化學發(fā)光免疫分析翻譯

1、.化學發(fā)光免疫分析姓 名： 周金倩 學 號： 113138301 專 業(yè)： 環(huán)境科學 學 院：環(huán)境科學與安全工程學院 2009年第4號第28卷，分析化學的趨勢化學發(fā)光免疫分析趙麗霞，孫儷，褚曉剛化學發(fā)光免疫分析（CLIA）有幾種潛在的優(yōu)勢，并且已經(jīng)在臨床醫(yī)學、生物分析和環(huán)境分析中應(yīng)用。本文涵蓋了CILIA在免疫學、CL標記及相關(guān)技術(shù)和固相材料中的應(yīng)用和最新的進展。我們描述了CLIA的自動化、集成及小型化。我們評價了不同類型的CLIA系統(tǒng)并且預測了它未來的發(fā)展方向。關(guān)鍵詞：生物分析，化學發(fā)光免疫分析，化學發(fā)光標記，環(huán)境分析，免疫學，標記，制藥分析，毒理學分析1. 導論由于免疫分析（IA）具有高靈

2、敏度、高選擇性、快速檢測和不用廣泛的治愈就能分析困難的矩陣等優(yōu)點，因而被廣泛應(yīng)用于制藥分析、毒物分析、生物分析、臨床醫(yī)學和環(huán)境分析中。1959年，雅洛和博森1用125I 作為標記元素，繼而放射免疫法（RIA）被發(fā)明。雖然RIA方法可靠并精確，但是這種方法在放射性同位素方面的應(yīng)用還不是很好，放射性同位素限制這種方法必須施用專門的標記物。并且125I的半衰期較短2,3，這也限制了放射免疫法的普及。酶聯(lián)免疫分析方法（ELISAs）比RIA更安全、更容易，因而應(yīng)用比較廣泛。ELISA是以比色、熒光和化學發(fā)光（CL）檢測為基礎(chǔ)的檢測方法。然而，傳統(tǒng)的比色法檢測的靈敏度相對較低4。IA具有非常高的檢測靈敏

3、度5,6，因而被應(yīng)用于檢測方法中，這種方法依靠的是特異性抗體（Abs）的親和力和檢測方法的靈敏度。在檢測方法中，CL檢測方法是在生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用范圍較廣的一個多功能的、超靈敏的工具。CL方法替代了放射性的方法，與IA的檢測原理相結(jié)合用于檢測分子（如蛋白質(zhì)、激素、藥物、核酸和環(huán)境污染物等）?，F(xiàn)在，CL經(jīng)常以一個CL標記物的形式或以一種酶或納米粒子（NP）的檢測反應(yīng)的形式用于IA方法中。近年來，由于CLIA具有高靈敏度、寬的動態(tài)范圍和完整的自動化等優(yōu)點，已被廣泛的應(yīng)用于臨床醫(yī)學和環(huán)境分析中。隨著重組抗體（rAb）技術(shù)、標記和相關(guān)技術(shù)、固相材料、自動化的技術(shù)改進、集成化和小型化技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，CL

4、IA已經(jīng)獲得一個全新的改觀。2.免疫識別在過去，多克隆和單克隆Abs(pAbs和mAbs)一直主導著IA，并且以后也會繼續(xù)7。傳統(tǒng)上，Abs可以從超免疫動物和雜交瘤細胞中獲得。迄今為止，表展示了rAbs在很多動物體內(nèi)提?。ㄈ缤米?、羊、雞和牛），這種提取方法相對比較便宜且提取量比較大，但是這種提取方法會摻雜著結(jié)構(gòu)相似的化合物和共存污染物，共存污染物用于分析以pAb為基礎(chǔ)的檢測基質(zhì)效應(yīng)。雖然mAbs通常由小鼠體內(nèi)提取8，但是它們擁有特異性結(jié)合的特點，并且是基于單克隆抗體的檢測，比基于pAb為基礎(chǔ)的檢測更為敏感。生產(chǎn)單克隆抗體的主要缺點是它們很昂貴并且產(chǎn)生和維持一個雜交瘤細胞株9要求的技術(shù)水平比較高

5、。動物的免疫反應(yīng)可以預先確定單克隆抗體的結(jié)合特性并且在蛋白質(zhì)水平上很難修改10。然而，由于表達抗體片段的分子方法和生產(chǎn)及篩選組合庫技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)開辟了一個比較寬的用于選擇和設(shè)計rAbs的機會11。rAbs不需要結(jié)合骨髓瘤細胞就可以從各種動物體內(nèi)提取。從動物體內(nèi)提取的抗體基因能夠通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）而擴增，并能以各種形式在不同的表達系統(tǒng)中被表達。例如：片段，抗原結(jié)合（Fab），片段，變量區(qū)域（Fv），單鏈Fv（scFv）和單域的重鏈可變區(qū)片段（VHH），從駱駝體內(nèi)提取的重鏈Abs（HCAbs）如圖1。分析物 抗體片段 參考文獻阿特拉津 雜交瘤細胞的Fabs 12毒死蜱-乙基 雜交瘤細

