海綿放線菌的分離與抑菌活性篩選研究

1、    海綿放線菌的分離與抑菌活性篩選研究    杜英俠+任浩杰+張菊林+付晚濤摘要 本文用5種分離培養(yǎng)基從大連海域潮間帶采集的2種海綿中分離培養(yǎng)放線菌，以副溶血弧菌、哈維弧菌和鰻弧菌3種海水養(yǎng)殖病原菌為指示菌對放線菌進(jìn)行抑菌活性的篩選，并基于16s rdna序列對篩選出的抑菌活性較強(qiáng)的海綿放線菌進(jìn)行多樣性分析。結(jié)果表明：從海綿中共分離出57株海綿放線菌，以寡營養(yǎng)的m2培養(yǎng)基分離效果最好。抑菌活性篩選有55株對3株指示菌中的至少1株具有抑菌活性；有11株抑菌活性較強(qiáng)，對3株指示菌均具有抑菌活性，初步鑒定均屬于鏈霉菌屬。由此表明，海綿放線菌多能夠產(chǎn)生對海水

2、養(yǎng)殖病原菌較強(qiáng)的抑菌活性，是天然活性物質(zhì)的重要來源，在海水養(yǎng)殖應(yīng)用方面具有較大的開發(fā)價值。關(guān)鍵詞 海綿放線菌；抑制弧菌；抑菌活性；多樣性分析q939.13 a 1007-5739（2017）07-0229-03isolation of sponge-associated actinobacteria and its antibacterial activity screeningdu ying-xia 1 ren hao-jie 1 zhang ju-lin 2 fu wan-tao 2，3 *（1 college of fisheries and life science，dalian oc

3、ean university，dalian liaoning 116023； 2 college of marine science-technology and environment，dalian ocean university； 3 key laboratory of nearshore marine environmental science and technology of liaoning provinces university）abstract this text isolated actinomycetes from 2 kinds of sponge taken fro

4、m dalian ocean intertidal zone with 5 kinds of separation medium.the antibacterial activity of sponge-associated actinobacteria was screened with vibrio parahaemolyticus，vibrio harveyi and vibrio anguillarum as indicator bacteria.the diversity analysis of sponge-associated actinobacteria with strong

5、 antibacterial activity was conducted based on 16s rdna sequence.the study showed that 57 strains in total were isolated from the sponges，and the separation effect of oligo-culture m2 was the best.the result of antibacterial activity screening found that 55 strains had antibacterial effect on at lea

6、st one of the 3 indicator bacteria.there were 11 strains preliminarily identified as streptomyces sp. having stronger antibacterial effect on all the 3 indicator bacteria.the results showed that most of the sponge-associated actinobacteria which was an important source of bioactive natural products

7、had quite strong inhibition on mariculture pathogen.it has a great development value in the field of mariculture.key words sponge-associated actinobacteria；inhibition of vibrio；antibacterial activity；diversity analysis隨著陸源微生物資源的開發(fā)難度越來越大，海洋豐富的微生物資源愈發(fā)受到人們的廣泛重視。海洋放線菌因?yàn)樯姝h(huán)境的特殊性，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、抑菌活性顯著的次級代謝產(chǎn)物1。海

8、綿是海洋放線菌最重要的一種共附生生物，其體內(nèi)的微生物可高達(dá)海綿生物量的50%60%2-3，因而是目前尋找新型天然活性化合物的重要途徑之一。近年來，已有不少學(xué)者從海綿中分離獲得具有強(qiáng)抑菌活性的放線菌菌株，在產(chǎn)生抗細(xì)菌、真菌等活性物質(zhì)上具有較大的潛能4-7。我國作為水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，隨著海水養(yǎng)殖行業(yè)的繁榮發(fā)展，由弧菌引起的水產(chǎn)病害仍是人們治療防范的重點(diǎn)。本研究從海綿中分離篩選出3種常見的海水弧菌，即副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus）、哈維弧菌（vibrio harveyi）、鰻弧菌（vibrio anguillarum），三者均屬于具有抑制作用的放線菌。本文通過16s rdn

