藥物分離純化技術(shù)---制備色譜分離技術(shù)

1、制備色譜技術(shù)制備色譜的特點：n 最有效的制備性分離技術(shù)；n 實驗室規(guī)模、小批量生產(chǎn)、產(chǎn)業(yè)化制備；n 不同領(lǐng)域產(chǎn)品量不一樣，闡明化學結(jié)構(gòu)和生物活性，3050mg足夠，分析用標準品100mg以上，有機合成通常需要g級以上；薄層色譜柱色譜1制備色譜技術(shù)制備薄層色譜法a. 設(shè)備簡單，操作方便、分離快速、靈敏度及分辨率高；b. 切割譜帶更加方便；c. 自動化：自動點樣儀、自動程序展開儀、薄層掃描儀、多種強制流動技術(shù)、多種聯(lián)用技術(shù)如傅立葉變換紅外、拉曼、質(zhì)譜等。2制備色譜技術(shù)常規(guī)制備薄層色譜PTLC薄層板制備 為了增大上樣量，增加了吸附劑用量。固定相：硅膠、氧化鋁、纖維素、C2、C18等反相健合硅膠支撐：

2、玻璃板或鋁箔平均25m, 540 m硅膠H、硅膠G、硅膠F254、硅膠F365、硅膠P3制備色譜技術(shù)硅膠粒徑范圍影響：1. 越細越均勻，分離度越高，但？2. 粒徑范圍寬，分離效率低，怎么辦？-薄層厚度的漸變 薄層厚度從底部到前沿逐漸增加，這樣展開劑的速度逐漸變慢，樣品譜帶在展開過程中逐步富集，可保持較窄的譜帶。4制備色譜技術(shù)薄層板的制作方法： 常采用濕法：平鋪法和涂鋪法?；旌掀戒佂夸伷髯匀桓稍镆灰?05-120活化黏合劑硅膠煅石膏或羧甲基纖維素鈉水溶液5制備色譜技術(shù)薄層色譜條件選擇操作參數(shù)流速展開模式分離距離樣品量流動相選擇性溶劑強度黏度展開缸類型薄層板和展開缸空腔體積比值溫度蒸氣相固定相薄層

3、厚度顆粒大小質(zhì)量開放型操作不連續(xù)6常用溶劑(1)電子接受體溶劑：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等；(2)質(zhì)子給體溶劑：異丙醇、正丁醇、甲醇、無水乙醇等；(3)強質(zhì)子給體溶劑：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等；(4)質(zhì)子受體溶劑：三乙胺、乙醚等；(5)偶極作用溶劑：二氯甲烷(6)惰性溶劑：環(huán)己烷、正己烷等。制備色譜技術(shù)7制備色譜技術(shù)上樣和展開1. 先用甲醇展開一次，除去可能存在的雜質(zhì)；2. 低揮發(fā)性溶劑溶解樣品會引起樣品帶變寬，因此選用揮發(fā)性溶劑（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等），且溶劑極性盡可能小。3. 樣品濃度以能均勻分布于吸附劑表面不析出為宜，5-10%；4. 帶狀點樣，盡可能窄；如點樣帶太寬，可用高極性溶

4、劑展開至點樣帶上方2cm處進行濃縮，然后將鋪板干燥后再用展開劑展開。？8制備色譜技術(shù)樣品檢測a. 有色物質(zhì)直接觀察斑點；b. 熒光物質(zhì)在紫外燈下觀察；c. 無色無熒光可在熒光板分離，紫外光下顯示暗斑；d. 噴顯色劑，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且不易氧化物質(zhì)可以用碘蒸氣顯色，可逆；9制備色譜技術(shù)常用顯色劑：a. 硫酸：硫酸:乙醇(1:1)溶液，噴后110烤5分鐘，不同有機物顯不同的顏色；b. 0.05%高錳酸鉀溶液，還原性物質(zhì)顯黃色，背景淡紅色；c. 酸性重鉻酸鉀：5%重鉻酸鉀濃硫酸溶液，必要時150烤薄層；d. 5%磷鉬酸乙醇溶液：噴后120烤，還原性物質(zhì)顯藍色，再用氨氣熏，背景無色。10制備色譜技術(shù)樣品收集：

