細胞生物學技術(二)

1、1第三節(jié)第三節(jié) 顯微技術顯微技術細胞生物學的建立和發(fā)展得益于光學顯細胞生物學的建立和發(fā)展得益于光學顯微鏡的發(fā)明；微鏡的發(fā)明；電子顯微鏡的發(fā)明使對細胞結構和功能電子顯微鏡的發(fā)明使對細胞結構和功能的研究達到了新的水平。的研究達到了新的水平。2光學顯微鏡與電子顯微鏡的主要差別光學顯微鏡與電子顯微鏡的主要差別在所使用的光源不同，但分辨率卻相在所使用的光源不同，但分辨率卻相差非常大：差非常大：光學顯微鏡的最大分辨率：光學顯微鏡的最大分辨率：0.2m0.2m電子顯微鏡的分辨率：電子顯微鏡的分辨率：0.2nm0.2nm3一、顯微鏡的成像原理一、顯微鏡的成像原理所有類型的顯微鏡，鏡像的形成都需要所有類型的顯微

2、鏡，鏡像的形成都需要3 3個基本要素：個基本要素： 1 1、照明系統(tǒng)；、照明系統(tǒng)； 2 2、被觀察的物品；、被觀察的物品； 3 3、聚焦成像的透鏡系統(tǒng)、聚焦成像的透鏡系統(tǒng)4 照明系統(tǒng)的照明系統(tǒng)的波長波長是顯微鏡成像的重是顯微鏡成像的重要因素，波長能決定被檢測物體的最小要因素，波長能決定被檢測物體的最小極限極限。51 1、分辨率、分辨率（ResolutionResolution）是指能分辨出相鄰兩個物點間的最小距是指能分辨出相鄰兩個物點間的最小距離的能力。離的能力。一般規(guī)定：顯微鏡或人眼在一般規(guī)定：顯微鏡或人眼在25cm25cm明視距明視距離處，能清楚分辨被檢物體細微結構最離處，能清楚分辨被檢物

3、體細微結構最小間隔的能力，稱分辨率。小間隔的能力，稱分辨率。6分辨率可用下面公式計算結果來衡量：分辨率可用下面公式計算結果來衡量：D=0.61 /N.A.D=0.61 /N.A. N.A.N.A.sinsin式中：式中： = =波長；波長；n=n=介質(zhì)折射率；介質(zhì)折射率；=鏡口鏡口角（標本對物鏡鏡口張角的角（標本對物鏡鏡口張角的1/21/2），），N.A.=N.A.=鏡鏡口率（口率（numeric aperturenumeric aperture）。鏡口角總是要）。鏡口角總是要小于小于9090，sin sin 的最大值小于的最大值小于1 1。78不同光源的波長不同光源的波長名稱可見光紫外光X

4、射線射線電子束0 . 1Kv10Kv波長(nm)4 5 0 -760133900.05130.00510.1230.012292 2、最大分辨率、最大分辨率D D值越小，分辨率越高，即需要值越小，分辨率越高，即需要盡可能盡可能地小，和地小，和N.A.N.A.盡可能大。盡可能大?？梢姽庵幸运{光波長最短可見光中以藍光波長最短， =450nm=450nm；目前最好的玻璃透鏡的目前最好的玻璃透鏡的=70 =70 ， sin sin =0.94;=0.94;空氣的折射率空氣的折射率nn1 1；所以所以光鏡的最大分辨率光鏡的最大分辨率： D=450/1D=450/1* *0.94=0.94=292nm29

5、2nm= =0.3m0.3m103 3、分辨極限與放大率、分辨極限與放大率顯微鏡的最大分辨率即是它的分辨極限。顯微鏡的最大分辨率即是它的分辨極限。最終成像的大小與原物體大小的比值稱最終成像的大小與原物體大小的比值稱為放大率（為放大率（magnificationmagnification）。）?？偡糯舐士偡糯舐? =物鏡的放大率物鏡的放大率* *目鏡放大率目鏡放大率放大率受分辨極限的限制。一般，光學放大率受分辨極限的限制。一般，光學顯微鏡的最大放大率只能是數(shù)值孔鏡顯微鏡的最大放大率只能是數(shù)值孔鏡（N.A.N.A.）的）的10001000倍。倍。11二、光學顯微鏡二、光學顯微鏡（一）、普通雙目顯微