6、胞的單鏈抗體可變區(qū)域片段 13多氯聯(lián)苯 雜交瘤細胞的Fabs 14細胞表面蛋白質(zhì) 人的重組體單鏈抗體可變區(qū)域片段 15二惡英（2，3，7，8-TCDD） 雜交瘤細胞的Fab 16fPSA, fhK2, thK2 重組的Fab 17克倫特羅-激動劑 雜交瘤細胞的單鏈抗體可變區(qū)域片段 18伏馬菌素B1 雜交瘤細胞的單鏈抗體可變區(qū)域片段 19甲胺磷 小鼠的單鏈抗體可變區(qū)域片段 20軟骨藻酸 羊的單鏈抗體可變區(qū)域片段 21fPSA（自由的前列腺特異性抗原）；fhK2(自由的人體激肽釋放酶2)；thK2(總的人體激肽釋放酶)表1. 用于免疫分析的重組抗體這些抗體片段有三個主要的有點：（1） 它們的體積比

7、較小，因此更容易操縱基因并在細菌體內(nèi)表達。（2） 它們可以被表達并作為融合蛋白在噬菌體表面被（3） 顯示時，它們保留親和選擇的功能。 天然抗體 重組抗體片段 圖1. 傳統(tǒng)的抗體分子的結(jié)構(gòu)及其不同的重組形式10 因此，就生產(chǎn)方面來說，rAbs為傳統(tǒng)的mAbs或pAbs提供了優(yōu)勢，增加了保留選擇性和多功能性的優(yōu)點。從大噬菌體體內(nèi)提取生產(chǎn)和選擇抗體片段已成為一個常用生產(chǎn)特定的Abs的方法。當Abs被用來抵抗小的，無免疫原性的分子（半抗原）或劇毒物質(zhì)時，這種技術(shù)就特別的有價值。此外，半抗原經(jīng)常結(jié)合蛋白質(zhì)載體一起承擔自由半抗原不被檢出的風險。Pan等18利用噬菌體顯示技術(shù)來生產(chǎn)直接抵抗-受體（克倫特羅）

8、的單鏈抗體。噬菌體的單鏈抗體可變區(qū)基因片段（scFv）通過卵清蛋白鏈的結(jié)合而放大。在酶聯(lián)反應(yīng)中，scFv和mAb母鏈（IC50為1.34±0.006ng/mL(n=4)）相比呈現(xiàn)出了比較高的靈敏度（IC50為0.78±0.005ng/mL(n=4)）。勞爾等19生產(chǎn)了單鏈抗體用于抵抗高毒性的霉菌毒素伏馬菌素B1，并把半抗原通過一個連接器與生物素耦合。利用這種共軛和單鏈抗體庫，它可能需要免疫并偽裝成半抗原。肖等21描述了rAbs抵抗貝類毒素和軟骨藻酸的過程，用羊的免疫系統(tǒng)作為一種生產(chǎn)高親和力的抗半抗原rAb片段的方法。此外，植物和作物品種可以生產(chǎn)廉價和有效的Abs22。對于實

9、際樣品的測定，通過有機共溶劑在水溶液中溶解疏水分析物來形成Abs的變性作用是一個比較困難的問題，Abs可以結(jié)合具體的目標分子，因此，設(shè)計和合成仿生的Abs是一個長遠的目標。在過去的幾年中，在免疫分析中分子印跡聚合物（MIPs）替代Abs已引起了關(guān)注（例如，結(jié)合實驗，生物傳傳感器和固相免疫物質(zhì)23擁有選擇性，易于生產(chǎn)，低價格和較好的物理和化學的穩(wěn)定性）。對于免疫分析來說，表2列出了在免疫分析中用MIPS代替Abs。雖然據(jù)報道在15年前24MIPs就用來替代Abs，但是目前還沒有以MIP為基礎(chǔ)的檢測，部分原因可能是MIPs和許多現(xiàn)代化的IA的兼容性仍需要證明28。分析物 MIP聚合物的配制 免疫形

10、式 參考文獻阿特拉津 MAA+EGDMA+AMVN 競爭 25腎上腺素 APBA+（NH4）2S2O8 競爭 26熒光素和二氯苯氧基乙酸 4-VP+TRIM+DPAP 競爭 27二氯苯氧基乙酸 4-VP+TRIM+AIBN 競爭 28,2二氯苯氧基乙酸 4-VP+EGDMA 29谷氨酸 被處理的硅烷氧化鋁膜所修飾的醛基（納米線） 30MAA（甲基丙酸烯）；EGDMA（乙二醇二甲基）；APBA(3-氨基酸)；AMVN（2,2-偶氮雙(2,4-偶氮二異庚腈)）4-VP（4-乙烯基吡啶）；TRIM（三羥甲基丙烷 三甲基冰乙酸酯）；DPAP（2,2-二甲氧基-2-苯基）；AIBN（2,2-偶氮雙-異丁

11、腈）表2 在化學發(fā)光免疫分析中用分子印跡聚合物（MIP）取代抗體的報告3. 標記物反應(yīng)生成的發(fā)光試劑可以附著在Abs或抗原（Ags）上并作為免疫反應(yīng)的標記物。自從1976年首次報告了發(fā)光標記物，由于發(fā)光標記系統(tǒng)的檢測限32很低，所以研究這類系統(tǒng)需要相當大的努力。在CLIA方法的應(yīng)用和發(fā)展中魯米諾、異魯米諾及其衍生物、吖啶酯、辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）經(jīng)常被用來作為CLIA的標記物。因為發(fā)光的檢測方法有非常低的檢測限，全新的發(fā)光標記物及其衍生物和新的標記技術(shù)已經(jīng)取得了驚人的研究成果。在本節(jié)中，我們根據(jù)近幾年的研究把發(fā)光標記物分為兩類并重新探討它們。在反應(yīng)中，一類標記物被消耗掉

