整個(gè)基因克隆實(shí)驗(yàn)流程完整

1、一、組織總RNA的提取相關(guān)試劑： Trizol ；氯仿；苯酚；異丙醇；75%乙醇； RNase-free水相關(guān)儀器： 制冰機(jī)；液氮 & 研缽 /生物樣品研磨儀；高速離心機(jī)；移液器（1ml、200l、100l/50 l）；渦旋振蕩儀；恒溫金屬浴。相關(guān)耗材： 解剖工具，冰盒，離心管，離心管架，吸頭（1ml， 200l/300 l），一次性手套，實(shí)驗(yàn)手套。實(shí)驗(yàn)步驟1.取暫養(yǎng)草魚，冰上放置一段時(shí)間，然后解剖，剪取腸道 50100mg，放入研缽中，加入液氮迅速研磨，然后加入 1ml 預(yù)冷 TRIzol 試劑，充分研磨至無顆粒物存在。2. 轉(zhuǎn)移到離心管中，室溫放置 5min，使細(xì)胞充分裂解；3.按

2、 1ml Trizol 加入 200l 氯仿，蓋上蓋子，迅速充分搖勻15s，然后室溫放置 3min ；4.4， ,12000g 離心 15min；RNA 存在此時(shí)混合物分為三層，下層紅色的苯酚氯仿層，中間層和上層無色水相；于無色水相中；5. 小心吸取上清液，千萬不要吸取中間界面，否則有 DNA 污染；轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻；6. 室溫放置 10min； 4， ,12000g 離心 10min；7. 棄上清，加入 1ml 75%乙醇洗滌；渦旋，懸浮沉淀； 4， ,12000g 離心 5min；8. 棄上清；可以再次用 75%乙醇洗滌沉淀；9. 棄上清；用移液器輕輕吸取

3、管壁或管底的殘余乙醇，注意不要吸取沉淀；室溫放置 5min 晾干沉淀；（ RNA 樣品不要過于干燥，否則極難溶解）10. 沉淀中加入 30lRNase-free 水，輕彈管壁，使 RNA 溶解。RNA 質(zhì)量檢測(cè)相關(guān)試劑： 溴酚藍(lán)，TEB/TAE 電泳緩沖液，溴乙錠（ EB）相關(guān)儀器： （超微量分光光度計(jì)，移液器（ l 或 2l 規(guī)格， 10l 規(guī)格），電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，制冰機(jī)）相關(guān)耗材： （無菌無絨紙，吸頭，離心管架， PCR 管， PCR 管架，錐形瓶，燒杯，一次性手套，實(shí)驗(yàn)手套，冰盒）（1） RNA 純度的檢測(cè)：測(cè)定其 OD260 和 OD280 的值，根據(jù)其

4、OD260/ OD280 的比值，當(dāng)其比值在 之間，說明提取的總 RNA 純度比較高，沒有蛋白質(zhì)和基因組的污染。（2）RNA 完整性的檢測(cè)：取 2lRNA ，與 2l 溴酚藍(lán)混勻，用 1%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，20min 后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察效果。當(dāng) 28S 與 18S 條帶清晰，且亮度比大約是 2:1 時(shí)，5S 條帶若隱若現(xiàn)，而且沒有其它條帶時(shí)，說明完整性不錯(cuò)，可以用于下游逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。二、逆轉(zhuǎn)錄（ RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA ）相關(guān)儀器： （PCR 儀/恒溫金屬浴，移液器（ l 或 2l 規(guī)格， 10l 規(guī)格）， 100l 冰盒，制冰機(jī)， PCR 管）根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ TOYOBO 公

5、司）說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系及條件如下：試劑使用量（ l）Rnase Free H2OOligo （ dT）1Total RNAY（<1000ng）Total Volume65， 5min 后，立即置于冰上。試劑使用量（ l）上一步變性后 RNA 溶液5×RT Buffer4dNTP Mixture（各 10mM ）2Rnase Inhibitor（ 10U/l）Rever Tra Ace1Total Volume20然后放置于 PCR 儀上，反應(yīng)程序?yàn)椋?2,60min；99,5min；16,5min。所得 cDNA放置于 -20保存。三、PCR 反應(yīng)相關(guān)儀器： （PCR 儀 /