6、鏡（一）、普通雙目顯微鏡* *照明系統(tǒng)：可見光源照明系統(tǒng)：可見光源* *光學放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，都光學放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，都是由玻璃透鏡組構成；在物鏡上方裝有是由玻璃透鏡組構成；在物鏡上方裝有4 4個棱鏡，使物鏡的光線平分為兩路到達目個棱鏡，使物鏡的光線平分為兩路到達目鏡鏡* *機械和支架系統(tǒng)：保證光學系統(tǒng)的準確機械和支架系統(tǒng)：保證光學系統(tǒng)的準確配制和靈活調(diào)控配制和靈活調(diào)控 121. The Light Microscopy1. The Light Microscopy（LMLM）13光鏡觀察樣本的制備光鏡觀察樣本的制備 石蠟切片石蠟切片.142 2、倒置顯微鏡、倒置顯微鏡 組

7、成和普通顯微鏡一樣，只不過組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，普通顯微鏡在物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，普通顯微鏡在載物臺之下，倒置顯微鏡在載物臺之載物臺之下，倒置顯微鏡在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。差物鏡。15163 3、暗視野顯微鏡、暗視野顯微鏡（dark field microscopedark field microscope） 聚光鏡中央有擋光片，使照明光線聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進入物鏡，只允許被標本反射和不直接進入物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物

8、體的邊緣是亮的。是黑的，物體的邊緣是亮的。 能觀察能觀察 4200nm4200nm的微粒子，分辨率的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高可比普通顯微鏡高5050倍。倍。17184 4、熒光顯微鏡、熒光顯微鏡 是對能發(fā)熒光的物質(zhì)進行定性和定是對能發(fā)熒光的物質(zhì)進行定性和定量研究的工具。量研究的工具。 細胞中有些物質(zhì)如葉綠素等，受紫細胞中有些物質(zhì)如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；外線照射后可發(fā)熒光； 有些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但用有些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但用熒光染料染色，紫外線照射也發(fā)熒光。熒光染料染色，紫外線照射也發(fā)熒光。 1920熒光顯微鏡和普通顯微鏡區(qū)別熒光顯微鏡和普通顯微鏡區(qū)別：1 1、照明方

9、式通常為落射式，即光源通過、照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；物鏡投射于樣品上；2 2、光源為紫外光，波長較短，分辨力高、光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；于普通顯微鏡；3 3、有兩個特殊的濾光片，光源前的用以、有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人目。除紫外線，用以保護人目。2122235 5、激光共聚焦掃描顯微境、激光共聚焦掃描顯微境（laser confocallaser confocal scanning scanning microscopemicroscope）* *用激光

10、作光源，逐點、逐行、逐面掃描成像，用激光作光源，逐點、逐行、逐面掃描成像，激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。* *調(diào)焦一次，掃描限制在樣品一個平面。調(diào)焦深調(diào)焦一次，掃描限制在樣品一個平面。調(diào)焦深度不一時，可獲樣品不同層次圖像，經(jīng)計算機模度不一時，可獲樣品不同層次圖像，經(jīng)計算機模擬，能顯示樣品的立體結構。擬，能顯示樣品的立體結構。* *激光波長短，光束細，分辨率是光鏡的激光波長短，光束細，分辨率是光鏡的3 3倍。倍。24252627Comparison of conventi

11、onal and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below th

12、e plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo. 286 6、相差顯微鏡、相差顯微鏡（phase-contrast phase-contrast microscopemicroscope） 由由ZernikeZernike于于19321932年發(fā)明，并因此年發(fā)明，并因此獲獲19531953年諾貝爾物理獎。年諾貝爾物理獎。 最大的特點是可以