12、，其它的標記物沒有被消耗而是以光的形式釋放出來。3.1被消耗的標記物 這種標記物在發(fā)光反應(yīng)中被消耗掉（如魯米諾衍生物，吖啶酯和納米顆粒）。 魯米諾是最有名的和最有效的發(fā)光試劑之一，它是通過和氨基的反應(yīng)形成耦合配體。然而，由此產(chǎn)生的共軛效應(yīng)比母體混合物的發(fā)光效率低。用魯米諾作為標記物取得了較大的成功。 當芳香吖啶酯類化合物在發(fā)光反應(yīng)中被過氧化氫氧化時，Abs和銀的衍生物就能以高靈敏度被檢測出來。這類標記物的性能和魯米諾相似，因此一直努力去評估適合耦合和選擇氧化試劑（用來提供最低的檢測限）的魯米諾或吖啶酯衍生物在發(fā)光反應(yīng)中的效果。陳等33合成了一個新的雙吖啶化合物10，10-二甲基-3，3-二磺酸

13、-9，9-雙吖啶作為發(fā)光標記物并建立一個夾層的CLIA方法，該方法用于測定人體血清中的癌胎抗原（CEA），校準范圍為1.0-100ng/mL和CEA的最小檢出濃度為0.53ng/mL.當BMDSBA接觸反CEA抗體時，在免疫反應(yīng)中的標記物CEA和DMDSBA的量子效率都沒有明顯變化。當BMDSBA接觸反CEA抗體時，在免疫反應(yīng)中被標記的反CEA抗體和DMDSBA的效率都沒有明顯的改變。被標記的平均比例為1.25。Scorilas等34合成了兩個新的生物素吖啶衍生物，9-（2-生物素-乙氧基）-羧酸鹽-10-甲基吖啶三氟（BOCMAT）和9-（2-生物素-己醇胺）-羧酸-10-甲基吖啶三氟（BA

14、CMAT），并描述了它們的發(fā)光性能和IA方法的應(yīng)用。在極性非質(zhì)子溶劑中，這種新的試劑的CL效率很高，它的檢測限下降到了7.28×108mol/L。這種新的化合物被用來檢測老鼠體內(nèi)的免疫球蛋白lgG。然而，這些作為標記物發(fā)光試劑的檢測方法的靈敏度和穩(wěn)定性是不理想的35。最近，用納米粒子（尤其是金屬納米粒子）作為生物標記物的方法已經(jīng)吸引了人們的廣大關(guān)注。納米粒子作為生物標記物呈現(xiàn)出很多的優(yōu)點36-38。首先，很多在納米尺寸里有獨特性能的納米結(jié)構(gòu)都很容易準備，因此，它們在生物技術(shù)系統(tǒng)中的應(yīng)用已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。其次，納米粒子比較適合在生物系統(tǒng)中共軛，因為它們有很好的生物相容性并對于許

15、多微生物分子都有類似的尺寸范圍。近年來，很多不同的納米粒子在CLIAs方法中作標記物用于檢測分析。表339-47顯示了作為標記物的不同種類的納米粒子和在IA檢測系統(tǒng)中相應(yīng)的發(fā)光試劑。當用Au納米粒子作為發(fā)光標記物時，這個系統(tǒng)經(jīng)常會以敏感的Au3+催化魯米諾的化學反應(yīng)39，41，43，47為基礎(chǔ)。Au3+是是金粒子束縛于抗體或Ag的溶解產(chǎn)品，它用于發(fā)光反應(yīng)中的間接測量抗體或Ag。分析物 納米粒子 分析形式 檢測系統(tǒng) 檢測限 文獻hlgG 金 夾心模式 AuCl4-Luminol-H2O2 1.5ng/mL 39,43 3.1×10-12MDNA 銀 夾心模式 Ag+Mn2+K2S2O8

16、H3PO4Luminol 5fM 40胸膜肺炎放線 金 間接測量 AuCl4-HClNaClBr2Luminol 41桿菌毒素抗體 mlgG 金-汞 間接夾心 CCD 0.1ug/mL 42hlgG 金-汞 夾心模式 Ag+K2S2O8Mn2+H3PO4Luminol 0.005ng/mL 44DNA, hlgG 不規(guī)則的金 夾心模式 AuLuminolH2O2 13pmol/L(DNA) 45人體前清蛋白 CdSe ECL(CdSeK2S2O8) 1.0×10-11g/mol 46（PAB）DNA 金 夾心模式 AuCl4-LuminolH2O2 0.1pM 47表3.在化學發(fā)光免

17、疫分析中用納米粒子（NPS）作為標記物的報告在一個IA模式中，李等39探討了金粒子作為發(fā)光標記物檢測人體內(nèi)的免疫球蛋白lgG、羊-抗-人的lgG和兔-抗-山羊的lgG。人類的lgG首次被用于在Ag中固定成固定相。之后Ag會用于捕獲羊-抗-人的lgG抗體，這類抗體會接著捕捉用Au粒子標記的兔-抗-山羊抗體。Au粒子被固相吸收后會溶解在Aucl4-中，在發(fā)光反應(yīng)中，Aucl4-對魯米諾-H2O2有強烈的催化效果。Aucl4-魯米諾-H2O2的發(fā)光信號被測量并用于檢測免疫反應(yīng)中山羊-反-人的lgG。它的發(fā)光強度是和山羊-抗-人的lgG的濃度對數(shù)成正比的（在0.005-10lg/mL，最低檢測限為1.

