微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案(9)

1、. 海量資料 超值下載微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案微生物限度檢查方法（平皿法）驗(yàn)證方案微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案16微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案1.適用范圍本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證。2.目的通過驗(yàn)證確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測定 。3.職責(zé)項(xiàng)目責(zé)任人：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的起草及具體實(shí)施。驗(yàn)證管理員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。QA現(xiàn)場監(jiān)控員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證實(shí)施過程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結(jié)果的可靠性。QC負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案中檢驗(yàn)方法的審核及按照規(guī)定的取樣計(jì)劃對(duì)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)操作程序的準(zhǔn)確執(zhí)行，負(fù)責(zé)組織實(shí)施。QC檢驗(yàn)員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的起草與參與實(shí)施，并對(duì)所測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)

2、。質(zhì)量部經(jīng)理：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案及報(bào)告的審核和批準(zhǔn)。4.內(nèi)容4.1.概述通過驗(yàn)證以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測定；確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。根據(jù)樣品特性制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，按制定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果判斷是否符合驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。若符合，按驗(yàn)證的方法和條件進(jìn)行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，再進(jìn)行驗(yàn)證，直至驗(yàn)證結(jié)果符合設(shè)立的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。4.2細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測定。.驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌、

3、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。4.2.1.驗(yàn)證用菌株及菌種要求大腸埃希菌【CMCC（B）44102】、金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】、黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。 大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌，前述菌株作為細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株；黑曲霉為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。4.2.2.驗(yàn)證菌

4、菌液制備4.2.2.1.大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng)1824小時(shí)。取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-610-7，制成每1ml含菌數(shù)50100cfu的菌懸液。4.2.2.2.白色念珠菌菌液制備：接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)2448小時(shí)；取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-610-7，制成每1ml含菌數(shù)50100cfu的菌懸液。4.2.2.3.接種黑曲霉

5、的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)57天，加入35ml 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管內(nèi)，取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-410-6，制成每1ml含孢子數(shù)50100cfu的孢子懸液。4.2.3. 供試液的制備4.2.3.1.無抑菌活性的供試品供試液的制備稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。固體、半固體、粘稠性供試品供試品： 稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1：10）。4.2.3.2.具有

6、抑菌活性的供試品供試液的制備當(dāng)供試品具有抑菌活性時(shí)，須先消除抑菌活性，其方法如下：培養(yǎng)基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養(yǎng)基，測定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)。計(jì)算每1ml供試液的平均菌落數(shù)， 按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí)可加大增菌液的用量。離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀

7、釋液補(bǔ)至原量。薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當(dāng)?shù)膶?duì)氨基苯甲酸，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。4.2.4. 菌液組 測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。采用平皿法，取試驗(yàn)用的1ml菌液（約50100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4.2.5.試驗(yàn)組4.2.5.1.平皿法：取試驗(yàn)可能用的最低稀

8、釋級(jí)1ml供試液和50100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4.2.5.2.培養(yǎng)基稀釋法（平皿法）：取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)1ml供試液分別注入N個(gè)平皿中，每個(gè)平皿再注入50100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4.2.5.3薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗(yàn)菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。4.2.5.4.離心沉淀集菌法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，如供試液含許多藥渣，

9、先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心35分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計(jì)數(shù)。4.2.6. 供試品對(duì)照組取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗(yàn)組相同）。4.2.7.稀釋劑對(duì)照組若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終濃度為每1ml 供試液含50100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)。4.2.8.回收率計(jì)算4.2.8.1.試驗(yàn)組回收率計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率試驗(yàn)組的菌回收率供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)

10、5;100%菌液組的平均菌落數(shù)4.2.8.2. 稀釋劑對(duì)照組回收率計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)×100%菌液組的平均菌落數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。4.2.8.結(jié)果判斷 在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）70%。若試驗(yàn)組的菌回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）70%。照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀

11、集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證，使試驗(yàn)組菌回收率大于70%。4.3. 控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢驗(yàn)方法應(yīng)進(jìn)行重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。4.3.1.驗(yàn)證用菌株大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】、乙型付傷寒沙門菌（Salmonella par

12、atyphi B）【CMCC(B) 50094】、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。4.3.2.菌液制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng)1824小時(shí)；分別取培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-7，制成每1ml含菌數(shù)10100cfu的菌懸液。4.3.3.陰性菌對(duì)照組 設(shè)立陰性菌對(duì)照