13、觀察未經(jīng)染色的最大的特點是可以觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。標本和活細胞。29 基本原理：把透過標本的可見光的基本原理：把透過標本的可見光的光程差變成振幅差（明暗差），從而光程差變成振幅差（明暗差），從而提提高了各種結構間的對比度高了各種結構間的對比度，使結構變得，使結構變得清晰可見。清晰可見。 光線透過標本后發(fā)生折射，偏離了光線透過標本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了原來的光路，同時被延遲了1/41/4，如再，如再增加或減少增加或減少1/41/4，則光程差變?yōu)?，則光程差變?yōu)?/21/2，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減小，提高反差小，提高反差。30

14、構造上，相差顯微鏡不同于光鏡之處：構造上，相差顯微鏡不同于光鏡之處：1 1、環(huán)形光闌（、環(huán)形光闌（annular diaphragmannular diaphragm） 位于光源與聚光器之間，使透過聚光器位于光源與聚光器之間，使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標本上。的光線形成空心光錐，焦聚到標本上。2 2、相位板、相位板（annular phaseplateannular phaseplate）在在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲直射光或衍射光的相位推遲1/41/4。3132Figure 3-2. Figure 3-2. Int

15、erference between light waves. Interference between light waves. When When two light waves combine two light waves combine in phase,in phase, the amplitude of the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light w

16、aves that are increased. Two light waves that are out of phaseout of phase partially cancel each other and produce a wave partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is whose amplitude, and therefore brightness, is decreased. decreased. 33347 7、微分干涉顯微鏡、微

17、分干涉顯微鏡（differential-interference differential-interference microscopemicroscope） 1952 1952年，年，NomarskiNomarski在相差顯微鏡在相差顯微鏡原理的基礎上發(fā)明原理的基礎上發(fā)明。 優(yōu)點是能顯示結構的三維立體投影優(yōu)點是能顯示結構的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，標本可略厚，影像。與相差顯微鏡相比，標本可略厚，折射率差別更大，故影像立體感更強。折射率差別更大，故影像立體感更強。35圖圖2-10 DIC顯微鏡顯微鏡下的硅藻下的硅藻（偽彩色）（偽彩色）36DICDIC顯微鏡使細胞的結構，特別是一顯微

18、鏡使細胞的結構，特別是一些較大的細胞器，如核、線粒體等，些較大的細胞器，如核、線粒體等，立體感特別強，適合于顯微操作。目立體感特別強，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉基因等的前像基因注入、核移植、轉基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。顯微操作常在這種顯微鏡下進行。37四種類型顯微鏡對成纖維細胞觀察效果的比較：四種類型顯微鏡對成纖維細胞觀察效果的比較： (A) 明視野顯微鏡； (B) 相差顯微鏡； (C) 微分干涉顯微鏡； (D) 暗視野顯微鏡38二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡 光學顯微鏡受照射光波長的限制，在光學顯微鏡受照射光波長的限制，在可見光下其分辨極限只有可見光下其分辨極限只有

19、0.2m0.2m，即使在，即使在紫外光下，最大分辨率也只有紫外光下，最大分辨率也只有0.1 m0.1 m，要觀察更精細的結構，只有借助分辨率更要觀察更精細的結構，只有借助分辨率更高的電子顯微鏡。高的電子顯微鏡。39（一）透射電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡(transmission electron (transmission electron microscopemicroscope，TEM)TEM)Ruska 1932Ruska 1932年發(fā)明。年發(fā)明。以以電子束電子束為光源，波長比可見光和紫外為光源，波長比可見光和紫外光短得多，且電子束的波長與發(fā)射電子束光短得多，且電子束的波長與發(fā)射電子束

20、的電壓平方根成反比。的電壓平方根成反比。最大分辨率最大分辨率達達0.2nm0.2nm。40411 1、透射電鏡的結構、透射電鏡的結構由由5 5部分組成：部分組成：1 1、電子照明系統(tǒng)、電子照明系統(tǒng)：電子槍；：電子槍；2 2、真空系統(tǒng)、真空系統(tǒng)：用真空泵和油擴散泵獲得：用真空泵和油擴散泵獲得高真空；高真空；3 3、電磁透鏡成像系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)：規(guī)范電子的行為；：規(guī)范電子的行為；4 4、記錄系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)：用熒光屏觀察影像，用照：用熒光屏觀察影像，用照相系統(tǒng)記錄影象；相系統(tǒng)記錄影象；5 5、電源系統(tǒng)、電源系統(tǒng)：提供高壓穩(wěn)壓。：提供高壓穩(wěn)壓。42432 2、電鏡制樣技術、電鏡制樣技術44（1）