18、5ng/mL）。從分析化學的角度看，這種反應(yīng)在許多IA和DNA的雜交的應(yīng)用中是相當有前景的43。兩年后，李等47開發(fā)了一個以相同的夾心模型和Au為標記物為基礎(chǔ)的用于DNA雜交的CLIA的方法。Au粒子被烷基硫醇寡核苷酸鏈改性用來作為探針來監(jiān)測具體的目標DNA的存在。Aucl4-是Au粒子錨定DNA雜交的溶解產(chǎn)物，在H2O2-魯米諾-AuCl4-發(fā)光反應(yīng)中，它用來分析間接測量的目標DNA。包含大量從每個雜交DNA釋放出來的AuCl4-的發(fā)光分析有卓越的靈敏度，并且它的允許檢測限可低至目標DNA的0.1pM。韓等41報道了以金離子增強魯米諾的發(fā)光反應(yīng)的CLIA方法用來檢測胸膜肺炎放線桿菌（APP）

19、的ApxIV抗體。純化的重組ApxIV蛋白質(zhì)被吸收在聚苯乙烯的表面。血清樣品中的重組ApxIv蛋白捕獲，接著被共軛的金粒子-兔-抗豬的lgG夾在中間。接著，未被綁定的共軛金粒子-兔-抗豬的lgG被消除。在一個HCl-NaCl-Br2氧化反應(yīng)中，在聚苯乙烯表面錨定的金粒子釋放出大量的AuCl4-，然后，由一個簡單的、敏感的AuCl4增強魯米諾發(fā)光反應(yīng)來定量。在最佳條件下，獲得發(fā)光光子計數(shù)和血清稀釋系數(shù)之間的良好相關(guān)性，血清稀釋的范圍為1：160-1：40000。在比較間接血凝試驗（IHA）和ELISA時，CLIA方法比較可靠和實用。王等45合成了形狀特殊、不規(guī)則的金粒子并發(fā)現(xiàn)它們在魯米諾發(fā)光反應(yīng)

20、的催化效率是球形金粒子催化魯米諾發(fā)光效率的100倍。使用不規(guī)則的金粒子官能DNA低聚物和不規(guī)則的金粒子改性抗-lgG作為原位發(fā)光探針，建立一個夾心型分析方法，這類探針用來快速、簡單、選擇性和敏感的檢測DNA特定序列和檢測發(fā)光反應(yīng)中人類的血漿lgG。金屬發(fā)光免疫學還開發(fā)了用銀粒子標記來超靈敏的檢測雜交DNA40或用銀沉淀標記膠體金用于敏感的檢測hIlG44。銀納米粒子在硝酸中被溶解成Ag+，接著被一個聯(lián)合的化學發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)（Ag+-Mn2+-K2S2O8-H3PO4）靈敏的檢測。這種靈敏的發(fā)光方法結(jié)合這大量的從每個雜交生物體中釋放的Ag+,這種發(fā)光方法允許特定序列DNA的檢測水平是5fM，人體內(nèi)

21、的lgG的檢測限是0.005ng/mL。高熒光量子點（量子點）已經(jīng)受到了極大的關(guān)注。大小可調(diào)的窄的發(fā)射光譜已經(jīng)被廣泛應(yīng)用與生物發(fā)光應(yīng)標記中48,49。Jie等46描述了一種電化學發(fā)光（ECL）免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)是以CdSe量子點為基礎(chǔ)測量人體內(nèi)的前清蛋白（PAB）。ECL的檢測原理（如圖2）是由CdSe量子點和K2S2O8產(chǎn)生的ECL反應(yīng)抑制了免疫復合物，這個過程降低了ECL反應(yīng)的強度。PAB的濃度范圍在5.0×10-10-1.0×10-6，檢測限為1.0×10-11。圖2.納米粒子的電化學機制463.2沒有被消耗的標記物 這類發(fā)光標記物不被消耗但是可以催化光的產(chǎn)

22、生。它主要包括酶標記物例如，堿性磷酸酶（AP）50，b-D-半乳糖甘酶和辣根過氧化物酶（HRP）51。這些標記物需要適合的基質(zhì)。為了獲得一個低的檢測限，高度敏感的發(fā)光檢測系統(tǒng)已經(jīng)可以用于檢測CLIA標記物。HPR是一個比較常用的標記物，這中用于檢測HPRs的快速、敏感的方法在幾個化學發(fā)光系統(tǒng)中都是可行的。HPR有一個陽離子同工酶-c（HRP-C），它是辣根純化的過氧化物酶。它催化由一個氫受體（氧化劑）（例如，過氧化氫或過氧化脲）和氫供體之間的熒光反應(yīng)，包括發(fā)光基質(zhì)（例如，魯米諾）。這一反應(yīng)可以在近分鐘之后迅速消失。但是它的敏感性和發(fā)光平臺限制了CLIA的應(yīng)用，因此有很多關(guān)于促進劑和穩(wěn)定添加劑的

