細胞生物學研究技術

1、細胞生物學研究技術課程論文題 目: 逆境脅迫下植物細胞的生理變化的測定 姓 名: 尹新強 學 院: 生命科學學院 專 業(yè): 植物學 班 級: 一班 學 號: 2014116001 導 師: 蔡慶生 2014 年 12 月 8 日逆境脅迫下植物細胞的生理變化的測定摘要：植物在生長發(fā)育過程中往往會受到不良因素的影響，包括各種生物脅迫以及非生物脅迫，植物自身為了生存必須抵抗這些不良條件，或是適應這種條件。由于植物種屬的差異性，不同植物的抗性不同，為此研究植物的逆境脅迫，對于種質(zhì)資源的選擇，不良環(huán)境的生態(tài)修復都具有重要意義，為此本文主要根據(jù)自己所在實驗室的研究內(nèi)容簡單介紹在各種非生物脅迫下，植物的滲透

2、勢、細胞膜損傷、活性氧的生理變化。關鍵字：逆境 脅迫 滲透勢 膜損傷 活性氧 一、逆境脅迫下植物細胞的生理變化 一般植物要完成從種子然的萌發(fā)、生長、運動、開花、結果等生長發(fā)育過程，需要充足的水分、礦質(zhì)營養(yǎng)，適宜的光照、溫度和足夠的氧氣等環(huán)境條件。然而在自然條件下，各地所處的地理位置、氣候條件、病蟲害及由于工農(nóng)業(yè)發(fā)展所帶來的環(huán)境污染等情況的差異，即使同一地區(qū)，一年也有冷熱旱澇之分。植物常常生活在多變的環(huán)境中，同動物相比，植物的空間位移比較差。植物在生活的環(huán)境中常常遭受到不良環(huán)境的襲擊。因此植物在生長過程中幾乎不可避免要受到不良環(huán)境的影響，譬如干旱、高鹽、高溫、低溫、冷凍、病蟲害、重金屬、輻射、大

3、氣污染有時這種影響是嚴重的甚至是致命的。因植物種類不同，植物會有不同的表現(xiàn)，有的能夠生存，有的則受害致死。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)在我國具有十分重要的地位，為此研究植物在逆境脅迫下的生命活動規(guī)律，特別是逆境脅迫下抵御不良環(huán)境的生理分子機制，就顯得十分重要。逆境脅迫脅迫下植物生理代謝會發(fā)生變化，眾多研究表明植物在干旱、高鹽、低溫等脅迫下，都會產(chǎn)生水分虧缺現(xiàn)象。植物吸水減少，蒸騰不足，但是蒸騰大于吸水，組織含水量減少，造成植物萎焉。植物細胞質(zhì)膜、液泡膜等膜結構發(fā)生變化，滲透性加大，胞內(nèi)物質(zhì)明顯外滲，電解質(zhì)滲漏率加大，所以通常用滲漏率衡量植物抗逆性的強弱。逆境下植物的光合作用減弱，可能由于逆境條件下葉綠體結構遭到破

4、、光合酶失活、氣孔關閉增大氣體擴散阻力引起的。植物呼吸速率發(fā)生改變，逆境下植物體內(nèi)磷酸化酶、蛋白酶活性升高，淀粉水解，蛋白質(zhì)水解加強，可溶性糖含量升高，逆境蛋白表達升高，脫落酸含量增加1。研究植物逆境脅迫下生理變化往往可從滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，膜損傷，活性氧三個方面進行分析。首先滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，逆境脅迫下植物通過積累各種有機或無機物質(zhì)提高細胞液的濃度，降低滲透勢，提高細胞吸水或保水能力。值得注意的是無機離子調(diào)節(jié)經(jīng)濟但積累過多會產(chǎn)生毒性，有機物質(zhì)調(diào)節(jié)雖然無直接毒害，但消耗大量光合產(chǎn)物。通過測定相同植物或不同植物在脅迫組和對照組細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，無機離子有k、Na、Cl等，有機物質(zhì)脯氨酸、甜菜堿、可

