體內(nèi)小鼠實驗方案

1、實驗報告抗腫瘤藥物體內(nèi)活性研究一、實驗原理聚合物膠束 的粒徑約為0-200 nm，可以利用腫瘤組織的增強滲透保留效應(EPR)，選擇性地透過腫瘤血管并積累在腫瘤組織，實現(xiàn)被動靶向；被特定官能團修飾的聚合物膠束則能響應部位的物理化學變化，實現(xiàn)靶向部位的載體聚集和藥物定點釋放?？鼓[瘤藥物的反復使用容易導致腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥性 (MDR) ，腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性后， 對結(jié)構(gòu)與作用機制不同的其它抗腫瘤藥產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象極大的限制了化療藥物的療效。 納米藥物傳遞系統(tǒng)如脂質(zhì)體、膠束、納米粒等作為MDR 逆轉(zhuǎn)策略越來越引起關注。膠束能通過EPR 效應使藥物選擇性地在腫瘤部位累積和釋放，增加

2、細胞內(nèi)藥物濃度，緩控釋藥物，并通過靶向細胞上特異受體對應的配體修飾， 達到主動靶向， 從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥。鹽酸阿霉素 (DOX ·HCl) ，屬于蒽環(huán)類抗生素，能夠抑制癌細胞遺傳物質(zhì)核酸的合成，具有廣譜的惡性腫瘤的治療效果，廣泛用于宮頸癌細胞、卵巢癌、乳腺癌、惡性淋巴瘤、肺癌、肝癌等的治療。然而，阿霉素的急性和慢性毒副作用限制了其在臨床上的廣泛應用，急性毒副作用包括惡心、 嘔吐、骨髓抑制和心率失常 ;慢性毒性表現(xiàn)為肝臟、大腦和腎臟的損傷，對心臟具有不可逆的劑量依賴性的損傷。用聚合物構(gòu)建新型藥物膠束傳遞系統(tǒng)， 提高對疏水性藥物的包載能力和藥物穩(wěn)定性 ;通過小分子修飾實現(xiàn)被動和主動靶向

3、。此外 ,通過相關實驗考察作為藥物載體的聚合物膠束的耐藥能力，以此來證明聚合物膠束的生物安全性好、穩(wěn)定性高、載藥量高、響應性強、靶向性準、緩控釋性能好。二、實驗目的1.運用抗腫瘤藥物在小鼠體內(nèi)評價方法，篩選出具有高表達、特異性、高親和力的主動 /被動靶向、無細胞毒性、抗腫瘤效果好的聚合物膠束。2.動物體內(nèi)抑瘤實驗基于活體成像技術(shù)，建立藥物抗腫瘤效果活體動物影響研究方法。三、實驗內(nèi)容1 / 51.動物模型將狀態(tài)良好的細胞消化， 用培養(yǎng)液稀釋至 1× 106 cells/mL 細胞密度，吹勻后于每只小鼠加入細胞懸液 100 L ，培養(yǎng)。受試溶液每孔加入 100 L ，每個濃度3-5 個平

4、行孔，每組10-15 只裸鼠；對照組，即不加待測藥液，單一補加100 L生理鹽水，培養(yǎng)。2.體內(nèi)抑瘤實驗給藥后觀察裸鼠體內(nèi)腫瘤體積變化情況。3.裸鼠在給藥 2 和 12 天后處死，取血液、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腫瘤組織，置于近紅外成像系統(tǒng)觀察。四、實驗方案1.動物模型的建立通過 MTT實驗選取生物活性好、穩(wěn)定性高、載藥量高的聚合物納米顆粒（ NPs），為了考察不同給藥劑量的 DOX-NPs ( 阿霉素負載聚合物納米顆粒 )和 DOX ·HCl 溶液的抗腫瘤效果， 選取 HeLa 細胞常規(guī)培養(yǎng)， 待細胞擴增至一定數(shù)量，且生長狀態(tài)良好， 取對數(shù)生長期的細胞用 0.25%胰酶消化 2

5、 min，l000rpm 離心 5min，棄去上清液，用新鮮無血清的 DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，配制成 1×106 個細胞 /mL 的細胞懸液。然后用注射器吸取細胞懸液，排空氣泡，注射于體重在20-22g 左右的 BALB/C 雌性裸鼠左腋皮下組織中， 每只接種 100 L，約含 1×105 個細胞，大約共接種 120 只。觀察裸鼠腫瘤生長情況，并定期稱裸鼠體重，測量腫瘤大小。（實驗期間動物正常飲食喝水。 ）2.給藥及抑制腫瘤效果評價當腫瘤體積長到 100150 mm3 時，將裸鼠隨機分成 4 組，每組 10 只裸鼠 (n=4)，分別為陰性對照組（生理鹽水組） ， DO