23、研究，這些研究是為了提供CLIA反應(yīng)的強度和延長并穩(wěn)定它的發(fā)光時間。4-碘苯酚（PIP）52是最著名的HRP催化魯米諾氧化發(fā)光的增強劑。 對于魯米諾-H2O2-HRP系統(tǒng)，羅等53描述了苯基片段和四苯硼鈉的協(xié)同反應(yīng)，這種反應(yīng)能提高系統(tǒng)的靈敏度。此外，大量取代酚的物質(zhì)如，螢火蟲的熒光素，6-羥基苯并噻唑衍生物和取代苯硼酸衍生物（如，4-碘苯硼酸或更復雜的）已經(jīng)被用為增強魯米諾信號的增強劑54。 Dotsikas54，55等發(fā)展并比較了幾種不同的魯米諾信號增強劑即4-甲氧基苯酚（4-MEP），4-（1-咪唑基）苯酚（4-IMP），4-碘苯酚（4-IOP），4-羥基聯(lián)苯（4-BIP），4-（1H-吡

24、咯-1-基）苯酚（4-PYP）用于一個實驗中檢測芬太尼的發(fā)光異構(gòu)酶免疫分析。結(jié)果表明，每個苯酚增強劑的化學發(fā)光強度，檢測限和發(fā)光動力學的輪廓相對于不同的取代基是不同的。這可能是由于取代物質(zhì)的電子屬性（即共振效果的強度）對激發(fā)的穩(wěn)定度有著至關(guān)重要的作用，因此它對化學發(fā)光強度的提高也起著關(guān)鍵的作用。此外，電子基團對OH鍵理解能有著相似的作用（減少），因此使芬氧自由基56，57得到穩(wěn)定。芬氧自由基可以影響魯米諾的化學發(fā)光強度。另一方面，從不同植物體內(nèi)分離出來的陰離子過氧化物酶例如，非洲油棕櫚樹的葉子（AOPTP）58，大豆的皮（SbP）59，60已經(jīng)被研究。結(jié)果表明，陰離子過氧化物酶可以在沒有任何增

25、強劑的情況下可以有效的催化魯米諾-過氧化氫的化學發(fā)光。此外，這種過氧化物酶可以使魯米諾氧化形成一個長期的化學發(fā)光信號。因此，這一事實讓我們期待著不使用增強劑和穩(wěn)定添加劑就可以產(chǎn)生高度敏感的化學發(fā)光免疫試劑盒的新進展。4. 固相物質(zhì)常用的固相物質(zhì)是用聚苯乙烯準備形成的96-微量點滴板。由于免疫分析的目的，微孔板被捕獲蛋白61-63預涂就像抗體被固定待測一樣。然而，在塑料表面直接的吸附Abs可能對實驗的表現(xiàn)產(chǎn)生不利的影響，例如重現(xiàn)性、靈敏度和成本等。趙等64開發(fā)了兩種不同的以生物素-親和素系統(tǒng)和熒光素異硫氰酸鹽（FITC）-抗-FITC系統(tǒng)為基礎(chǔ)的固相，用于檢測尿清蛋白。親和素或抗-FITC抗體被

26、涂在微孔板上，為了提供一個普遍的能夠改進變異性和敏感性的固相。對于兩相間的線性范圍和白蛋白的檢測限是0.15-15ug/mL和0.089ug/mL。隨后，林等65，66使用FITC-抗FITC系統(tǒng)作為固相和生物素-鏈親和素系統(tǒng)作為信號放大系統(tǒng)來發(fā)展一個高度敏感的CLIA方法，這個方法可以檢測17-雌二醇（E2）和人體甲狀腺激素（hTSH），它的檢出限分別為1.5pg/mL和0.01mU/L。 磁性微球有很多超過固相微孔板的優(yōu)點。例如，微球可以提供一個比較大的面積，它允許使用高濃度的捕獲Abs，它可以增強檢測的靈敏度；抗體-涂層微球是自由懸浮在含銀的環(huán)境中并更快速的反應(yīng)速率的效果，同時減少了混合

27、攪拌的時間。包含銀抗體復合物的微球的分離比較容易并能在一個簡單的磁場內(nèi)快速的反應(yīng)；免疫磁性微球能夠從大量的、稀有的樣品中捕捉少量的分析物。因此，當磁性微球被收集時，分析物的總量就可以有效的被集中。表4列出了在CLIA中用作固相的磁性粒子。林等68-72使用磁珠作為第二抗體分離劑和第一抗體固體表面來發(fā)展高靈敏度的化學發(fā)光免疫分析方法用來高效、特異、快速和可重復性的檢測人體內(nèi)的雌三醇（E3）、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖類抗原50（CA50）。趙等73-75開發(fā)了一個通過連接微孔板和磁珠作為固相來檢測人體血清和唾液中的絨毛膜促性腺激素（HCG）的微型磁鋼板化學發(fā)光免疫酶。對于環(huán)境樣品

28、中的17-雌二醇，他們用自己設(shè)計的微型鋼板磁選機，這個機器可以不用對樣品進行預先處理就可以實現(xiàn)高通量分析。淡水和海洋沉淀物中可以分理處磁性細菌并且可以產(chǎn)生磁性微粒77，78。許多研究已經(jīng)研究了這些磁性粒子的功能和體內(nèi)導航羅盤的機制。細菌的磁性粒子（BMPs）的體積非常?。?0-100nm）并且分散性非常好，因為它們被一個穩(wěn)定的脂質(zhì)膜覆蓋。用雙功能的試劑和戊二醛把酶和抗體固定到細菌磁性粒子上比把它們固定到人工磁性粒子上來說有比較多的運動。松永等79-81開發(fā)了一個使用固定在BMPs上的抗體來測定小鼠免疫球蛋白G（lgG）、E2、烷基酚聚氧乙烯醚（APES）、雙酚A（BPA）和水中的直鏈烷基苯磺酸

