[精品]乳鐵蛋白的分離工藝研究

1、乳鐵蛋白的分離工藝研究牛初乳是指奶牛產(chǎn)犢后3d內(nèi)所分泌的乳汁。科學(xué)研究證實(shí)，牛初乳是自然界因子最為 富集的生物資源z。包括重耍的免疫因子和生長(zhǎng)因子，如免疫球蛋白（igg）、乳鐵蛋白 （lf）及胰島素生長(zhǎng)因了 （igf）等，含量比常乳高10100倍。這些生理活性成分具有免 疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、促進(jìn)牛長(zhǎng)發(fā)育、抑制腫瘤等牛物功能，不僅可以制造功能保健食品，而 且還具有開(kāi)發(fā)天然活性生物藥物的巨大潛力。乳鐵蛋白又稱(chēng)“乳轉(zhuǎn)鐵蛋白”，是一種糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族。lf的一級(jí)結(jié)構(gòu)是一條 多肽鏈，分子量為7080kd, lf上結(jié)合有兩條糖鏈，含量為7%左右，其組成包括有半乳 糖、甘露糖、n乙酰半乳糖胺、藻糖等。

2、lf具有多種生物活性，如促進(jìn)鐵的吸收、抑菌抗 病毒、促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞生成、調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)、刺激溶菌醜再生、防止脂質(zhì)過(guò)氧 化等。在牛初乳中，乳鐵蛋白的含量為1.00mg/ml,比常乳高近50倍。我國(guó)約有乳牛近430 萬(wàn)頭，其中成年母牛260萬(wàn)頭，以每頭乳牛年產(chǎn)初乳50kg計(jì)算，每年可產(chǎn)近130t乳鐵蛋 口，因此生產(chǎn)乳恢蛋口的原料極為豐富，它的開(kāi)發(fā)利用將帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。 但牛初乳具冇異味及粘稠度大，難于加工處理的特點(diǎn)，除喂養(yǎng)牛犢z外，利用率非常低。初 乳木身所具備的潛在價(jià)值得不到充分的反映。因此，高效綜合利用牛初乳資源，開(kāi)發(fā)出合理 的分離技術(shù)路線(xiàn)以提収高純度、高活性的天然活性

3、蛋白質(zhì)，特別是開(kāi)發(fā)生物藥原料有十分重 耍的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)離子交換色譜技術(shù)，成功地從初乳中分離出了高純度的乳鐵蛋 白，并對(duì)此分離過(guò)程做了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，達(dá)到了低成木分離高純度乳鐵蛋白的目的。1原料與器材1.1原料與試劑牛初乳：乳牛產(chǎn)犢3d內(nèi)收集的樣品，cm-sephadex 050：進(jìn)口分裝bmk （shanghai） sci& tech ltd, cm-sepharose fast flow, lf標(biāo)準(zhǔn)樣品、電泳級(jí)丙稀酰胺acr、電泳級(jí) 甲叉雙丙稀酰胺bis、分析純tris堿（三甕甲基氨基甲烷），化學(xué)純sds（ i二烷基磺酸鈉）， 分析純temed （四甲基乙二胺），過(guò)硫酸胺ap,

4、分析純廿氨酸，考馬斯亮藍(lán)r250等。 1.2實(shí)驗(yàn)儀器sbs100數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器、hd2188核酸蛋白檢測(cè)儀、3057 portable recorder. bt01-100蘭格恒流泵、th-500梯度混合器、phs-25型ph計(jì)、dyy-8b型穩(wěn) 壓穩(wěn)流電泳儀、dyiii 28a型電泳槽、751g分光光度計(jì)、tdl-5000b冷凍離心機(jī)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1分離方法2.1.1凝膠的預(yù)處理取液體膠與去離子水1混合，浸泡，沉降裝柱。以2bv的流速先川堿洗2.5h （5倍 膠體積），用去離了水洗至ph值為7.0左右，用酸洗2.5h,用水洗至ph值為7.0左右，再 用堿洗2.5h,后用水洗至ph值

5、7.0左右備用。2.1.2牛初乳的脫脂取新鮮牛初乳在冷凍離心機(jī)中離心30min （4 800r/min, 15°c）,去上層油脂。2.1.3階躍洗脫的方法5%nac) w峰1.6沁c洗脫峰i!圖 1 cm-sepharose fast flow 洗在4°c條件下動(dòng)態(tài)上柱吸附8ho去離子水以1bv的流速洗柱約10h,待基線(xiàn)走平，用 1.6%naq洗脫約需5h,期間雜蛋口被洗脫卜-來(lái)，待基線(xiàn)再度走平，使用5.0%nao洗脫， 洗脫產(chǎn)物為lf （粉紅色），出峰吋間為1h左右。洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。2.1.4 cm-sepharose fast flow 的穿透曲線(xiàn)（圖 2）穿融線(xiàn)一-&

6、#163;1 , 04小日寸10另鐘5小日寸“5分鐘t'圖2穿透曲線(xiàn)在實(shí)驗(yàn)中利用純度為97%標(biāo)準(zhǔn)樣品配制濃度為4.80g/l的lf溶液，在約5bv流速下測(cè) 定膠體積為62ml的cm-sepharose fast flow的穿透|11|線(xiàn)。根據(jù)洗脫記錄可計(jì)算得到在 穿透點(diǎn)到達(dá)詢(xún)，cm-sepharose rst flow的實(shí)際吸附容量為2g左右。2.1.5透析取洗脫液于透析袋，放在蒸憎水屮24h,中間每8h換一次水，除丈洗脫液屮的鹽類(lèi)小分 子。2.1.6干燥冷凍干燥法，此法對(duì)乳鐵蛋白的生物活性損失小。2.2分析方法2.2.1蛋白質(zhì)測(cè)定用核酸蛋口檢測(cè)儀測(cè)定蛋口質(zhì)。2.2.2乳鐵蛋白純度的分