13、組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌；驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì)照菌不得檢出。4.3.4.試驗(yàn)組 4.3.4.1.常規(guī)法大腸埃希菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，3537培養(yǎng)1824小時(shí)，取此培養(yǎng)物按微生物限度檢查SOP大腸埃希菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。大腸菌群 取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g或1ml

14、、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，3537培養(yǎng)1824小時(shí)，按微生物限度檢查SOP大腸菌群項(xiàng)下規(guī)定檢查。 沙門菌 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對(duì)照加入沙門菌 10100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，3537培養(yǎng)1824小時(shí)。按微生物限度檢查SOP沙門菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。 銅綠假單胞菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對(duì)照加

15、入銅綠假單胞菌10100cfu，陰性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10100cfu，3537培養(yǎng)1824小時(shí)。按微生物限度檢查SOP沙門菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。 金黃色葡萄球菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，陰性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10100cfu，3537培養(yǎng)1824小時(shí)。按微生物限度檢查SOP金黃色葡萄球菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。4.3.4.2. 培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用不強(qiáng)的樣品。4.3.

16、4.3. 薄膜過濾法 采用薄膜過濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。4.3.4.4. 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心35分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中度抑菌作用的樣品。4.3.4.5.中和法 在供試品溶液中加入相應(yīng)的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應(yīng)對(duì)微生物無毒性，與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應(yīng)對(duì)微生物亦無毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。4.3.5.結(jié)果判

17、斷至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)。陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行該供試品控制菌的檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。5.驗(yàn)證的實(shí)施5.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證記錄及控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證記錄(見附件)。5.2.分析數(shù)據(jù)，綜合整個(gè)驗(yàn)證過程，得出驗(yàn)證結(jié)論。5.3.驗(yàn)證過程中發(fā)生的異常情況，按照偏差處理程序進(jìn)行處理。6.相關(guān)文件微生物限度檢查SOP 7.再驗(yàn)證7.1.藥品的組分發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)。7.2.驗(yàn)證時(shí)檢

18、驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)。微生物限度檢查方法（平皿法）驗(yàn)證方案目 錄一、 驗(yàn)證方案的制定二、 驗(yàn)證方案的起草與審批三、微生物限度檢查方法（平皿法）驗(yàn)證方案1驗(yàn)證目的和原理2驗(yàn)證方法步驟3試驗(yàn)實(shí)施3.1試驗(yàn)前的準(zhǔn)備3.2驗(yàn)證試驗(yàn)操作3.3試驗(yàn)結(jié)果4驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)分析5附件微生物限度檢查方法（平皿法）驗(yàn)證文件一、 驗(yàn)證方案的制定驗(yàn)證項(xiàng)目名稱微生物限度檢查方法（平皿法）驗(yàn)證編號(hào)VF-PR-17-A驗(yàn)證小組組員成員職務(wù)姓名主要工作職責(zé)組長方案設(shè)計(jì)責(zé)任人副組長方案實(shí)施負(fù)責(zé)人組員操作人操作人操作人操作人驗(yàn)證方案組織實(shí)施進(jìn)度步驟實(shí)施日期二、 驗(yàn)證方案的起草與審批1驗(yàn)證方案的起草驗(yàn)證項(xiàng)目名稱微生物限度檢

19、查方法（平皿法）驗(yàn)證編號(hào)VF-PR-17-A起草部門起草人簽名日期生產(chǎn)部年 月 日質(zhì)控部年 月 日2驗(yàn)證方案的審核與批準(zhǔn)驗(yàn)證方案審核人： 審核日期： 年 月 日驗(yàn)證方案批準(zhǔn)人： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日三、微生物限度檢查方法（平皿法）驗(yàn)證方案1驗(yàn)證目的和原理1.1 驗(yàn)證目的 為確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)的測定，特制定本方案。驗(yàn)證過程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行，若因特殊原因確需要變更時(shí)，應(yīng)報(bào)驗(yàn)證委員會(huì)批準(zhǔn)。1.2 原理通過比較試驗(yàn)4組中試驗(yàn)菌的恢復(fù)生長結(jié)果來評(píng)價(jià)整個(gè)檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。2驗(yàn)證方法步驟2.1驗(yàn)證前的準(zhǔn)備 進(jìn)行微生物限度檢查方法（平皿法）驗(yàn)證前