29、鹽（LASS）來對化學發(fā)光進行環(huán)境影響評價。為了避免通過共價化學交聯(lián)把抗體固定到BMP上的需要，從轉(zhuǎn)化結(jié)合子AMB-1中產(chǎn)生的A-BMP蛋白復合物可以被A蛋白質(zhì)的Z區(qū)域和來自抗體蛋白A-BMP復合物85的免疫球蛋白的Fc部分復雜化。這類復合物有好的分散性因此在免疫分析中能夠產(chǎn)生高效的信號和低噪音。陸等86介紹了聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIP）和作為雙分子固定運輸?shù)拇胖?，這些磁珠可以通過把抗體固定到磁珠和PNIP的表面，從而利用非競爭ELISA的熱反應(yīng)的優(yōu)點來分離不同的目標物質(zhì)。此外，高靈敏度的HRP發(fā)光檢測已經(jīng)被應(yīng)用，并且它的lgG和lgA的檢測限可以低至2.0和1.5ng/mL。分析物

30、固相 化學發(fā)光系統(tǒng) 檢測限 文獻E3 磁性粒子 (MPs) 0.6 ng/mL 68AFP 磁性粒子 ALPAMPPD 3.0 ng/mL 70CEA 磁性粒子 ALPAMPPD 0.69 ng/mL 71CA50 磁性粒子 ALPAMPPD 1.0 U/mL 72HCG 磁性粒子 ALPAMPPD 0.15 mIU/mL 73E2 磁性粒子 ALPAMPPD 5.4 pg/mL 74mIgG 小鼠骨形成蛋白 魯米諾-磷酸鹽 530ALP 1 fg/mL 79E2, APEs, 小鼠骨形成蛋白 魯米諾-磷酸鹽 530ALP 20 ppt, 6.6 ppb,BPA, LASs 2.3 ppt,

31、35 ppt 80,81LAS, 烷基酚 磁珠 魯米諾過氧化氫HRPPIP25 ppb, 10 ppb, 2 ng/mL 8284聚氧乙烯醚 (APnEOs),卵黃蛋白原 (Vg)胰島素 A-BMP蛋白復合物 魯米諾-磷酸鹽 530ALP 2 uU/mL 82表4. 化學發(fā)光免疫分析（CLIA）中作為固相的磁性粒子的發(fā)展5. 與其它技術(shù)的結(jié)合5.1 流動注射化學發(fā)光分析擁有流動注射分析（FIA）和免疫分析的所有優(yōu)點，即高靈敏度、高準確度、高速度和高選擇性53。由于這種技術(shù)消耗比較少的樣品、減少了樣品的處理、可重用性、較好的重現(xiàn)性、比較短的時間和易于采樣的自動化等優(yōu)點，它已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測

32、、食品安全、藥物分析和臨床診斷87-89等領(lǐng)域中。這種技術(shù)可以在同構(gòu)和異構(gòu)系統(tǒng)中進行。在異構(gòu)的流動注射免疫分析中，在銀抗體復合物的形成過程中可以產(chǎn)生信號。異構(gòu)檢測比較適合于流動注射免疫分析（FIIA），因為它的分離步驟可以在FIIA系統(tǒng)90中在線執(zhí)行。分離步驟在固定床反應(yīng)器中進行。因此，選擇一個合適的、穩(wěn)固支持的反應(yīng)器是比較重要的。最常用支持物質(zhì)包括珠材料、瓊脂、瓊脂糖凝膠、聚苯乙烯和磁性粒子或膜。異構(gòu)FIIA系統(tǒng)支持一個多通道的蠕動泵、注射閥、免疫反應(yīng)柱和檢測器。圖3顯示的是在交聯(lián)殼聚糖膜91上固定的CA19-9為基礎(chǔ)的碳水化合物銀19-9（CA19-9）的流動注射化學發(fā)光免疫分析器。經(jīng)過分

33、析物CA19-9和被抗CA19-9標記的HRP的脫線孵化，混合物被注射到免疫反應(yīng)器中，這可以引起在免疫分析器中捕獲自由的被抗-CA19-9（通過銀的固定）標記的HRP。由于魯米諾和過氧化氫的催化反應(yīng)，被標記的HRP抗體可以被化學發(fā)光分析方法檢測到。在最佳條件下，免疫分析器的化學發(fā)光信號是與CA19-9的濃度（濃度范圍是2.0-25U/mL，檢測限是1.0U/mL）成正比的。采用相同的CLIA流動注射方法，由環(huán)氧烷修改的玻璃微珠、瓊脂糖凝膠93和羧酸樹脂94組成不同類別的免疫反應(yīng)器被應(yīng)用于臨床分析物的檢測。圖3. 非競爭性流動注射化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)：P，蠕動泵；V，八通閥；IMS，免疫器；PM

34、T，光電倍增管；D，檢測器91。圖4. 磁珠的順序噴射系統(tǒng)Ruzicka和Marshall95介紹了FIA的新變化即順序注射分析（SIA），它已經(jīng)被應(yīng)用與CLIA96中。與FIA不同，SIA包含一個多位置連接的凸輪驅(qū)動的正弦流量柱塞泵，利用這個泵，物質(zhì)可以按順序被吸入單一的反應(yīng)通道。Imato等97，98開發(fā)了以磁性微球的SIA為基礎(chǔ)的一種快速、靈敏的免疫分析方法，用于檢測直鏈烷基苯磺酸鹽（LASS）和烷基酚聚氧基（APnEOs）（如圖4）。流動池的磁珠的控制、捕獲和釋放都是通過釹磁鐵的控制和調(diào)整載體溶液的流動來實現(xiàn)的。這類免疫分析是由一個在磁珠上的抗-LAS（或抗APnEO）單克隆抗體和LA

