硫酸銨飽和溶液計(jì)算

1、四）抗原的分離與純化從細(xì)胞中提取出來(lái)的生物大分子是不純凈的， 必須進(jìn)一步分離純化才能獲得 純品。 在生物大分子制備工作中， 分離純化是比較復(fù)雜和重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。 對(duì)于 異類的物質(zhì)，如提純蛋白質(zhì)和酶時(shí)混雜著核酸， 提純核酸時(shí)混雜著蛋白質(zhì)或多糖， 一般可用專一性酶水解、 有機(jī)溶劑抽提、 選擇性分部沉淀等方法處理， 小分子物 質(zhì)常在整個(gè)制備過(guò)程中多次液相與固相互相轉(zhuǎn)化被分離或最后用透析方法除去。 而對(duì)同類物質(zhì)，如酶和雜蛋白，RNA和DNA以及不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、酶、核酸之 間的分離， 情況則復(fù)雜得多， 主要應(yīng)用的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、 等電 點(diǎn)沉淀法、吸附法、結(jié)晶法、電泳法、超速離心法、柱層析

2、法等。其中鹽析法、 等電點(diǎn)法、 結(jié)晶法用于蛋白、 酶的提純較多； 有機(jī)溶劑抽提和沉淀用于核酸提純 較多；柱層析法、 梯度離心法在蛋白質(zhì)和核酸的提純工作中應(yīng)用均十分廣泛。 本 節(jié) 側(cè)重對(duì)蛋白質(zhì)、酶和核酸分離純化中與溶解度有關(guān)的一些方法作一簡(jiǎn)要敘 述。1蛋白質(zhì)分離純化的一些方法（1）鹽析法 原理：鹽析法對(duì)于許多非電解質(zhì)的分離純化都是適合的，也是蛋白質(zhì)和酶提純工作應(yīng)用最早， 至今仍廣泛使用的方法。 其原理是蛋白質(zhì)、 酶在低鹽濃度下 的溶解質(zhì)隨著鹽液濃度升高而增加 （此時(shí)稱為鹽溶） ；當(dāng)鹽濃度不斷上升時(shí)， 蛋 白質(zhì)和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出， 稱為蛋白質(zhì)的鹽析。 這一現(xiàn)象 是由于蛋白質(zhì)分子

3、內(nèi)及分子間電荷的極性基團(tuán)有著靜電引力， 當(dāng)水中加入少量鹽 類時(shí)，由于鹽類離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子上的極性基團(tuán)的影響， 使蛋白質(zhì)在水 中溶解度增大。 但鹽濃度增加到一定程度時(shí)， 蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和， 水 化膜被破壞， 于是蛋白質(zhì)就相互聚集而沉淀析出。 鹽析法就根據(jù)不同蛋白質(zhì)和酶 在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達(dá)到彼此分離的方法。 鹽的選擇：蛋白質(zhì)鹽析常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯 化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨，其優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25C時(shí)飽和溶解度為4.1mol/L,即767g/L;0 C時(shí)飽和溶解度為3.9mol/L，即 676g/L），在

4、這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái)， 而且硫酸銨 價(jià)廉易得， 分段效果比其他鹽好， 不容易引起蛋白質(zhì)變性。 應(yīng)用硫酸銨時(shí)， 對(duì)蛋 白氮的測(cè)定有干擾， 緩沖能力比較差， 故有時(shí)也應(yīng)用硫酸鈉， 如鹽析免疫球蛋白， 用硫酸鈉的效果也不錯(cuò)，硫酸鈉的缺點(diǎn)是 30E以上溶解度太低。其他的中性鹽 如磷酸鈉的鹽析作用比硫酸銨好， 但也由于溶解度太低， 受溫度影響大， 故應(yīng)用 不廣。硫酸銨濃溶液的pH在4.55.5之間，市售的硫酸銨常含有少量游離硫酸， pH值往往降至4.5以下，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。 硫酸銨飽和度計(jì)算法及加入方式：在分段鹽析時(shí)， 加鹽濃度一般以飽和度表示，飽

5、和溶液的飽和度定為 100%。用硫酸銨鹽析時(shí)其溶液飽和度調(diào)整方法有 3 種。一是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大， 所需調(diào)整的濃度不高時(shí)， 可加入飽和硫酸銨溶液；飽和硫酸銨配制方法可加入過(guò)量的硫酸銨，熱至 5060C保溫?cái)?shù)分鐘，趁 熱濾去沉淀，再在0C或25E下平衡12天，有固體析出時(shí)即達(dá)100%飽和度。 鹽析所需飽和度可按下式計(jì)算：式中V及V0分別代表所需飽和度硫酸銨溶液及原溶液的體積， S2及S1分 別代表所需達(dá)到的和原溶液的飽和度。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，混合不同體積的溶液時(shí)，總體 積會(huì)發(fā)生變化使上式造成誤差，但這由體積改變所造成的誤差一般小于 2%故 可忽略不計(jì)。另一種是所需達(dá)到飽和度較高而溶液的體積又不再過(guò)分