5、a. 切割：刮刀或與真空相連的管型刮離器；b. 回收：極性盡可能低的溶劑洗脫，通常1g吸附劑用5mL溶劑，丙酮和氯仿常用，甲醇因溶解硅膠及其中含有的雜質(zhì)不常用。c. 4型玻璃沙芯漏斗過濾洗脫液，再用0.2-0.45m濾膜過濾。d. 硅膠的黏合劑以及熒光指示劑等雜質(zhì)，可用Sephadex LH-20過濾純化。11制備色譜技術(shù)常規(guī)制備TLC速度慢，效率低，如何提高？加壓離心12加壓制備OPLC 彈性氣墊，外壓使沒有氣相存在，展開劑強制流動，展開速度加快制備色譜技術(shù)更細的固定相顆粒、更長的薄層板13離心制備CTLC 離心力加速流動相，分離速度快，操作簡單，占用空間小，使用溶劑少，可反復使用，可進行梯

6、度洗脫，進樣量大，一次分離量0.1-0.2g.制備色譜技術(shù)14不同制備TLC方法的比較 制備色譜技術(shù)15常規(guī)柱色譜技術(shù)：n可使用較大直徑的色譜柱，更多的固定相，因此樣品量可以更大；n分離速度較慢，樣品可能被不可逆吸附；n不適合小顆粒的吸附劑？n改進方法：減壓、加壓等制備色譜技術(shù)16柱色譜常用固定相(1)硅膠：官能團和分子的幾何形狀，對異構(gòu)體的分離選擇性遠大于其他色譜方法。烷基鹵素（FClBrI）醚硝基混合物腈叔胺酯酮醛醇酚伯胺酰胺羧酸磺酸摻雜硅膠：如硝酸銀處理，對不飽和烴有好的分離效果。1%-10%的添加劑的水或丙酮溶液與硅膠混合，稍干后110干燥即可。制備色譜技術(shù)17(2) 健合硅膠SiOH

7、+ROHSiORSiOH+SOCl2SiClSiCl+RNH2SiNHRSiCl+RXMgSiRSiOH+R3SiXSiOSiRRR制備色譜技術(shù)18(3) 氧化鋁堿性氧化鋁：其水提取液為pH9-10，常用于碳氫化合物的分離，從碳氫化合物中除去含氧化合物。中性氧化鋁：5%乙酸處理，水提取液為pH7.5，適用于醛、酮、醌、某些苷以及酸堿溶液中不穩(wěn)定成分如酯、內(nèi)酯等化合物的分離。酸性氧化鋁：2MHCl溶液處理，水提取液pH為4-4.5，適合于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分離。制備色譜技術(shù)19(4) 活性炭：分離水溶性物質(zhì)n吸附作用在水溶液中最強，用有機溶劑洗脫。n對芳香族的吸附力大于脂肪族；n

8、對大分子吸附力大于小分子；n對極性基團多的分子吸附力大于少的；n易吸附氣體“中毒”，用前需活化，120加熱4-5小時；制備色譜技術(shù)20(5) 聚酰胺：又稱為錦綸或尼龍n同時具有良好的親水性和親脂性；n可溶于濃鹽酸、甲酸，不溶于常見溶劑；n含有豐富的酰胺基，與酚類、黃酮類、醌類、脂肪酸類物質(zhì)形成氫鍵；n還含有非極性脂肪鏈，雙重保留機理；制備色譜技術(shù)21(6) 大孔吸附樹脂：苯乙烯和丙烯酸酯n骨架結(jié)構(gòu)決定樹脂的極性： 非極性、弱極性-苯乙烯或二乙烯基苯聚合而成； 中等極性-甲基丙烯酸酯； 極性、強極性-含氧硫基、酰胺基、氮氧等基團；n吸附和分子篩分離相結(jié)合：網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大比表面積制備色譜技術(shù)22大孔