9、a序列對具有較強(qiáng)抑菌活性的海綿放線菌進(jìn)行分子鑒定，旨在發(fā)現(xiàn)具有海水養(yǎng)殖應(yīng)用價值的海洋放線菌。 1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料1.1.1 海綿樣品。繁茂膜海綿（hymeniacidon perlevis）、軟海綿屬海綿（halichondria sp.）均采自大連黑石礁海域潮間帶，30 min內(nèi)迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。1.1.2 分離培養(yǎng)基。m2培養(yǎng)基：甘油6 ml，精氨酸1 g，k2hpo4·3h2o 1 g，nacl 20 g，mgso4·7h2o 0.5 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 l，ph值自然。m2培養(yǎng)基：甘油0.6 ml，精氨酸 0.1 g，k2hpo4·3h

10、2o 1 g，nacl 20 g，mgso4·7h2o 0.5 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 l，ph值自然。m8培養(yǎng)基：酪蛋白胨0.02 g，天冬氨酸0.01 g，丙酸銨4 g，k2hpo4·3h2o 0.05 g，mgso4·7h2o 0.1 g，feso4·7h2o 0.01 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 l，ph值7.0。rh培養(yǎng)基：棉籽糖1 g，組氨酸0.25 g，k2hpo4·3h2o 0.5 g，nacl 20 g，mgso4·7h2o 0.1 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 l，ph值7.0。gt培養(yǎng)基：甘露糖1 g，胱

11、氨酸0.25 g，k2hpo4·3h2o 0.5 g，nacl 20 g，mgso4·7h2o 0.25 g，caco3 0.05 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 l，ph值7.0。1.1.3 指示菌。副溶血弧菌、哈維弧菌和鰻弧菌均來自大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 海綿放線菌的分離。用無菌海水浸洗海綿5遍，除去表面附著的雜質(zhì)物，再用無菌研缽研磨成漿，加入無菌海水稀釋10倍8后，取100 l研磨液在不同的分離培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布，于28 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)基中均分別加入15 mg/l萘啶酮酸和50 mg/l重鉻酸鉀9抑制細(xì)菌和真菌的

12、生長。1.2.2 具有抑菌活性的海綿放線菌篩選。將分離純化的放線菌在改良高氏一號培養(yǎng)基8上28 培養(yǎng)810 d至成熟，采用瓊脂塊法10進(jìn)行抑菌活性篩選。用無菌打孔器（直徑10 mm）在長滿放線菌的平板上打孔，將瓊脂塊菌面向下分別置于涂布3種指示菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，30 培養(yǎng)24 h，觀察抑菌結(jié)果。1.2.3 具有抑菌活性的海綿放線菌的多樣性。以抑菌圈直徑（id）大小為判斷海綿放線菌抑菌活性強(qiáng)弱的指標(biāo)，對篩選出的抑菌活性較強(qiáng)（id15 mm）的海綿放線菌進(jìn)行分子鑒定。將海綿放線菌單菌落接入裝有5 ml滅菌 isp2液體培養(yǎng)基的15 ml試管中，于30 恒溫振蕩培養(yǎng)23 d。收集1 ml培養(yǎng)

13、液，按照takara minibest bacteria genomic dna extraction kit ver.3.0 試劑盒說明提取放線菌基因組dna。以提取的基因組dna為模板，參照信艷娟等9的引物f8/r1492的pcr反應(yīng)條件擴(kuò)增16s rdna片段。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果在ncbi 的genbank 進(jìn)行blast 比對，利用mega 5.0軟件中的neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。2 結(jié)果與分析2.1 海綿放線菌的分離利用5種分離培養(yǎng)基從海綿中共分離出57株放線菌，并且選用不同培養(yǎng)基對海綿放線菌的分離效果差別很大10 。由圖1可以看出，分離效