21、超微切片技術）超微切片技術石蠟切片: 3-10um; 超薄切片: 40-50nmSections of LM: 5um;Sections of TEM: 100nm 45 由于電子束的穿透力很弱，因此用于由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標本須制成厚度約電鏡的標本須制成厚度約50nm50nm左右的超薄左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機切片。這種切片需要用超薄切片機（ultramicrotomeultramicrotome）制作。）制作。4647Thin sectionscopper grid used to support the thin sections of copper gr

22、id used to support the thin sections of a specimen in the transmission electron a specimen in the transmission electron microscope. microscope. 48 Specimen Preparation for Electron Microscopy Two common chemical fixatives used for electron microscopy. The two reactive aldehyde groups of glutaraldehy

23、de enable it to cross-link various types of molecules, forming covalent bonds between them. Osmium tetroxide is reduced by many organic compounds with which it forms cross-linked complexes. It is especially useful for fixing cell membranes, since it reacts with the C=C double bonds present in many f

24、atty acids. 49Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen. 50通過連續(xù)切片達通過連續(xù)切片達到被檢樣品的三到被檢樣品的三維結構的重構維結構的重構 51（2 2）負染色技術）負染色技術 負染是用重金屬鹽（磷鎢酸、醋酸雙負染

25、是用重金屬鹽（磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色；氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色； 吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染料沉積，呈負染效果，分辨力可達料沉積，呈負染效果，分辨力可達1.5nm1.5nm。52經(jīng)負染的肌動蛋白纖維經(jīng)負染的肌動蛋白纖維53(3)(3)冰凍冰凍蝕刻蝕刻(freeze-etching)(freeze-etching) 樣本置樣本置-196-196C C液氮中冰凍。然后用冷刀液氮中冰凍。然后用冷刀驟然將標本斷開，冰在真空下迅速升華，驟然將標本斷開，冰在真空

26、下迅速升華，暴露出斷面結構，稱蝕刻暴露出斷面結構，稱蝕刻。蝕刻后，向斷面噴涂一層鉑和碳，加強蝕刻后，向斷面噴涂一層鉑和碳，加強反差和強度。再用次氯酸鈉溶液消化樣反差和強度。再用次氯酸鈉溶液消化樣品，剝下碳和鉑的膜，即復膜。復膜代品，剝下碳和鉑的膜，即復膜。復膜代表標本蝕刻面的形態(tài)，電鏡下的影像即表標本蝕刻面的形態(tài)，電鏡下的影像即代表標本斷面的結構。代表標本斷面的結構。54555657（二）掃描電鏡（二）掃描電鏡（Scanning electron microscope Scanning electron microscope (SEM)(SEM) * *問世于問世于2020世紀世紀6060年代

27、；年代；* *用來觀察標本的表面結構。用來觀察標本的表面結構。* *掃描電鏡的分辨力為掃描電鏡的分辨力為610nm610nm，最大有，最大有效放大倍率為效放大倍率為20000X20000X。 5859工作原理工作原理* *用細的電子束掃描樣品，在樣品表面激用細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品的發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品的表面結構有關。表面結構有關。* *次級電子由探測器收集，轉為光信號，次級電子由探測器收集，轉為光信號，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉為電信號來控再經(jīng)光電倍增管和放大器轉為電信號來控制熒光屏上電子束的強度，顯示掃描圖像。制熒光屏上電子束的強度，顯示掃描圖像。圖像為立體，顯示標本表面結構。圖像為立體，顯示標本表面結構。 6061 為了使標本表面發(fā)射出次級電子，為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。出次級電子信號。 6263培養(yǎng)中的小鼠成纖維細胞掃描照片培養(yǎng)中的小鼠成纖維細胞掃描照片6465三、