9、吸附樹脂使用：n用前需預處理除去雜質(zhì)： 回流法、水蒸氣蒸餾法； 滲漉法-乙醇丙酮等有機溶劑濕法裝柱，浸泡12h后洗脫2-3倍柱體積，再浸泡3-5h后洗脫2-3倍柱體積，重復直到流出的有機溶劑與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象為止，用大量蒸餾水洗去乙醇即可。如單獨采用有機溶劑洗不盡雜質(zhì)，則可用酸堿處理，2-5%鹽酸、2-5%NaOH溶液浸泡，洗脫，水洗。制備色譜技術(shù)23(7) 凝膠：n交聯(lián)葡聚糖Sephadex-葡聚糖和3氯-1，2環(huán)氧丙烷以醚健交聯(lián)形成的三維空間多孔凝膠 交聯(lián)度大，孔小，吸水膨脹小 型號以其吸水量的10倍命名，如Sephadex G-25表示每克干膠吸水2.5g； 引入羥丙基，為LH型

10、烷基化葡聚糖凝膠，不僅可分離水溶性成分，還可分離親脂性成分，常用于最后的純化，除去微量固體、鹽類和其他外來雜質(zhì)，純化過程中樣品損失極小。制備色譜技術(shù)24n甲基丙烯酸酯共聚物ToyopearlHW系列-乙二醇、甲基丙烯酸縮水甘油酯和二甲基丙烯酸季戊四醇酯共聚而成 穩(wěn)定性好，pH2-12； 機械強度高，常用于加壓柱色譜； 在蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖的純化處理中應用較多； ToyopearlHW40可用于小分子物質(zhì)的分離純化，與SephadexLH20有相似的效果。制備色譜技術(shù)25n瓊脂糖凝膠-D-半乳糖和3,6位脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈，100時呈液態(tài)，45 下互相連接成線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖

11、，再凝聚成瓊脂糖凝膠。 與1,3-二溴異丙醇在強堿條件下反應，生成CL型交聯(lián)瓊脂糖，穩(wěn)定性更好，pH3-14（一般的瓊脂糖pH4.5-9.0 ）； 機械強度和篩孔的穩(wěn)定性由于葡聚糖，流速較快。制備色譜技術(shù)26凝膠柱使用一般注意事項：(1)交聯(lián)度決定凝膠孔徑大小，孔徑?jīng)Q定排除下限；(2)顆粒粗細很重要，細顆粒分離效果好，但流速慢，宜采用大直徑柱，粗顆粒流速快，但分離效果差，宜采用小直徑柱；(3)干膠用量需考慮溶漲度制備色譜技術(shù)溶漲度干膠用量hr227(4)干膠使用前需在5-10倍的去離子水中充分溶漲，傾倒掉小顆粒，減壓排氣。也可用煮沸的方法溶漲，速度快，可滅菌排氣。(5)填充均勻，無空隙和氣泡；

12、(6)多次使用后，床體積減小或污染，可再生處理，即用水逆向反復沖洗，再用緩沖溶液平衡。制備色譜技術(shù)28(8) 離子交換樹脂-陽離子交換和陰離子交換 價態(tài)高，交換能力強； 價態(tài)相同，原子序數(shù)大能力強； 兩性物質(zhì)的交換取決于物化性質(zhì)和特定條件下的離子狀態(tài)；制備色譜技術(shù)29離子交換樹脂的一般原則- 選擇取決于被分離物質(zhì)的電荷性質(zhì)； 強的使用范圍寬，弱的分離生物大分子時，活性不容易失去； 反離子，為了提高交換容量，選擇結(jié)合力小的反離子； 親疏水性選擇，一般分離大分子時，選擇疏水性的基質(zhì)，活性易保持；制備色譜技術(shù)30常規(guī)柱色譜的操作(1)裝柱：干法和濕法；(2)上樣：液體上樣和拌樣上樣，樣品帶盡可能窄；