6、增大時(shí)， 可 直接加入固體硫酸銨，其加入量可按下式計(jì)算：式中X是將1升飽和度為S1的溶液提高到飽和度為S2時(shí)所需硫酸銨的重量(g), G及A為常數(shù)，與溫度有關(guān)。G在0C時(shí)為707, 20C時(shí)為0.29。為方便 起見(jiàn)，在室溫及C時(shí)所需硫酸銨的飽和度可直接查表2-1、表2-2求出。表2- 1室溫下由S1提高到S2時(shí)每升加固體硫酸銨的克數(shù)0.100.20.250.300.350.400.450.50.550.600.650.700.750.800.850.900.951.000551131141752092422783123503904304745195606086577087600.1057671

7、181491822152502873253654054484945305856346850.202959901211541882252602983373794204655125596100.252960911231571922282653043453864304755215710.303061931251601952322703103513944394855330.3306294128163199235 275 3153584034494950.403163961311662052402803223654104580.45316498133169206245286330 3734200.532

8、63100135 172 211250292 3353800.533661011381762142552983440.633671031401792192613050.6534691051431822242670.7034701081461872280.7535721101491700.836731121520.8537751140.937762 938鹽析時(shí)注意的幾個(gè)問(wèn)題1）鹽的飽和度：鹽的飽和度是影響蛋白質(zhì)鹽析的重要因素，不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。分離幾個(gè)混合組分的蛋白質(zhì)時(shí)，鹽的飽和度常由稀到 濃漸次增加，每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀進(jìn)行離心或過(guò)濾分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋

9、白質(zhì)沉淀。例如用硫酸銨鹽析分離血漿中的蛋白質(zhì)， 飽和度達(dá) 20%寸，纖維蛋白原首先析出；飽和度增至 28%- 33%寸，優(yōu)球蛋白析出；飽和度 再增至33%-50%寸，擬球蛋白析出；飽和度大于50%以上時(shí)，白蛋白析出。用硫 酸銨不同飽和度分段鹽析法，從牛胰中酸性提取分離可得到九種以上蛋白質(zhì)及酶。2）pH值：在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最小容易沉淀析出，因此，鹽析時(shí)除 個(gè)別情況外，pH值常選擇在被分離的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。3）蛋白質(zhì)濃度：在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易沉淀，使用鹽的飽和度的極限愈低，如血清球蛋白的溶度從0.5%增到3.0%時(shí)，需用中性鹽的飽和度的最低極限從29%遞減至24%某一蛋白

10、質(zhì)欲進(jìn)行兩次鹽析時(shí)，第 1次由于 濃度較稀，鹽析分段范圍較寬，第2次則逐漸收窄，例如用硫酸銨鹽析膽堿酯酶 時(shí)，第1次硫酸銨飽和度為35%S 60%第2次為40%g 60%蛋白質(zhì)濃度高些雖 然對(duì)沉淀有利，但濃度過(guò)高也容易引起其他雜蛋白的共沉作用，因此，必須選擇適當(dāng)濃度，盡可能避免共沉作用的干擾。表2-2 0 C下由S1提高到S2時(shí)每100ml加固體硫酸銨的克數(shù)溶液飽區(qū)0C時(shí)所達(dá)到硫酸銨飽和度（%的原和202530 3540455055606570 7580859095100始飽度在100毫升中欲加固體硫酸銨的克數(shù)和度010.113.16.119.22.25.29.132.36.39.n43.14

11、7.51.5560.65.69.(%6444 6816186 J66930757.910.13.16.19.22.26.29.33.36.40.44.48.52.57.61.66.8767926185446052105.38.110.13.16.20.23.26.30.33.37.41.45.49.53.58.62.999036174223617152.65.46.211.114.117.220.423.727.130.634.338.142.046.050.354.759.2200 :2.75.58.311.14.17.20.24.27.31.34.38.42.46.51.55.335716

12、29779272502.75.68.411.14.17.21.24.28.31.35.39.43.47.嚴(yán)5691507556823002.85.68.611.14.818.121.24.928.32.336.240.244.48.874553502.85.78.711.15.18.21.25.29.32.36.41.45.814841990312.15.18.22.25.29.33.37.41.4002.95.88.9037286568452.95.99.012.15.19.22.26.30.34.38.0360632235009.212.15.19.23.26.30.34.3.06.059408885503.06.19.312.716.119.123.527.331.36003.16.29.512.16.20.23.27.941996503.16.39.713.216.820.521.4700