14、果較好的培養(yǎng)基有m2、rh和gt，其中m2培養(yǎng)基中共分離得到22株放線菌，分離效果最好。有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入低比例的營養(yǎng)成分能分離出更多的海洋特有放線菌11。m2培養(yǎng)基中除甘油和精氨酸外，僅提供了簡單的k、p和mg等無機(jī)鹽，適合海綿放線菌的分離，這與很多研究發(fā)現(xiàn)甘油-精氨酸培養(yǎng)基的分離效果較好相符12-14；rh和gt培養(yǎng)基除提供了唯一的碳源和氮源外，其中加入的一些無機(jī)離子成分作為無機(jī)營養(yǎng)鹽，都是成分簡單的寡營養(yǎng)培養(yǎng)基，滿足了海綿放線菌的特殊需求。2.2 具有抑菌活性的海綿放線菌篩選以抑菌圈直徑大小為海綿放線菌抑菌活性強(qiáng)弱的判斷指標(biāo)，其結(jié)果見表1?？梢钥闯?，從中篩選出11株活性較強(qiáng)（對3

15、株指示菌均具有抑菌效果，且至少對1株指示菌的抑菌圈直徑id15 mm）的海綿放線菌。分離出的57株海綿放線菌中有55株對3株指示菌中的至少1株有抑菌活性，表明海洋放線菌廣泛的抑菌活性具有無限的開發(fā)潛能，值得人們關(guān)注研究。2.3 具有抑菌活性的海綿放線菌的多樣性對篩選出的11株抑菌活性較強(qiáng)的海綿放線菌進(jìn)行16s rdna序列分析，利用mega 5.0軟件對這些序列進(jìn)行分析，采用鄰接法，重復(fù)取樣1 000次，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2所示。可以看出，篩選出的這11株海綿放線菌均屬于鏈霉菌屬的不同種，對3種指示菌均具有抑菌活性，展現(xiàn)出海綿放線菌的多樣性。3 討論海綿是一種簡單而古老的多細(xì)胞動物，能產(chǎn)生比

16、其他海洋生物物種更為豐富的生物活性物質(zhì)，是海洋天然產(chǎn)物的重要來源。其體內(nèi)大量的微生物資源得到分離并成功培養(yǎng)的占整個海綿微生物群落的不足0.1%15。對于海綿放線菌的分離培養(yǎng)，仍需要更積極地探索。其中，選擇性分離培養(yǎng)基的成分對于海洋放線菌的分離具有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)簡單的培養(yǎng)基更適合放線菌的分離8。常顯波等16用9種分離培養(yǎng)基對青島海區(qū)潮間帶的沉積物進(jìn)行放線菌分離，培養(yǎng)基m1、m6分離得到的放線菌數(shù)目較多，主要碳源為可溶性淀粉和棉籽糖，是放線菌的偏好營養(yǎng)成分17。m8含有放線菌喜好的精氨酸和甘油成分18-20，分離到的數(shù)量也較多，與本文中m2培養(yǎng)基分離效果最好一致，低營養(yǎng)的rh和gt培養(yǎng)基

17、同樣分離效果較好。 采用瓊脂塊法篩選海綿放線菌抑菌活性，海綿放線菌展現(xiàn)出較好的抑菌活性，在分離出的57株放線菌中有55株對3株指示菌中的至少1株有抑菌活性，僅有2株未表現(xiàn)出抑菌活性，說明海綿放線菌在開發(fā)抑菌活性物質(zhì)上有廣闊的前景。由于本文中指示菌的廣譜性不高，或者受分離方法的限制，對于未表現(xiàn)出抑菌活性的海綿放線菌并不能判定無活性，需要針對不同的指示菌或者采用不同的篩選方法進(jìn)一步的篩選驗(yàn)證。本研究中，從57株海綿放線菌中篩選出11株抑菌活性較強(qiáng)的海綿放線菌，對3株海水養(yǎng)殖病原指示菌均有抑制作用，且對至少1株指示菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑>15 mm，值得進(jìn)一步進(jìn)行抑制海水養(yǎng)殖弧菌的生物活性等方面的

