CpG寡核苷酸免疫刺激DNA序列的構(gòu)效關(guān)系分析及其抗腫瘤作用研究

1、CpG寡核苷酸免疫刺激DNA序列的構(gòu)效關(guān)系分析及其抗腫瘤作用研究作為免疫刺激序列 (immunostimulatory sequence，ISS) ，含有非甲基化 CpG 二核苷酸的寡脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotides ，ODN能直接激活B細(xì)胞、樹 突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞等；間接激活 T細(xì)胞、NK細(xì)胞；誘導(dǎo)以Th1 型為主的免疫應(yīng)答，是一種高效低毒的免疫佐劑。在腫瘤、免疫缺陷性疾病、感 染性疾病及過敏性疾病治療中有著強(qiáng)大的潛在應(yīng)用價值，CpGODN作為一種新型的免疫刺激劑越來越多地受到人們的關(guān)注。CpGODN的免疫刺激活性具有結(jié)構(gòu)特異性，其免疫刺激活性與結(jié)構(gòu)之間的

2、相 關(guān)關(guān)系仍有許多環(huán)節(jié)尚待闡明：游離的 5'端結(jié)構(gòu)是否免疫刺激活性所必需 ?回 文結(jié)構(gòu)的有無、多寡、堿基構(gòu)成特征及其在序列中的位置對活性有無影響 ?此外， CpG基序在序列中的數(shù)量、距離遠(yuǎn)近、空間連接、5'端的堿基組成對ISS免疫刺激活性的影響也均有待系統(tǒng)研究。CpG ODN勺免疫刺激作用具有種屬特異性， 我們選擇已知有效的小鼠特異性 I S S O D N 1 826為模板和陽性對照，設(shè)計了一 系列不同結(jié)構(gòu)的CpG ODNs采用多種生物學(xué)方法對所設(shè)計 CpG ODN的免疫活性 進(jìn)行檢測，并基于此進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系分析，總結(jié)一些能夠揭示CpGODN免疫刺激作用機(jī)制的新規(guī)律，并對新型

3、CpG ODN勺理性設(shè)計提供理論和實驗依據(jù)。研究中篩選出了若干條免疫刺激活性優(yōu)于陽性對照 ODN1826勺ISS，對這些 CpGODN在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性以及對荷瘤鼠免疫調(diào)節(jié)機(jī)能的影響進(jìn)行了系統(tǒng) 的分析。此外，對CpG OD免疫刺激活性的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究。一、以小鼠特異性的B型CpGODN182為模板和陽性對照，設(shè)計了 15條CpG ODNs(ODN1ODN5)涉及到CpG基序在序列中的數(shù)量、距離遠(yuǎn)近、空間連接，5'端的堿基組成， 回文結(jié)構(gòu)的有無、 回文結(jié)構(gòu)堿基構(gòu)成特征及其在序列中的位置等 結(jié)構(gòu)變化；所設(shè)計CpG ODN作用于小鼠脾細(xì)胞，以其對細(xì)胞因子IL-6、IL-12 及I

4、FNa等分泌的影響、對B細(xì)胞增殖活性、NK細(xì)胞殺傷活性的影響等為活性指 標(biāo)，系統(tǒng)分析CpG ODN的構(gòu)效關(guān)系。結(jié)果表明：1）最佳的CpG六堿基作用基序 是5' -TCGACGTT'與文獻(xiàn)報道一致；2）CpG島缺乏兩側(cè)翼的雙堿基將失去其 免疫調(diào)節(jié)作用，如ODN15 3）CpG基序的數(shù)目最佳為2個，增加六堿基CpG基序 數(shù)量（如ODN9不增加其免疫刺激活性；4）相鄰兩個CpG基序之間的最適距離為3 個堿基，距離的縮短（ODN5或延長（ODN6均會減弱CpGODN勺免疫刺激作用；5）5 ' 端TpC二堿基對于CpGODN勺免疫刺激活性很重要，去掉 5'端TpC二堿基會