20、，所有的平皿和稀釋劑都應(yīng)該嚴(yán)格按照相關(guān)的滅菌程序消毒，以確保其對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果沒有影響。試驗(yàn)菌應(yīng)包括G-、G+、酵母菌和霉菌類微生物以基本覆蓋樣品中可能存在的微生物。2.2驗(yàn)證試驗(yàn)的操作計(jì)劃 用3個(gè)不同批號(hào)產(chǎn)品按照微生物限度檢測方法進(jìn)行平行試驗(yàn)，通過計(jì)算回收率來判斷微生物限度檢查方法是否對(duì)產(chǎn)品有影響。2.3試驗(yàn)結(jié)果可接受標(biāo)準(zhǔn) 用標(biāo)準(zhǔn)菌株評(píng)價(jià)方法“尿素維生素E乳膏的微生物限度檢查”對(duì)檢品中微生物的抑制性，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)顯示3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)不小于70%，試驗(yàn)組的回收率也不低于70%。3試驗(yàn)實(shí)施3.1試驗(yàn)前的準(zhǔn)備3.1.1主要儀器設(shè)備：高壓蒸汽滅菌器、恒溫烘干箱、凈化工作臺(tái)、生

21、物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱。3.1.2操作環(huán)境：操作間應(yīng)該安裝空氣除菌過濾層流裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于10000級(jí)，局部潔凈度為100級(jí)（或防置同等級(jí)凈化工作臺(tái)）。操作間或凈化工作臺(tái)的潔凈空氣應(yīng)該保持對(duì)環(huán)境形成正壓，不低于4.9pa。3.1.3試驗(yàn)樣品： 尿素維生素E乳膏：批號(hào) 批號(hào) 批號(hào) 3.1.4稀釋液和試劑： PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 無菌十四烷酸異丙酯 3.1.5器具 無菌培養(yǎng)皿：（直徑90mm） 無菌移液管（5ml）3.1.6驗(yàn)證用微生物名稱及其編號(hào)實(shí)驗(yàn)菌株的來源： 菌株名稱內(nèi)控編號(hào)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉編號(hào)由菌名首字母傳代代數(shù)制備日期組

22、成3.1.7培養(yǎng)基名稱生產(chǎn)商培養(yǎng)基批號(hào)配制日期有效期營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基3.2驗(yàn)證試驗(yàn)操作3.2.1試驗(yàn)菌的制備和稀釋將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至10ml的無菌營養(yǎng)肉湯中在3035下培養(yǎng)1824小時(shí)，將白色念珠菌接種至良馬丁流體培養(yǎng)基中，2328下培養(yǎng)2448小時(shí)。將黑曲霉接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，在2328下培養(yǎng)57天小時(shí)。將上述培養(yǎng)物用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌落數(shù)為50100cfu的菌懸液。3.2.2用不同類別的微生物考察供試液及檢驗(yàn)程序的抑菌性，將試驗(yàn)分為4組A樣品試驗(yàn)組 準(zhǔn)確取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的

23、適宜容器中，必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖510分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為1：10的供試液。用移液管準(zhǔn)確吸取1.0ml供試液至平皿中；并在每個(gè)平皿中接種50100cfu試驗(yàn)菌，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個(gè)試驗(yàn)菌平行接種2個(gè)平皿，按照 平皿法測定其菌數(shù)。B菌液組 在平皿中注入1ml的菌液立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，以測定所加的菌數(shù)。C供試品對(duì)照組 取規(guī)定量的供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測定供試品的本底菌數(shù)。D 稀釋劑對(duì)照組 取相應(yīng)稀釋液1ml加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每ml供試液含50100cfu

24、試驗(yàn)菌，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測定其菌落數(shù)。3.2.3培養(yǎng) 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在3050下培養(yǎng)48小時(shí)將白色念珠菌、黑曲霉在2328下培養(yǎng)72小時(shí)，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。并將結(jié)果記錄于附件1。3.3試驗(yàn)結(jié)果3.3.1稀釋劑對(duì)照組菌的回收率接入菌種尿素維生素E乳膏批號(hào)菌落計(jì)數(shù)（cfu/皿）回收率稀釋劑對(duì)照組菌液組大腸埃希菌平均值金黃色葡萄球平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。3.3.2試驗(yàn)組的菌的回收率接入菌種尿素維生素E乳膏批號(hào)菌落計(jì)數(shù)（cfu/皿）回收率試驗(yàn)

