后quantity one回彈出一個對話框問您要對那條泳道舉行高斯建模。請鉤選“one” ,然后再輸入 需要建模的泳道代碼就能夠了（比如下圖中的第2泳道）；如果選擇了 “all”則對所有泳道舉行高 斯建模，固然建模這么多泳道會費一點兒時間了。察看結(jié)果：執(zhí)行完高斯建模以后施用uband-band informati011號令來察看結(jié)果。方法是將變 成藍色驚嘆號的鼠標移到剛才己經(jīng)識別的band的部位，一個詳細的"band information”信息框就 會立刻彈出來（見下圖）。在這幅圖中我們必需注重的是“trace”和/或

34、“gauss model trace", 因為我們剛才辛苦了半天就是為了得到這個數(shù)據(jù)。這個數(shù)據(jù)表示的就是band光疏密程度漫衍曲線下 平面或物體表面的大，也就是quantity one用來表達band內(nèi)份子總量的方式。在這個信息框中還有 一些重要信息比如“molwt”（份子量）；“quantity/units”等此刻照舊空缺，咱們下以后的分析 步調(diào)屮將逐漸填滿它們。quantity one有一點兒讓人感到很半大白。它的"trace”和“gauss model trace”都是表示 曲線下平面或物體表面的大的，可是施用的單元是0d*mm；而在另外的等高線定量方法中，同樣是表

35、示某個區(qū)域平面或物體表面的大的單元倒是0d*mm2.下面讓我們回過甚來看看高斯建模然后電泳圖片的分析結(jié)果到盡頭發(fā)生了啥子變化。首先是一張 沒有舉行高斯建模的圖片，大家可以看到在這張圖片中的白框部門，第2泳道的第6個band的光疏 密程度曲線*部門其實不呈高斯對稱（少了一部門不是？）。這是因為它一部門和鄰近的band彼此融 合在一路了。此刻再來相比較一下經(jīng)過高斯建模后的電泳圖片分析結(jié)果。照舊在不異位置，這時候代表第2 泳道第6個band的*光疏密程度曲線是否呈完備的高斯對稱了？而且后面的“gauss model trace" 也再也不是“n.a” ,而變成為了 “0.717 0d” ,

36、相比較上邊的“trace”二0.693 0d,大家想想為啥 子要大一些呢？! 10 - quantity one的電泳條帶分析功能份子量預先推測前面我們和大家學習了用quantity one舉行電泳條帶定量的基本方法。此刻我們暫時轉(zhuǎn)移眼看 東西假想線來探討一下另外一個功能，份子量預先推測。這個功能對卵白質(zhì)而言是份子量預先推測， 對核酸而言就是核酸大小的預先推測了。下面我們照i口以卵白質(zhì)為例來學習。份了量預先推測：首先大家必需懂得的是份了量的預先推測是建立在泳道和條帶都已經(jīng)創(chuàng)建好的 根蒂根基上。我們只是人為的為一些泳道上的條帶加上一個已知的標準，然后經(jīng)由過程不同泳道和條 帶z間的相比較繪制回歸曲

37、線，經(jīng)由過程回歸曲線的走歷來預先推測特別指定條帶上的份子的份子 量。i古i然如果我們能夠在一次電泳中多跑幾條不同份子量身分的marker,肯定是能夠提高我們預先 推測的準確性。下面我們談?wù)勗鯓硬僮?。在已?jīng)創(chuàng)建好泳道和條帶的圖片上，執(zhí)行“match-standard”號令，在 彈出的uselect standards”選項卡入選擇一個合適的markero如果您本身已經(jīng)跑了 marker,那末 請選擇“new standard創(chuàng)建您本身的marker,然后在彈岀的"standard"菜譜中輸入您的marker 的份子量。如下圖在“standard”中輸入一個名稱，然后鄙人面的表

38、格中輸入各個marker的份子量 和名稱。輸入完成以后用鼠標點擊“typo”下面的小箭頭（上圖鼠標指向的位置），然后把變成綠顏色加 號的鼠標移動到您的marker泳道上響應(yīng)的band。例如上圖中200kd就移動到第15泳道的200kd的 位置，以此類推，將每個marker都標志上響應(yīng)的數(shù)字。標志完成后，maker泳道上的bands就會變 成藍色。如果您有多條marker泳道，您可以再多表記幾條以提高軟件預先推測的準確性。此刻我們執(zhí)行 match-standard curve” ,然后用鼠標隨便點擊我們想要了解的泳道，quantity one立刻就會為 我們預示出一條曲線，當中還有一個小的對話框

39、"std. curve options for proteins” ,在這個對話 框中 “regression model"選擇"point to point semitog” 或"elder-southern” 這兩種回歸方 式；然后鉤選當中的“show numerical data of points”，這吋候再看那條曲線上是否已經(jīng)標注了 很多數(shù)字？這些數(shù)字就是水平方向上對應(yīng)的bands的份子量了。上邊說明說過,在band information中除了 "trace”和“gauss model trace”之外我們還有 兒個項目沒有填入數(shù)據(jù)

40、。這些其時未填入的數(shù)據(jù)其實是“mol.wt”和“quantity/unit”這2項。剛 才我們已經(jīng)學習了怎樣預先推測份子量，大家此刻再用“band-band information"號令看看您感興 趣的band,是否“mol. wt”已經(jīng)被填上數(shù)字了?此刻只剩下“quantity/unit”，讓我們起頭學習怎 樣測定具體的定量值（原來測定的僅只是光疏密程度值和band z間的事物的量的比，而沒有落實到 具體的實際數(shù)字）。創(chuàng)建定量標準：所謂創(chuàng)建“定量標準”其實近似于剛才我們設(shè)置的份子量markero只不外這搭 我們用已知band的事物的量做為marker,就像用5ul的dl2000跑電

41、泳，每條band含50ng的雙鏈 dnao 具體操作如下：執(zhí)行 uanalysis-quantity standards” ,在彈出的 “calibration curve” 對 話框入選擇ucreat new” ,在隨后的uquantity standardsn對話框中填寫一系列相干信息。重要 的信息包孕：1. “units” :指作為marker的事物的量的單元，例如ng, ug, mg等等。2. "measure” :指對maker和待測band的丈量方式。點擊“measure”按鍵后可以選擇“trace densitynucontour densityn 、 "pe

42、ak densityn 和 aaverage densityn 。如果您前面的分析 接納的是軌跡法定量的話可以選擇“tr“ce density” ；如果您接納的是等高線法定量可以接納ucontour density” 。3. "select” :在"select”后面有三個選項，band、match> lane。選中此中一個選項比如 “band”，然后將變成向上小箭頭的鼠標指向您木身跑的marker條帶，點擊左鍵，就會發(fā)明此時該band已經(jīng)變成*。您可以多點選幾個作為marker的bands（至少3個，越多越好），然后冋到“quantity standards”框。這時候框下部的表格變成可填寫狀態(tài)，在uquantity ugn屮填入響應(yīng)的數(shù)字，每個 數(shù)字對應(yīng)您剛才標志的作marker的bands。后面的"dilution factor”項可暫時不管；其它兩項 “l(fā)ane”和“match”首要用來一次性填入一條泳道上所有的b