5、溶性糖（葡萄糖、蔗糖）2。然后膜損傷方面，正常情況下植物細胞膜有選擇通過功能，細胞的物質(zhì)交換、信號傳導都由膜結構完成。脅迫下膜結構首先會遭受損傷，如果膜結構破壞會導致選擇透過性功能喪失，電解質(zhì)外滲，因此可以通過測量細胞浸提液的電導率（無機離子），紫外吸收值（有機物質(zhì)）。最后可從活性氧角度測定脅迫傷害程度，正常植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡，植物體內(nèi)清除活性活性氧的系統(tǒng)有兩種，一種酶系統(tǒng)，一種非酶系統(tǒng)，前者主要通過抗氧化物質(zhì)起作用，譬如，GSH、維生素C、類胡蘿卜素。后者通過SOD、CAT、POD、APX等發(fā)揮酶促清除作用。植物受到環(huán)境脅迫，一旦這種平衡被打破，活性氧積累加劇，清除不足，

6、造成膜質(zhì)過氧化，產(chǎn)生丙二醛（MDA），丙二醛釋放后結合蛋白質(zhì)和核酸，改變分子構型，使分子交聯(lián)，功能喪失，作用的結果導致膜系統(tǒng)會破壞，造成生理紊亂。因此通過測定各種抗氧化物質(zhì)和各種酶活性及丙二醛的含量可以反映植物脅迫下的生理變化，作為植物抗逆性的指標1。二、脅迫下植物細胞常見的生理指標的測定以下實驗過程僅作參考，用于輔助說明，不具代表性，具體實驗以個人實驗設計為準。以高溫、低溫脅迫為例簡單說明細胞膜損傷后離子濃度的測定方法3-6，首先培育幼苗，選取生長一致、苗齡適當?shù)挠酌?，分成葉片、根、莖和芽4部分，選取上部剛展開的葉、全部根系、中部莖和頂端兩片嫩芽。然后將葉片剪成12小片，莖剪成0.5小段，用

7、去離子水洗凈，紗布擦干，每部位稱取約0.1，裝入密封袋內(nèi)，分別進行溫度梯度處理，譬如，低溫溫度梯度可設為為4、0、-2、-4、-6、-8和-10 ，（可根據(jù)自己實驗材料合理設置）在低溫冷凍槽內(nèi)進行，采用連續(xù)降溫的方法，每個溫度梯度處理1，取出室溫靜置解凍2后，測定電導值(0)。高溫處理的溫度梯度可設為：25、30、35、40、45、50、55和60 ，處理時間為15，測定電導值。最后以室溫下植物葉片的電導值為對照()，以相對電導率表示細胞傷害率，計算公式：相對電導率(%)=(-)/(0-)×100%。以紫外輻射脅迫為例簡單說明細胞膜損傷后各物質(zhì)的生理指標7。采用漂浮育苗方式育烤煙苗，

8、取苗齡35d的煙苗移栽至裝有基質(zhì)的塑料盆內(nèi)，待還苗后將煙株轉移到裝有紫外線燈管(波峰值在295nm)的架子上進行試驗處理，燈管離煙苗頂部30一50cm。試驗設3個UVB輻射梯度，外源增加UV一B的強度分別為18.71士2.13 µW·-2(UV一B1)、24.00士4.06 µW·-2(UV一B2)，無外源UV一B處理時紫外線強度為5.55士0.84 µW·-2（CK），外源增加UV一B處理的時間為每天6h(10:00一16:00)，處理7d為1個試驗周期，重復3次。UV一B輻射量用紫外線輻射計測定，處理期間定量澆灌Hoagland營

9、養(yǎng)液維持煙苗正常生長。以UV一B輻射處理7d后幼苗的新鮮葉片(取完全展開葉片)測定各項生理指標：生物量和含水量、根冠比、葉綠素和總類胡蘿卜素含量、丙二醛含量（MDA）、脯氨酸含量，紫外線吸收物質(zhì)類黃酮的含量，可溶性總糖含量。植株高度、地上部生物量和含水量測定： 隨機取各處理幼苗30 株，剪掉根部，立即稱地上部鮮重，并測量其高度。之后將地上部于4050的烘箱內(nèi)烘至恒重， 以干重表示生物量并計算含水量。將地上、地下部分分離，于105殺青15min，65恒溫烘干至恒重，并用萬分之一電子天平稱重，計算根冠比8。葉綠素和總類胡蘿卜素含量測定：根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定