6、X · HCl ，NPs 和 DOX-NPs 。陰性對照組通過尾靜脈注射 100L 對照生理鹽水。 DOX ·HCl ，NPs 和 DOX-NPs 組分別通過小鼠尾靜脈注射 100L 的用無菌生理鹽水配制的 DOX ·HCl 。并記為第一天。（給藥劑量分別為： 5 mg/kg、 10 mg/kg、15 mg/kg）。隔天給藥一次，給藥后小鼠正常飼養(yǎng)， 每天觀察小鼠的生存狀況， 每兩天記錄一次小鼠體重， 并用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長短徑， 根據(jù)公式計算腫瘤體積 （ V）和相對腫瘤體積（Relative2 / 5tumor volume，RTV），繪制時間 -小鼠相對

7、體重和時間 -小鼠相對腫瘤體積變化曲線。給藥后第 12 天處死小鼠，摘取皮下腫瘤并稱重。腫瘤體積： V=a×b2（a為腫瘤的最長徑，b 為腫瘤的最短徑）公式 1/2相對腫瘤體積： RTV = V a 0（V a 為每日腫瘤體積， V 0 為起始腫瘤體積公式 2/V按照以下公式：計算各給藥組的抑瘤率:Tumor inhibiton ratio % = (1V /V) 100%公式 3test control其中， Vtest 為第 12 天時給藥組的相對腫瘤體積，V control 為第 12 天時生理鹽水組的相對腫瘤體積。3.藥物體內(nèi)臟器分布實驗由于 DOX ·HCl 自身

8、具有紅色熒光，故可通過近紅外成像儀觀察藥物在裸鼠體內(nèi)各臟器的分布情況。在尾靜脈注射 5mg/kg 生理鹽水、游離 DOX ·HCl 、 NPs 和 DOX-NPs 組生理鹽水溶液后 ,于第 2、12 天處死裸鼠 ,取血液、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟以及腫瘤置于在體近紅外成像系統(tǒng)觀察,分析給藥后阿霉素在各4.組織切片分析通過腫瘤以及心臟組織切片可以判斷不同制劑對腫瘤的抑制作用以及阿霉素對心臟的損傷情況。在尾靜脈注射生理鹽水、5mg/kg 游離 DOX · HCl 、NPs和 DOX-NPs 組生理鹽水溶液后 ,在預設時間處死給藥后的裸鼠， 剖取心臟以及腫瘤組織，通過 10%多

9、聚甲醛對組織進行固定 (12 小時以上 )。依次經(jīng)過 50%酒精、70%酒精、 80%酒精、 90%酒精、 95%酒精、 100%酒精 (兩次 )進行脫水處理 (每級35-45 分鐘 )。100%酒精與二甲苯 (1:1)透明處理 30-40 分鐘 ,再移入二甲苯中15-20分鐘。將透明后的組織塊置于剛過溶點的融化石蠟中浸漬， 取代組織中含有的透明劑，將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中， 石蠟凝固后， 組織即被包埋在其中。修整蠟塊，并進行切片。經(jīng)過蘇木精 -伊紅染色（ HE 染色）或者醋酸鈾和硝酸銀染色后固定于銅網(wǎng)，通過近紅外成像儀或熒光顯微鏡或TEM 觀察心臟受損程度以及腫瘤5.統(tǒng)計學處理所有

10、實驗數(shù)據(jù)采用SPSS10.0 統(tǒng)計軟件分析處理。數(shù)據(jù)XS 表示 , 組內(nèi)和組間比較采用方差分析。以P 0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。3 / 5五、實驗預期結(jié)果1.通過體內(nèi)小鼠實驗， 可以篩選出一種具有生物安全性好、 穩(wěn)定性高、載藥量高、響應性強、靶向性準、緩控釋性好的聚合物膠束。2.同等劑量下，載藥膠束組裸鼠存活率大大提高，膠束包載藥物后減小了藥物的毒副作用，增加了動物的存活率。3.通過觀察給藥后裸鼠體內(nèi)腫瘤體積變化情況，說明了聚合物膠束組取得了顯著的抑瘤效果。4.腫瘤組織切片進一步證實了DOX-NPs 對腫瘤的殺傷能力明顯優(yōu)于游離藥物,說明了 DOX-NPs 增強了普通聚合物膠束的抑瘤效果。

11、六、注意事項1.聚合物納米顆粒的選取，應考慮其生物安全性、穩(wěn)定性、載藥量、響應性、靶向性、緩控釋性能。2.在做腫瘤細胞的時候， 往往要根據(jù)細胞生長速度以及藥物的特性(有時間依賴性和濃度依賴性的藥物 )來確定培養(yǎng)時間是48 小時還是 72 小時。3.要設置生理鹽水組 (陽性對照組 )和實驗組。4.小鼠要隨機分組且每組數(shù)量不少于10 只，并觀察其生存狀況。5.樣品采集時，必須迅速，大小要均勻，不能太大。采集完后立即放入固定液中固定。6.新買的蠟，首次融化凝固后，也容易產(chǎn)生白點沉淀，不能用來包埋組織。因此也要反復熔化 -凝固，過濾，直到凝固的蠟，表面光亮，沒有白點才能用。在浸蠟過程中，在按照步驟所定的溫度， 除了調(diào)節(jié)溫度和換蠟外， 還有實時觀察恒溫箱中瓶中的臘，不能讓其凝固。假如凝固，升溫將其熔化。實驗藥品 ：HeLa 細胞、BLAB/c 雌性裸鼠、胰