6、恒溫金屬浴，移液器（ l 或 2l 規(guī)格， 10l 規(guī)格）， 100l 電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，冰盒，制冰機(jī)）反應(yīng)條件：3min； 94變退火 30s，7235 個(gè)循環(huán)；10min。反應(yīng)結(jié)束后，物，1%瓊脂糖測(cè)。試劑使用量（ ）95,預(yù)變性l2性 30s， 55ddH O延伸 45s，共反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10× PCR Buffer72延伸dNTP（ 10mmol/l ）取 5l PCR 產(chǎn)Taq 酶（ 1U/l）Ghrelin-F（ 10mol/l ）凝膠電泳檢Ghrelin-R（ 10mol/l ）MgCl 2（25mmol/l ）Total Volume10四、P

7、CR 產(chǎn)物的分離，回收和純化相關(guān)試劑： 膠回收試劑盒相關(guān)儀器： （紫外照膠儀，移液器（ 200l，1ml 規(guī)格），離心機(jī)，恒溫金屬浴，渦旋混勻儀，制冰機(jī)，超微量分光光度計(jì)）相關(guān)耗材： （切膠刀片，吸頭，離心管架）PCR 反應(yīng)得到目的條帶后，加大反應(yīng)體積，然后根據(jù)膠回收試劑盒說明書進(jìn)行目的片段的回收純化。將所得 DNA 貯存于 -20。五、目的片段與載體的連接相關(guān)儀器： （恒溫金屬浴，移液器（ 10l，l 規(guī)格）渦旋混勻儀，制冰機(jī)）按照連接試劑盒 (TAKARA公司 )說明書進(jìn)行操作。pMD-18T 載體1lDNA2lddH2O2l然后加入 5l Ligation Mix，4 /16放置 過夜連

8、接。六、轉(zhuǎn)化相關(guān)儀器： （超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，恒溫金屬浴/水浴鍋，移液器（ 1000l，100l，10l，l 規(guī)格）渦旋混勻儀，制冰機(jī)）CaCl 2 法制備大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞全過程冰上進(jìn)行， 4離心，無菌操作。（1）以接種環(huán)從 -80保存的高效轉(zhuǎn)化菌種蘸取少量菌液劃無抗生素平板，培養(yǎng) 12h；（2）挑取單菌落接種于 1ml 無抗生素 LB 培養(yǎng)基中， 37劇烈震蕩培養(yǎng) 6h；（3）按 1:100 接種菌液于 25ml LB 液體培養(yǎng)基中， 37震蕩培養(yǎng) 2h，至 OD600 達(dá)；（這一步非常關(guān)鍵，培養(yǎng)過度的菌液含有較多的“老”細(xì)胞，制備成感受態(tài)細(xì)胞后其接受外援

9、DNA 的能力較低，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低）（4）冰上預(yù)冷 10min；然后 4， 6000rpm 離心 10min；（6）棄上清，將細(xì)菌沉淀重新懸浮于 25ml 預(yù)冷的 CaCl2 中，冰??；（7） 4， 6000rpm 離心 10min，棄盡上清；20min（8）以（菌液體積的5%）預(yù)冷的 0.1M CaCl2 溶液重懸細(xì)菌沉淀， 同時(shí)加入預(yù)冷的 100%甘油（甘油終濃度達(dá)1520%），混勻后按每支 100l 在冰上分裝。 -80保存?zhèn)溆?。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞（1）將 10l 連接產(chǎn)物加入 100l 感受態(tài)菌液中，冰上放置30min；（2）然后放到 42水浴鍋中熱激 90s，再在冰上放置3

10、min；（3）加入 890lLB 液體培養(yǎng)基， 37震蕩培養(yǎng) 60min；（4）每個(gè)培養(yǎng)平板中加入 40lX-gal 和 4lIPTG ，然后吸取 100l 菌液，均勻涂布于含 Amp 的 LB 固體培養(yǎng)基平板上；（5）37培養(yǎng)箱中正放1h，待菌液被瓊脂完全吸干后， 倒置平板，過夜培養(yǎng) 16h。（培養(yǎng)時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則有衛(wèi)星菌落產(chǎn)生）七、菌液 PCR 檢測(cè)相關(guān)儀器：（PCR 儀/恒溫金屬浴， 渦旋混勻儀，移液器（ 10 規(guī)格，1000l 規(guī)格），100l電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，冰盒，制冰機(jī)）在平板上挑取 1020 個(gè)白色菌落，加入含有 1ml Amp+LB 液體培養(yǎng)基的離