10、波長測定其吸光度即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比。A=CL , 比例常數(shù)，各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應波長下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A 并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。例如取新鮮葉片或其它組織或干材料，擦凈組織表面污物剪碎去掉中脈混勻。將取好的

11、樣品放入25ml容量瓶中加混合浸提液無水乙醇：丙酮=5:5 20ml放在黑暗條件下，浸泡至葉片發(fā)白，用浸提試劑定容至25ml搖勻備用。把葉綠體色素提取液倒入1cm光徑的比色皿內(nèi)，以浸提試劑為空白測定吸光度。選擇波長663 646 和470nm，測定OD值，計算對應色素含量8。光合強度、蒸騰速率和氣孔導度測定：用便攜式TPS-1 型光合測定儀隨機測定各處理幼苗第一片真葉的光合強度、蒸騰速率和氣孔導度( 各指標測定均為煙葉第一片真葉) 。每次測定5 株幼苗, 測定于每日13: 0014: 00時進行, 測定光強為1 000 1 100 Lmol·m- 2·s- 1。MDA含量測

12、定：采用硫代巴比妥酸法測定，在酸性和高溫條件下，MAD可以與硫代巴比妥酸(TBA)反應生成紅棕色的三甲川(3，5，5三甲基惡唑-2，4二酮)，其最大吸收波長在532nm。首先稱組織鮮樣0.5g，加入4ml pH7.8磷酸緩沖液冰浴研磨至勻槳，再用4ml緩沖液沖洗，用四層紗布過濾至小燒杯中，并轉移到離心管，4下10000xg，取上清液即為酶液。然后取1.5ml酶液，加入2.5ml TBA一CTA液，在沸水浴上加熱10min，迅速冷卻，以1800xg離心10min，取上清液于532nm和600nm下比色，測定OD值8。脯氨酸含量測定：原理為用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液

13、中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標準曲線上查出脯氨酸的含量。例如準確稱取不同處理的待測葉片各0.5g，分別置大管中，然后向各管分別加入5ml 3的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取過程中要經(jīng)常搖動），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，靜置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000rpm下離心5min

14、。用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對照，在分光光度計上520nm波長處比色，求得OD值8。黃酮含量測定：采用亞硝酸鈉，硝酸鋁氫氧化鈉比色法。該方法是目前應用最廣泛的總黃酮含量測定方法，該法的原理是在待測物的水溶液中加入亞硝酸鈉、硝酸鋁氫氧化鈉試液、鋁離子與黃酮類化合物3，4二羥基發(fā)生絡合反應顯色來進行測定。例如蘆丁化合物B環(huán)上有鄰二酚羥基與鋁離子絡合在500nm處有最大吸收，如果供試品顯色后在同一地方有最大吸收即可以蘆丁做對照品，用比色法進行測定。稱取0.60.8g樣品粉末，加入60ml 60%乙醇于100ml圓底燒瓶內(nèi)，置于水浴鍋上，70條件下回流提取60min。

15、過濾、定容于100ml，吸取樣品量（根據(jù)樣品的吸光度調(diào)整）1.0ml，放入10毫升容量瓶內(nèi)（寫明標記），用60%乙醇加到2.0ml；加入5%亞硝酸鈉溶液0.5ml搖勻，放置6min；加入10%硝酸鋁，溶液0.5ml，放置6min后；加入4%氫氧化鈉溶液4.0ml，搖勻后，加60%乙醇定容，放置15min；在510nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算總黃酮的含量?？傸S酮含量=A/M·100×稀釋倍數(shù) A為標準曲線中的含量6。可溶性總糖的測定：采用蒽酮比色法測定可溶性糖的含量。糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再與蒽酮作用形成綠色絡合物，顏色的深淺與糖含量有關。在625 nm