7、析用hplc法和凝膠電泳法進(jìn)行純度分析。3結(jié)果與分析3.1交換劑的選擇根據(jù)乳鐵蛋白的特性，木實(shí)驗(yàn)選用弱酸性陽(yáng)離了交換劑，并選川na型交換劑作為貯存、 吸附時(shí)的離子型。比較了 cm-sephadex 050和cm-sepharose fast flow 2種樹(shù)脂的分離效果。表 i cm-5ephadex c-50 與 cm-5epharo5e ff 洗脫紐 比鮫翦子交換劑初乳體積(1)洗脫液體積ml)洗脫液中l(wèi)f液度) lf/tl牛初乳(創(chuàng))lf的純度()cm-sephadex c-502451.840.415舛9cm-sepharose ff2621.610.50096.9從表1可以看出，相同

8、單位量的牛初乳原料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，cm-sephadex 050和 cm-sepharose fast flow相比，洗脫得到的lf的雖:和純度都相差不大，只是 cm-sephadex g50得到的洗脫液呈較深粉紅色，而川cm-sepharose f7st flow洗脫 得到的洗脫液顏色略淺一些。使用相同的裝柱方法時(shí)，cm-sepharose fast flow比cm-sephadex c-50更容易操 作，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體積不會(huì)發(fā)生變化，冇利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)由于裝柱過(guò)程對(duì)洗脫 效果也有相當(dāng)程度的影響，故后繼實(shí)驗(yàn)選用cm-sepharose fast flow為交換劑。6.93.2吸附方法的選

9、擇(見(jiàn)圖3)6.8肛 丘6-76.6f6.5 6.412345時(shí)間(b)靜態(tài)吸附圖3 兩種吸附方法的ph值變化離子交換色譜的吸附方法主要分為靜態(tài)吸附與動(dòng)態(tài)吸附2類(lèi)。靜態(tài)吸附需要的時(shí)間比較 少，但是無(wú)法實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，只能停留在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模提取階段，缺乏工業(yè)化生產(chǎn)的可能性。 而動(dòng)態(tài)吸附比較容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，需要的時(shí)間一般隨原料的雖而變化。2種吸附方法在后期的ph值基本保持穩(wěn)定，說(shuō)明牛初乳具有良好的緩沖功能。由于靜態(tài)吸 附后的吸附劑難于裝柱，故選用動(dòng)態(tài)吸附法。3.3吸附速度的選擇由于在工業(yè)化生產(chǎn)屮為了提高生產(chǎn)效率，必然在不影響產(chǎn)品得率的前提下降低生產(chǎn)周期。 而牛初乳的上柱吸附時(shí)間在整個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)中占了很

10、大的一個(gè)比例。盡可能的提高牛初乳的吸 附速度成為工業(yè)化生產(chǎn)的必然選擇。由于吸附速度受牛初乳的理化性質(zhì)及離子交換柱的徑高 比等因素的影響，本實(shí)驗(yàn)只在現(xiàn)有條件卜比較了 3種不同吸附速度的效果比較。從表2我們可以看出3bv和5bv兩個(gè)吸附速度的產(chǎn)品得率相差不大，7bv的收率偏低，估 計(jì)已超過(guò)穿透速率。故選用5bv的吸附速度。表2 3種吸附速慶的lf得舉比較吸附速度 初乳體積(i)洗脫液體積(ml)洗脫液的lf濃度(知lf/il牛初?l(g/l) lf的純度您)3bv2671490j5ot96.95bv2621.56048695.87bv242150031595.63.4洗脫方法的選擇洗脫方法中，授常

11、用的是階躍洗脫與梯度洗脫法。2組梯度洗脫實(shí)驗(yàn)，分別使用5%nao 以及10%nao的濃縮液，稀釋液均為去離子水。表3 階躍洗脫與梯皮洗脫效果比較選脫方祛初乳體積（i） lf洗脫液體積（ml）洸脫液中l(wèi)f濃度（卻lf/il牛初亂（”l） lf純度（莎脫2621.6100596.9梯頗脫(5%nacl)52000.400.1681.7梯度洗猊（10%同）51800.5083.65%nac梯虜那圖4 5%nacl梯度洗脫曲線(xiàn)10沁c梯度剋兌團(tuán)5 10%nad梯度洗脫曲線(xiàn)表3中可以看出，階躍洗脫的效果要好于梯度洗脫。從洗脫曲線(xiàn)上（見(jiàn)圖4、圖5）可 以看出，梯度洗脫的梯度沒(méi)冇掌握好，峰都重疊在了一起，沒(méi)冇達(dá)到要求的分離度?？赡苁?梯度太小，從而流動(dòng)相的濃度增大，速度太小，峰型過(guò)寬，影響了最終的分離度。從洗脫曲 線(xiàn)上也可看出，隨著梯度洗脫的梯度的增大，峰型變得窄一些和陡一些，洗脫效果也有所提一 咼。3.5產(chǎn)品的透析和凍干（見(jiàn)圖6、圖7）洗脫液經(jīng)透析24h后冷凍干燥，得lf固態(tài)產(chǎn)品。樣品圖6乳鐵蛋白產(chǎn)品的sds-pace電泳圖譜圖7產(chǎn)品的高敷液相色譜圖4結(jié)論本文主要對(duì)牛初乳中乳鐵蛋白lf分離純化的工藝進(jìn)行了研究，并對(duì)其工藝流程實(shí)現(xiàn)了優(yōu) 化。得到最佳洗脫工藝：使用cmsapharoserst flow裝柱，再轉(zhuǎn)化為na型，然后 用脫脂牛初乳作為