18、研究。李 俠等21從山東日照海域潮間帶分離篩選出4株對半滑舌鰨鰻弧菌（vibrio anguillarum）和副溶血弧菌（vibrio paraha-emolyticus）同時具有較強(qiáng)拮抗作用的海洋放線菌，基本滿足海水養(yǎng)殖弧菌病防治要求。海洋放線菌對海水養(yǎng)殖病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，在海水養(yǎng)殖病害防治方面具有潛在的應(yīng)用價值。放線菌以產(chǎn)生豐富的次級活性代謝產(chǎn)物而著稱，特別是鏈霉菌屬作為已知放線菌中最大的族群，是產(chǎn)生抗生素最多的種屬22，受到人們的高度重視。本文對篩選出的11株抑菌活性較強(qiáng)的海綿放線菌進(jìn)行了16s rdna序列分析，初步鑒定均屬于鏈霉菌屬，進(jìn)一步說明海洋鏈霉菌是獲得活性代謝產(chǎn)物的重

19、要資源。4 參考文獻(xiàn)1 bernan v s，greenstein m，carter g t.mining marine micro-organisms as a source of new antimicrobials and antifungalsj.curr med chem-anti-infective agents，2004，3（3）：181-195.2 bergmann w，burke d c.contributions to the study of marine pro-ducts.xxxix.the nucleosides of sponges.iii.spongothymi

20、dine and spon-gouridinej.j org chem，1995，20（11）：1501-1507.3 wang g.diversity and biotechnological potential of the sponge-asso-ciated microbial consortiaj.ind microbiol biotechnol，2006，33：545-551.4 歐陽永長，梁梓添，姚雅琪，等.兩種南海海綿放線菌的分離和培養(yǎng)研究j.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（13）：3002-3005.5 蘇培，王德祥，柯才煥，等.海綿共附生放線菌hns054菌株的鑒定及發(fā)酵液抑

21、菌活性研究j.廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，51（6）：1085-1091.6 崔美子，朱平.豐肉結(jié)海綿相關(guān)放線菌ls-298代謝產(chǎn)物研究c/中國菌物學(xué)會第五屆會員代表大會暨2011年學(xué)術(shù)年會論文摘要集.廣州：中國菌物學(xué)會，2011.7 陳敏捷.海綿共附生鏈霉菌抗真菌活性篩選及多烯類抗生素生物合成基因結(jié)構(gòu)初析d.廣州：中國科學(xué)院南海海洋研究所，2009.8 張海濤.海綿放線菌的分離和多樣性研究d.大連：中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，2006.9 信艷娟，艾江寧，劉亞男，等.一株海洋放線菌的分離鑒定及活性研究j.生物技術(shù)進(jìn)展，2012，2（5）：354-358.10 高鵬，薛泉宏，常顯波

22、，等.拮抗放線菌的篩選培養(yǎng)基與篩選方法研究j.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，33（1）：59-63.11 jensen p r，gontang e，mafans c，et al.culturable marine acti-nomycete diversity from tropical pacific ocean sedimentsj.environ microbiol，2005，7：1039-1048.12 sun w，dai s k，jiang s m，et al.culture-dependent and culture-independent diversity of

23、 actinobacteria as-sociated with the marine sponge hymeniacidon perleve from the south china seaj.antonie van leeuwen-hoek，2010，98：65-75.13 王宏梅，趙心清.可培養(yǎng)海洋放線菌生物多樣性的研究進(jìn)展j.微生物學(xué)通報，2007，34（5）：996-1000.14 zhang h，lee y k，zhang w，et al.culturable actinobacteria from the marine sponge hymeniacidon perleve：is

24、olation and phylogenetic diversity by 16s rrna gene-rflp analysisj.antonie van leeuwen-hoek，2006，90（2）：159-169.15 webster n s，wilson k j，blackall l l，et al.phylogenetic div-ersity of bacteria associated with the marine sponge rhopaloeides od-orabilej.appl environ microbiol，2001，67：434-444.16 常顯波，劉文正，尹琦，等.海洋