11、心管中，37震蕩培養(yǎng) 6h。3000rpm 離心 3min 后吸掉上層 400l 上清液，短暫渦旋將沉淀打散，然后把菌液當(dāng)成模板， 按上面 PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增， 經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否含有目的條帶。挑選擴(kuò)增出正確目的條帶的菌液送公司測(cè)序。附注：主要溶液和培養(yǎng)基的配制1）電泳緩沖液 10×TBE： 108g Tris 堿， 55g 硼酸， 20ml 0.5M 的 EDTA ，加入蒸餾水混勻后定容至 1000ml，調(diào)節(jié) pH 為；2）LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g；加 800ml 去離子水，用10M NaOH 調(diào)節(jié) pH 至，定容至 1000

12、ml，高壓（× 100000Pa）滅菌 20min， 4保存；3）LB 固體培養(yǎng)基：在 LB 液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度為%，高溫、高壓滅菌 20min后降溫至 5060，在無菌狀態(tài)下鋪制平板，室溫放置過夜后，置于4保存；4）氨芐青霉素貯存液：用無菌雙蒸水配成 100mg/ml，分裝， -20保存。使用時(shí)終濃度為 100ug/ml。5）用于制備感受態(tài)細(xì)胞的 CaCl2（l）：稱取 0.56g CaCl2（無水，分析純），溶解于 50ml 雙蒸水中，定容至 100ml，高壓滅菌；6）X-gal （ 20mg/ml）的配制：將 20mg X-gal 溶于 1ml 二甲基甲酰胺中， -

13、20避光保存；7）IPTG（ 200mg/ml）的配制：將溶于 1ml 去離子雙蒸水中， m濾膜除菌， -20保存?zhèn)溆茫?RACE（dT） 17接頭引物： 17-5 GACTC GAGTC GACAT CGA(T)3接頭引物： 5GACTC GAGTC GACAT CG31. cDNA 的合成DEPC 水lOligo dT接頭引物1lTotal RNA2l(<1000ng)65,5min；立即置于冰上。第一步變性后的 RNA 溶液l5×RT Buffer4ldNTP Mixture （各 10mM ）2lRnase Inhibitor（40U/l）lRever Tra Ace1

14、l總體積20l反應(yīng)條件： 42 ,60min； 99,5min； 16,5min。2. cDNA 的純化利用膠回收試劑盒進(jìn)行（去除多余的dNTP 和引物）。最后使用20lTE 洗脫沉淀。3. 第一輪 PCRcDNA1l10×Buffer1ldNTP（10mmol/L ）lOligo dT 接頭引物 (10mol/L)l3RACE 外引物 (10mol/L)lTaq 酶(1U/ l)lMgCl 2（25mmol/L ）lddH2Ol反應(yīng)條件：降落 PCR。PCR 產(chǎn)物稀釋 10 倍作為模板進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。4. 第二輪 PCRcDNA1l10×Buffer1ldNTP（10mmo

15、l/L ）l接頭引物 (10mol/L)l3RACE 內(nèi)引物 (10mol/L)lTaq 酶(1U/ l)lMgCl （25mmol/L ）l2ddH2Ol反應(yīng)條件：降落 PCR。5RACE1. cDNA 的合成DEPC 水l基因特異性反義引物1lTotal RNA2l(<1000ng)65,5min；立即置于冰上。第一步變性后的 RNA 溶液l5×RT Buffer4ldNTP Mixture （各 10mM ）2lRnase Inhibitor（40U/l）lRever Tra Ace1l總體積20l反應(yīng)條件： 42 ,60min； 99,5min； 16,5min。2. cDNA 的純化dNTP 和引物）。最后使用20lTE 洗脫沉淀。利用膠回收試劑盒進(jìn)行（去除多余的3. cDNA 的加尾純化后的 cDNAl5×末端轉(zhuǎn)移酶緩沖液2l1mmol/l dATP2l末端轉(zhuǎn)移酶（ 30U/l）l總體積10l反應(yīng)條件： 37 ,60min；70，10min。 反應(yīng)結(jié)束，把 cDNA 稀釋 1 倍作模板進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。4. 第一輪 PCRcDNA1l10×Buffer1ldNTP（10mmol/L ）lO