25、組供試品對(duì)照組大腸埃希菌平均值金黃色葡萄球平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)的值）÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。4驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)分析 質(zhì)控部負(fù)責(zé)各項(xiàng)驗(yàn)證、試驗(yàn)結(jié)果記錄，驗(yàn)證小組根據(jù)驗(yàn)證、試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)（附件2），起草驗(yàn)證報(bào)告（附件3），報(bào)驗(yàn)證委員會(huì)。（附件4）驗(yàn)證委員會(huì)負(fù)責(zé)對(duì)驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)審，做出驗(yàn)證結(jié)論，發(fā)放驗(yàn)證證書（附件5）。對(duì)驗(yàn)證結(jié)果的評(píng)審應(yīng)包括：驗(yàn)證試驗(yàn)是否有遺漏？驗(yàn)證實(shí)施過程中對(duì)驗(yàn)證方案有無修改？修改原因、依據(jù)以及是否經(jīng)過批準(zhǔn)？驗(yàn)證記錄是否完整？驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求？偏差及對(duì)

26、偏差的說明合理？是否需進(jìn)一步補(bǔ)充試驗(yàn)？5附件附件1產(chǎn)品試驗(yàn)組的微生物生長檢查記錄：菌種名稱產(chǎn)品試驗(yàn)組計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉供試品對(duì)照組的微生物生長檢查記錄菌種名稱供試品對(duì)照組計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉稀釋劑照組的微生物生長檢查記錄菌種名稱陽性對(duì)照計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌液組菌種名稱陽性對(duì)照計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉測試人/測試日期： 復(fù)核人/復(fù)核日期：附件2驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)表驗(yàn)

27、證名稱微生物限度檢查方法（平皿法）驗(yàn)證編號(hào)VF-PR-17-A驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)及建議確認(rèn)驗(yàn)證小組： 年 月 日附件3驗(yàn)證報(bào)告年 月 日至 年 月 日，驗(yàn)證小組根據(jù)批準(zhǔn)的編號(hào)為“VF-PR-17-A”的微生物限度檢查方法（平皿法）驗(yàn)證文件對(duì)微生物限度檢查法進(jìn)行了相關(guān)的一系列驗(yàn)證工作，達(dá)到了預(yù)期效果，滋將有關(guān)事項(xiàng)說明如下：驗(yàn)證方案在實(shí)施過程中未做修改；驗(yàn)證方案各項(xiàng)性能指標(biāo)在驗(yàn)證中未作變動(dòng)，誤差在允許范圍內(nèi)；驗(yàn)證過程中結(jié)果符合規(guī)定要求，記錄完整屬實(shí)；驗(yàn)證結(jié)果符合設(shè)計(jì)要求和GMP原則要求，可以投入使用。以上情況，請(qǐng)驗(yàn)證委員會(huì)審批！ 驗(yàn)證小組 年 月 日附件4試驗(yàn)報(bào)告審批表驗(yàn)證名稱微生物限度檢查方法（平皿法

28、）驗(yàn)證編號(hào)VF-PR-17-A驗(yàn)證內(nèi)容審閱會(huì)簽質(zhì)量部審核人： 年 月 日驗(yàn)證委員會(huì)意見： 批準(zhǔn)人： 年 月 日附件5上海安都藥業(yè)有限公司驗(yàn) 證 格 證 書 編號(hào)：VF2005017項(xiàng)目名稱：微生物限度檢查方法（平皿法）驗(yàn)證根據(jù)我國藥品GMP規(guī)范要求，依據(jù)我廠驗(yàn)證管理制度，經(jīng)對(duì)該項(xiàng)目進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果符合要求。 特發(fā)此證。有效期：自 年 月 日至 年 月 日簽發(fā)人： 年 月 日微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案 編碼：表一、驗(yàn)證方案的起草與批準(zhǔn)1.驗(yàn)證方案起草 起草人： 起草時(shí)期： 年 月 日2.驗(yàn)證小組成員： 3.驗(yàn)證方案審核部門審核人日 期生產(chǎn)部生產(chǎn)車間QCQA4.驗(yàn)證方案批準(zhǔn) 批準(zhǔn)人： 批準(zhǔn)日期：二、