35、S（或APnEO）樣品和被LAS（或APnEO）標記的HRP引導的一個間接競爭免疫分析為基礎(chǔ)的，隨后，又以在魯米諾反應(yīng)中HRP與過氧化氫和-碘苯酚產(chǎn)生的發(fā)光反應(yīng)為基礎(chǔ)的。在最佳條件下，進行分析的時間不少于15分鐘。5.2 毛細管電泳法 毛細管電泳免疫分析（CEIA）結(jié)合了CE的有效分離能力和IA的配體特異性，這種分析方法被證明是一個強大的生物化合物99的分離和分析的技術(shù)。與傳統(tǒng)的免疫分析技術(shù)相比，CEIA擁有高效率、少的樣本、分析時間短和易于自動化的優(yōu)點。它已成功的用于檢測某些腫瘤標記物、激素和濫用的藥物例如，人體生長激素（hGH）、胰島素、嗎啡、皮質(zhì)醇和地高辛100，101。 在過去的十年里

36、，CE與CL的結(jié)合研究已經(jīng)取得了較快的進展，這種結(jié)合技術(shù)擁有靈敏度高、操作簡便和試劑102廉價、易于制備的優(yōu)點。人們已經(jīng)資助了它在CEIA中的應(yīng)用。Tsukagoshi等103證明了在CE方法中，利用小鼠的免疫球蛋白和被抗-鼠免疫球袋白抗體標記的HRP在一個新設(shè)計的間歇式免疫反應(yīng)檢測細胞的CEIA實驗。王等104以增強化學發(fā)光檢測為基礎(chǔ)，利用CEIA的非競爭模式成功檢測出在大鼠血管平滑肌細胞（VSM）中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）。HRP-Ab2-mAb-BMP-2復合體和自由的HRP被基線分離，HRP在檢測限為4.4×10-12mol/L(53zmol)被檢測出來，BMP-2

37、在檢測限為6.2×10-12（75zmol）時被檢測出。吉等105開發(fā)了一個血清數(shù)量有限的情況下，以被CLB標記的HRP和自由的CLB之間的競爭反應(yīng)為基礎(chǔ)的用免疫分析檢測CLB的CEIA方法。在最佳條件下，CLB-HRP示蹤體和免疫分析復合體被分離，分離時的線性范圍和CLB的檢測限是5.0-40nmol/L和1.2nmol/L。以CL為基礎(chǔ)的CEIA成功的應(yīng)用于檢測腫瘤抗原CA125106、乙肝表面抗原（HBsAg）和人類血清中的抗體（HBsAb）107。5.3 芯片毛細管電泳法利用芯片毛細管電泳法作為光檢測（LIF和CL）的分離方法為基礎(chǔ)的微型免疫分析方法已經(jīng)被報道108-110，

38、它具有重現(xiàn)性好和反應(yīng)時間短等優(yōu)點。然而，被熒光燃料標記的抗體在毛細管電泳中被觀察，由于抗體本身具有電荷異質(zhì)性111，這種性質(zhì)減少了信噪比的檢測限。Tsukagoshi等112開發(fā)了一個微型全分析系統(tǒng)（l-TAS），把這個系統(tǒng)納入用于腫瘤標志物的化學發(fā)光檢測。分析系統(tǒng)在一個芯片上進行了以下三個過程：高選擇性的免疫反應(yīng)，用于樣品插入的形成和運輸?shù)幕瘜W發(fā)光檢測，高靈敏度的化學發(fā)光檢測。這三個過程都是在芯片上進行的，圖5顯示了l-TAS系統(tǒng)。這個微芯片包含兩個微通道，這兩個通道在一個路口橫過，并以四個聚水池的微通道結(jié)束。在第一個過程中，免疫反應(yīng)利用抗體固定的玻璃珠。在一個聚水池中，這個玻璃珠和銀（分析

39、）和一個已知量的用銀標記的ILITC一起建立了一個競爭激烈的免疫反應(yīng)。電泳分離法是第二個反應(yīng)過程，在樣品塞中產(chǎn)生交集的電泳可以提供免疫反應(yīng)的反應(yīng)物。然后，這個樣品被移動到另一個含有雙氧水的水庫。此時，化學發(fā)光檢測作為第三過程：被標記的銀混合著過氧化氫和在遷移緩沖區(qū)的催化劑反應(yīng)產(chǎn)生化學發(fā)光。CL被蓄水池下面的一個光電倍增管檢測。這里描述的L-TAS是能夠確定的、具有高選擇性和高靈敏度的技術(shù)，人體血清蛋白或免疫抑制酸性蛋白作為人體血清中的腫瘤標志物。圖5. 結(jié)合免疫法和化學發(fā)光檢測的全微分分析系統(tǒng)112Emneus等113使用硅微芯片作為一個模型，把它納入一個微酶IAs中，以涂有硅的抗體微芯片為基