13、(3)洗脫：始終保持洗脫劑液面高于柱床表面，可梯度洗脫；(4)流分收集：常采用固定體積收集法，結(jié)合TLC檢驗；(5)樣品回收：減壓蒸餾或重結(jié)晶制備色譜技術(shù)31干柱柱色譜 干吸附劑，待分離樣品配成濃溶液或吸附于少量填料上上樣，洗脫液接近色譜柱底部時停止洗脫，挖出或切開色帶。制備色譜技術(shù)時間短節(jié)省試劑玻璃柱尼龍柱32減壓柱色譜 減壓促進溶劑流動。制備色譜技術(shù)33n與加壓相比，變換溶劑更加方便；n吸附劑高度一般不超過5cm；n分離過程中，逐漸增加洗脫劑中高極性溶劑 的 比 例 ， 開 始 階 段 增 加 幅 度 較 小( 1 % , 2 % , 3 % ) ， 隨 后 幅 度 逐 步 增 大(5%,

14、10%,20%等)，通常收集20-25個流分即可將所有成分洗脫。制備色譜技術(shù)34加壓液相柱色譜技術(shù)(1)快速色譜法：約0.2MPa；(2)低壓液相色譜法：2MPa；制備色譜技術(shù)35加壓液相色譜制備分離方法的建立：(1)采用薄層色譜確定分離條件。 對于快速和低壓色譜，常用薄層色譜選擇分離條件。 硅膠薄層色譜確定正相色譜條件，反相硅膠薄層色譜確定反相色譜條件，一般選擇Rf不大于0.3且具有較好分離效果的展開劑。制備色譜技術(shù)36(2)采用分析HPLC來確定分離條件。 對于中壓和高壓色譜則需要用分析HPLC條件進行選擇。 優(yōu)化條件時，尋求較小的容量因子(k99%；(2)純品幾乎完全回收，回收率95%；

15、(3)分離程序簡單，不需要為了得到純品進一步分析所得到的組分。制備色譜技術(shù)過載：低濃度時，進樣量增加使得容量因子改變超過1038濃度過載和體積過載 制備色譜技術(shù)K不變，線性結(jié)果可預測K變化，非線性結(jié)果難預測39邊緣切割與循環(huán)色譜分離 分離不佳時 制備色譜技術(shù)密閉進樣器是將流經(jīng)檢測器的柱流出液通過多通閥連至泵的入口；交替柱循環(huán)裝置是連接兩根色譜柱，通過閥門將第二根色譜柱切割得到的樣品再加到第一根色譜柱上循環(huán)分離。40中心切割制備色譜技術(shù) 適當損失組分，但避免色譜峰兩端微量組分的污染。41制備加壓色譜設(shè)備要求(1)泵：流量大，壓力不需要太大；(2)進樣器：大樣品環(huán)六通閥，環(huán)管細而長而不是短而粗，樣

16、品溶液低濃度，大體積；(3)色譜柱：裝填均勻常采用柱床壓縮技術(shù)即徑向壓縮和軸向壓縮；(4)檢測器：不需要高靈敏；制備色譜技術(shù)42快速色譜法 簡單易行制備色譜技術(shù)43低壓和中壓色譜法 第七章 制備色譜技術(shù)44制備HPLC 制備色譜技術(shù)45生產(chǎn)級的HPLC (1)溶劑花費是最大成本，昂貴、毒性、難處理溶劑不使用；(2)填料易得，性能好，重現(xiàn)性好；(3)溶劑回收再用；(4)直徑大于5cm的色譜柱需專門設(shè)計，保證床層穩(wěn)定，避免高壓破壞。制備色譜技術(shù)46模擬移動床色譜(SMB) 通常的色譜存在下列問題：(1)不能連續(xù)操作；(2)溶劑和分離材料利用率低；(3)流出組分被高度稀釋； SMB同樣的分離材料，生產(chǎn)力增加60倍，溶劑消