29、驗(yàn)證方案1.驗(yàn)證目的和原理1.1驗(yàn)證目的為確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)的測定，特制定本方案。驗(yàn)證過程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行，若因特殊原因確需要變更時(shí)，應(yīng)報(bào)驗(yàn)證委員會(huì)批準(zhǔn)。1.2原理通過比較試驗(yàn)4組中試驗(yàn)菌的恢復(fù)生長結(jié)果來評(píng)價(jià)整個(gè)檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。2.驗(yàn)證方法步驟2.1驗(yàn)證前的準(zhǔn)備：進(jìn)行微生物限度檢查方法驗(yàn)證前，所有的平皿和稀釋劑都應(yīng)該嚴(yán)格按照相關(guān)的滅菌程序消毒，以確保其對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果沒有影響。試驗(yàn)菌應(yīng)包括G、G+、酵母菌和霉菌類微生物以基本覆蓋樣品中可能存在的微生物。2.2驗(yàn)證試驗(yàn)的操作計(jì)劃：用3個(gè)不同批號(hào)產(chǎn)品微生物限度檢測方法進(jìn)行平行試驗(yàn)，通過計(jì)算

30、回收率來判斷限度檢查方法是否對(duì)產(chǎn)品有影響。2.3試驗(yàn)結(jié)果可接受標(biāo)準(zhǔn)：用標(biāo)準(zhǔn)菌株評(píng)價(jià)方法“ ”的微生物限度檢查對(duì)檢品中微生物的抑制性，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)顯示3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)不小于70%，試驗(yàn)組回收率也不低于70%。3.試驗(yàn)實(shí)施3.1試驗(yàn)前的準(zhǔn)備3.1.1主要儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌器、凈化工作臺(tái)。3.1.2操作環(huán)境：操作間應(yīng)該安裝空氣除菌過濾層裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于10000級(jí)，局部潔凈度為100級(jí)（或放置同等級(jí)凈化工作臺(tái)）。操作間或凈化工作臺(tái)的潔凈空氣應(yīng)該保持對(duì)環(huán)境形成正壓，不低于4.9pa。3.1.3試驗(yàn)樣品： 批號(hào)： 批號(hào)： 批號(hào)：

31、3.1.4培養(yǎng)基：培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基批號(hào)配制日期有效期至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3.1.5稀釋液：PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液以上經(jīng)115高壓蒸汽滅菌30min。3.1.6驗(yàn)證用微生物名稱及其編號(hào) 實(shí)驗(yàn)菌株的來源： 菌株名稱內(nèi)控編號(hào)大腸埃希菌CMCC(B) 44102Ec-金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26003Sa-枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63501Bs-白色念珠球菌CMCC(F) 98001Ca-黑曲霉CMCC(F) 98003An-編號(hào)由菌名首字母傳代代數(shù)制備日期組成。3.1.7器具：無菌薄膜過濾器：（孔徑0.45um直徑50mm）

32、、無菌移液管（5ml）4.驗(yàn)證方法4.1菌液的制備將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至10ml的無菌營養(yǎng)肉湯中在3035下培養(yǎng)1824小時(shí)，將白色念珠菌接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，在2328下培養(yǎng)2448小時(shí)。將黑曲霉接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，在2328下培養(yǎng)57天。將上述培養(yǎng)物用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌落數(shù)為50100cfu的菌懸液。4.2實(shí)驗(yàn)方法供試液的制備：取樣品10g（ml）加入無菌PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖使分散均勻，或用勻漿儀混勻，制成1：10均勻的供試液。A樣品試驗(yàn)組取1：10供試品（相當(dāng)于1g或1ml供試品）1ml，及各5010

33、0cfu的試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基；白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。B菌液組取上述制備菌液各1ml注入平皿中，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌加入肉湯瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌、黑曲霉加入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。C供試品對(duì)照組取上述1：10供試液1ml注入平皿中，分別傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。D稀釋劑對(duì)照組取PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液各1ml及各50100cfu的試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基；白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。4.3培養(yǎng) 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在3035下培養(yǎng)48小時(shí)，將白色念珠菌、黑曲霉在2328下培養(yǎng)72小時(shí)，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。5.試驗(yàn)結(jié)果5.1產(chǎn)品試驗(yàn)組微生物生長檢查情況： 批號(hào)： 菌種名稱產(chǎn)品試驗(yàn)組計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉5.2供試品對(duì)照組微生物生長檢查情況： 批號(hào)： 菌種名稱供試品對(duì)照組計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉5.3稀釋劑對(duì)照組微生物生長檢查情況： 批號(hào)： 菌種名稱稀釋劑對(duì)照組計(jì)