40、礎(chǔ)并利用HRP標記物的增強的FI-CL檢測來分析魯米諾-過氧化氫-p-碘苯酚反應(yīng)。如圖6顯示，多克隆Abs被連接在硅微芯片的表面，它的檢測原理是以一個直接競爭的異構(gòu)模式為基礎(chǔ)，在這個模式中分析物和酶標記的阿特拉津（示蹤劑）為了固定的抗體結(jié)合位點而競爭，通過示蹤劑的分離和檢測，直接在芯片上形成化學發(fā)光信號。圖6. （a）微流控酶免疫法。注射泵和蠕動泵分別用于載波緩沖區(qū)和再生緩沖區(qū)。 在一個六口噴射閥進樣。光電倍增管置在流動的細胞上，細胞上包含固定抗體的硅芯片，發(fā)光時的化學發(fā)光信號被光電倍增管測量。（b）有機玻璃芯片流通池。（c）微芯片旁邊有一把尺子和一個用于放大圖片的平行網(wǎng)絡(luò)渠道。5.4 連接技

41、術(shù)的挑戰(zhàn) 各種IA技術(shù)的發(fā)展是由生物、環(huán)境、臨床或醫(yī)學領(lǐng)域的需要而推進的。顯然，生物樣品（例如，唾液、血漿、人血清、腦脊髓液和活檢標本）包含著重要疾病的生物學標志物或一個復雜的樣品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，其中每分鐘內(nèi)Ag的濃度和動態(tài)都必須考慮進去。目前用于檢測臨床或環(huán)境中重要的Ags的新興技術(shù)有非常好的檢測限，這個檢測限接近一個阿莫爾水平并且能夠同時確定多個分析物。而且它還顯著朝著微型化、自動化、成本效益和多重分析的趨勢發(fā)展。因此，微流體IA設(shè)備具有高表面積比和nL容量的優(yōu)點。然而，由于CLIA里面有一個微通道，在這里的Ags和Abs被電動或壓力驅(qū)動流驅(qū)動進行交付，因此芯片-CE-CLIA技術(shù)已經(jīng)受到

42、限制。被驅(qū)動的泵、閥和混合器是目前的主要進步。這并不奇怪，因為它使流體控制能夠較容易的消除其它宏觀的運動成分的影響，最終實現(xiàn)成本效益的微芯片?，F(xiàn)在，微流體IA芯片的制作正在迅速邁向一個簡單的，便攜式的點-醫(yī)療診斷設(shè)備，這個設(shè)備通過各種各樣的趨勢實現(xiàn)，如使用高分子材料、被動的流體控制和芯片的檢測點等。此外，磁微粒和納米粒子的組合被證明是一個比較適合的組合，它不僅有信號增強的功能，還緩解了流體操作中磁場的存在，尤其是在微流體IA中。6 展望在分析化學中的顯著趨勢已經(jīng)朝著微型化，靈敏度和多重分析的提高而發(fā)展?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了小型化的CL反應(yīng)器、高密度的反應(yīng)管和以分析儀為基礎(chǔ)的微芯片，這些都需要極少的樣

43、品和試劑114。隨著以微陣列為基礎(chǔ)的分析設(shè)備的可用，高檢測性和快速的CL技術(shù)使高吞吐量的篩選實驗得到發(fā)展，在這同時，在混合樣品中的多個分析物都可以被檢測出來。分析靈敏度的改善將有可能發(fā)現(xiàn)環(huán)境污染或疾病檢測中新的分析物。通過使用NPs作為標記物和CL檢測方法39-47，技術(shù)的提高能夠保證在血清中的有極低的檢測濃度。寡核苷酸和NPs的結(jié)合有較特殊的發(fā)展。使用這些非常小的顆?？梢該碛幸粋€高的靈敏度。張等115使用Au和CuS作為標記物和CL檢測方法用于DNA的檢測，這種方法的靈敏度比其它方法高6倍。使用這個免疫NP檢測能夠檢測出在10uL被檢測液中的18-20個 -甲胎蛋白分子，比傳統(tǒng)的IA116高

44、6-log倍。 多重分析可以同時測量許多被分組的分析物。基于傳統(tǒng)的CLIA程序，在微芯片上的多因素分析已經(jīng)被用來檢測多分析物。在這個分析技術(shù)中，不同的半抗原或Abs被固定在玻璃表面的不同領(lǐng)域。通過光輸出空間格局的分析和測量來自電荷耦合器件（CCD）的成像來檢測不同的分析物117。最近研究出了平行的親和力傳感器檢測技術(shù)（PASA），這種技術(shù)是利用自動的芯片-多分析物免疫分析方法，這個方法擁有間接競爭的ELISA模式和被一個電荷耦合攝像機（CCD）監(jiān)視的CL反應(yīng)，這個方法能夠同時檢測牛奶中的抗生素118并通過使用小型化的微芯片制造技術(shù)，使兼并CL檢測功能的CE分離系統(tǒng)得到發(fā)展。致謝我們感謝來自中國

45、科學院重大科研和發(fā)展項目（YZ-0632），國家重點技術(shù)研發(fā)項目（2006BAF07B03-1-1）和中科院研究生創(chuàng)新基金（No.YXLW3）的財政支持。參考文獻1 S.A. Berson, R.S. Yalow, Nature (London) 184(1959) 1648.2 I. Suruglu, J. Svitel, L. Ye, K.Haupt, B. Danielsson, Anal. Chem. 73 (2001) 4388.3 Z.P. Li, Y.C. Wang, C.H. Liu, Y.K. Li, Anal. Chim. Acta 551 (2005) 85.4 C.A.

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