16、波長下的OD值與糖含量成正比。由于蒽酮試劑與糖反應的呈色強度隨時間變化，故必須在反應后立即在同一時間內(nèi)比色。將植物葉片在110烘箱烘15 min，然后調(diào)至70過夜。干葉片磨碎后稱取50 mg樣品倒入10 ml刻度離心管內(nèi)加入4 ml 80%乙醇，置于80水浴中不斷攪拌40 min，離心，收集上清液，其殘渣加2 ml 80%乙醇重復提2次，合并上清液。在上清液中加10 mg活性炭，80脫色30 min，80%乙醇定容至10 ml，過濾后取濾液測定。 吸取上述糖提取液1ml，放入一干潔的試管中，加蒽酮試劑5mL混合之，于沸水浴中煮沸10分鐘，取出冷卻，然后于分光光度計上進行測定，波長為625nm，

17、測得吸光度。從標準曲線上查得濾液中得糖含量，然后再計算樣品中含糖百分數(shù)。（需要繪制標準曲線）以重金屬鎘脅迫為例從活性氧角度測定脅迫傷害程度9-10。精選番茄種子500粒，用紗布將種子包起來，清水浸種34h，放入0.5%高錳酸鉀浸種2040min，取出后用清水沖洗干凈。保濕于28光照培養(yǎng)箱內(nèi)催芽24h，25發(fā)芽3一5d，發(fā)芽后22砂床育苗。播種后14d選長勢一致幼苗移至溫室內(nèi)不含鎘的營養(yǎng)液預培養(yǎng)14d。然后進行鎘處理：設0(CK)，0.1，1.0，5.0，10.0 µmo1L-1處理，鎘以CdCl2形式供給。鎘處理后，第7d、14d、21d、33d取樣提取酶液，以測定根、葉片中SOD、

18、POD、CAT酶活性。酶液提取參照MDA中酶液提取方法。SOD活性測定：由于超氧自由基為不穩(wěn)定自由基，壽命極短，測定SOD活性一般為間接方法。并利用各種呈色反應來測定SOD的活力。核黃素在有氧條件下能產(chǎn)生超氧自由基負離子O2·-，當加入NBT(氧化硝基四氮哇蘭)后，在光照條件下，與超氧自由基反應生成一種藍色物質(zhì)，在560nm波長下有最大吸收。當加入SOD時，可以使超氧自由基與H+結合生成H2O2和O2，從而抑制了NBT光還原的進行，使藍色物質(zhì)生成速度減慢。例如吸取3ml NBT反應液于小燒杯中，加入50µl酶液，于40001ux光照15min，以50µl NBT代

19、替50µl酶液為CK，OD560下比色。通過在反應液中加入SOD酶液，抑制NBT光還原相對百分率與酶活性在一定范圍內(nèi)呈正比，依據(jù)繪制的二者相關曲線，根據(jù)SOD抑制NBT光還原相對百分率計算酶活性7。POD活性測定：在H2O2存在條件下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚?？捎梅止夤舛扔嫓y生成物的含量來測定活性。吸取酶液50ul于10ml試管中，加入3ml蒸餾水，lml 0.3%愈創(chuàng)木酚，lml 2%H2O2(計時)，5 min(25恒溫下)后比色OD470，以水調(diào)零，以不加酶液測為CK，計算活性。CAT活性測定：紫外吸收法  H 2 O 2

20、在 240nm 波長下有強吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度 A 240 隨反應時間而降低。根據(jù)測量吸光度的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。首先取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3ml 30%的H2O2（原液）搖勻制成反應液。取3ml反應液加入0.1ml（可視情況調(diào)整）酶液，以PBS為對照調(diào)零，測定OD240（測定40s），計算酶活性。近年來，隨著人類活動頻繁，工業(yè)“三廢”排放量日益增加，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化肥、農(nóng)藥等大量施用，全球土壤污染愈來愈嚴重，已成為危害人類的重大因素，近年來很多學者都從事污染地生態(tài)修復，重金屬污染土壤的植物修復技術及污染地能源植物資源開發(fā)技術日益興起，我們實驗室主要研究逆境脅迫下不同植物生理耐受，研究了高鹽、低溫、干旱、紫外輻射下的耐受植物，同時利用植物針對重金屬土地污染進行修復，符合當前發(fā)展潮流，環(huán)保、潔凈、應用前