5、使 免疫刺激活性明顯減弱，如 ODN、6 ODN；8 6）自身互補(bǔ)的回文結(jié)構(gòu)對于 CpG ODN 的免疫刺激作用很重要，如 ODN4 ODN7 ODN1僑口 ODN11 7）回文結(jié)構(gòu)在序列中 的位置對活性有顯著影響： 3'端回文結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)序列的免疫刺激活性，而 5' 端回文結(jié)構(gòu)可導(dǎo)致CpG OD免疫刺激活性幾乎消失，如 ODN3 ODN12值得注意的是，作為全回文結(jié)構(gòu)的ODN1具有較強(qiáng)的免疫刺激活性，其回文 結(jié)構(gòu)中包含完整的CpG作用基序5' -TCGACGTT'如果不包含完整的CpG作用 基序，僅以重復(fù)的CpG組成的自身互補(bǔ)的全回文結(jié)構(gòu)幾乎沒有免疫刺激活性，如

6、ODN15二、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同結(jié)構(gòu)的 CpGODNS寸特定的免疫細(xì)胞B細(xì)胞、 DC細(xì)胞以及NK細(xì)胞的激活功能。將所設(shè)計CpGODN與小鼠脾細(xì)胞共孵育，然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測 DC細(xì)胞、B 細(xì)胞以及NK細(xì)胞亞群表面分子表達(dá)情況，系統(tǒng)分析CpGOD結(jié)構(gòu)與其對各種免疫 細(xì)胞活化能力的關(guān)系。研究結(jié)果顯示與前述構(gòu)效關(guān)系分析結(jié)論一致。三、CpG ODN體外抗鼠源性黑色素瘤活性研究。結(jié)果表明，經(jīng) CpG0DN(0DN1-1處理的小鼠脾細(xì)胞對小鼠黑色素瘤均表現(xiàn)不同程度的殺傷活性， 不 含CpG島的ODN沒有腫瘤殺傷活性；0DN4 0DN7 0DN1僑口 0DN1的抗黑色素瘤 活性明顯高于陽性對照 0DN1

7、82組(P V 0.05)。四、在構(gòu)效關(guān)系分析以及體外抗鼠源性黑色素瘤活性研究的基礎(chǔ)上，選擇CpG0DN的有效序列(0DN1826 0DN4 0DN7 0DN1和0DN11進(jìn)行小鼠體內(nèi)外抗腫瘤活性研究。研究發(fā)現(xiàn)，CpG0DN能不同程度延長荷黑色素瘤小鼠的生存時間， 與陽性對照0DN182比較，0DN4 0DN和0DN1 均表現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制作用(P V0.05)，0DN10勺作用尤為明顯(P V0.01)，抑瘤率達(dá)到(55.2 ± 2.3) %。腫瘤組織切片HE染色顯示，CpG0DN用藥組可觀察到腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核空化、核水腫以及凋亡現(xiàn)象， 而核膜清晰可見， 這種現(xiàn)象在腫瘤病理中較少見

8、， 其機(jī)理尚待闡明；腫瘤組織免疫組化分析顯示，代表增殖活性的核抗原PCNAfe達(dá)降低，表明腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制；黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的抗原CD63表達(dá)降低，表明瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移受到抑制。脾臟組織切片 HE染色顯示，PBS組荷瘤鼠的脾臟出現(xiàn) 大面積壞死，梗死的脾血管內(nèi)可見壞死的腫瘤細(xì)胞團(tuán)，而CpGODN臺療組未見瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)病理切片顯示，PBS組荷瘤鼠的淋巴結(jié)中出現(xiàn)淋巴導(dǎo)管梗阻，內(nèi)可見 轉(zhuǎn)移的瘤細(xì)胞團(tuán)塊，而CpGODN臺療組未見瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果說明：CpG ODh不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，而且能夠抑制腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和 浸潤。五、CpG OD對荷瘤鼠模型體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機(jī)能的影響。

9、研究發(fā)現(xiàn)，C57 BL/6小鼠荷黑色素瘤后，血清中 IL-12 的含量顯著降低， IgE 的含量急劇上升，脾臟 中B細(xì)胞、T細(xì)胞的增殖活性以及NK細(xì)胞的殺傷活性均明顯下降，腹腔巨噬細(xì) 胞的吞噬功能也明顯減弱，提示腫瘤能夠促使免疫系統(tǒng)Th1/Th2平衡向TH2漂移， 使機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)大大減弱。而CpGODh能誘導(dǎo)荷瘤鼠產(chǎn)生大量的IL-12，抑制IgE的產(chǎn)生，脾臟中B細(xì) 胞、T細(xì)胞的增殖活性以及NK細(xì)胞的殺傷活性均顯著增強(qiáng)，巨噬細(xì)胞的吞噬功 能也顯著增強(qiáng)，并且，腫瘤抑制效應(yīng)越強(qiáng)CpGODN所具有的免疫增強(qiáng)效應(yīng)也越強(qiáng)， 這兩種效應(yīng)呈現(xiàn)正相關(guān)，這強(qiáng)烈提示 CpG ODNh夠促使Th2型免疫應(yīng)答向

10、Th1 型逆轉(zhuǎn)，扭轉(zhuǎn)因荷瘤導(dǎo)致的機(jī)體免疫功能低下， 從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)。 另外，CpGODh各組荷瘤鼠均出現(xiàn)不同程度的巨脾現(xiàn)象， 病理切片顯示，脾臟紅、 白髓邊界清晰， 可見脾竇輕度充血， 未見病理改變； 淋巴結(jié)的病理切片顯示， CpG ODN臺療組淋巴結(jié)中淋巴小結(jié)清晰可辨，淋巴細(xì)胞數(shù)量豐富，淋巴竇擴(kuò)張；治療 組腫瘤組織免疫組化分析顯示，腫瘤細(xì)胞表面共刺激分子CD80的表達(dá)增強(qiáng)，以上結(jié)果充分說明機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)增強(qiáng)。實驗數(shù)據(jù)顯示，ODN4 ODN和ODN1 的抗腫瘤免疫效應(yīng)均高于陽性對照 ODN1826(R 0.05)，而具有全回文結(jié)構(gòu)的 ODN10乍用尤為明顯(P V 0.01

11、)。六、 為進(jìn)一步探討CpGODNfe疫刺激活性的機(jī)理，檢測了不同結(jié)構(gòu)的CpGODN(ODN1826 ODN1昏口 ODN11對核轉(zhuǎn)錄因子NF-k B、AP1的轉(zhuǎn)錄活性影響，同時檢測了上述不 同結(jié)構(gòu)的CpG ODI與TLR9的結(jié)合活性。CpG OD通過TLR9介導(dǎo)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如 NF-k B AP1等，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫相關(guān)的多種細(xì)胞因子的表達(dá)，最終實現(xiàn)CpGODN勺免疫調(diào)節(jié)功能。EMSAK驗結(jié)果表明，不同結(jié)構(gòu)的CpGODN能不同程度地上 調(diào)NF-k B及API的轉(zhuǎn)錄活性，ODN1能誘導(dǎo)NF-k B的表達(dá)，但其作用低于ODN1826或ODN10但ODN1誘導(dǎo)AP1

12、的活性高于 ODN182或ODN10前面提到的ODN10 促使IL-12的高表達(dá)可能與其對AP1的高轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。TLR9是介導(dǎo)CpGODN實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)活性的重要受體，我們將ODN1820ODN1O 和ODN1進(jìn)行5'端生物素標(biāo)記，然后分別與TLR9結(jié)合，發(fā)現(xiàn)三種結(jié)構(gòu)的CpGODN 均能與TLR9結(jié)合，表明5'端被生物素封閉后仍然可以與 TLR9結(jié)合，這與先前 許多報道CpG OD與 TLR9的識別是從5'端到3'端依次進(jìn)行的，CpG ODN 5 端的游離很重要的說法不一致。這提示我們，除了TLR9之外，CpG OD可能還需要結(jié)合另一種未知的相關(guān)受體，其結(jié)合需要 Cp