DNA測序技術及其應用.ppt

1、DNADNA測序技術的發(fā)展與應用測序技術的發(fā)展與應用引言引言測序技術的應用與展望測序技術的應用與展望第一代測序技術第一代測序技術第二代測序技術第二代測序技術DNADNA序列測定的意義序列測定的意義 DNADNA的序列測定是分子生物學研究中的一的序列測定是分子生物學研究中的一項非常重要的和關鍵的內容。如在基因的分項非常重要的和關鍵的內容。如在基因的分離、定位、基因結構與功能的研究、基因工離、定位、基因結構與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達與調控、基因片程中載體的組建、基因表達與調控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關系段的合成和探針的制備、基因與疾病的關系等等，都要求對等等，都

2、要求對DNADNA一級結構的詳細了解。一級結構的詳細了解。人類基因組計劃（人類基因組計劃（Human Genome ProjectHuman Genome ProjectHGPHGP）于于19901990年正式啟動，其主要目標有：識別人類年正式啟動，其主要目標有：識別人類DNADNA中所有基因（超過中所有基因（超過1010萬個）；測定組成人類萬個）；測定組成人類DNADNA的的3030億堿基對的序列億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決據(jù)庫中；開發(fā)出有關數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。已于該計劃可能引發(fā)的倫

3、理、法律和社會問題。已于20032003年完成。年完成。人類基因組計劃是當代生命科學一項偉大的人類基因組計劃是當代生命科學一項偉大的科學工程，它奠定了科學工程，它奠定了2121世紀生命科學發(fā)展和現(xiàn)代世紀生命科學發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術產業(yè)化的基礎，具有科學上的巨大醫(yī)藥生物技術產業(yè)化的基礎，具有科學上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價值。意義和商業(yè)上的巨大價值。 測序技術最早可以追溯到測序技術最早可以追溯到20世紀世紀50年代。年代。 早在早在1945年就已經出現(xiàn)了關于早期測序技術的年就已經出現(xiàn)了關于早期測序技術的報導，即報導，即Whitfeld等用化學降解的方法測定多聚核等用化學降解的方法測定多聚核糖核

4、苷酸序列。糖核苷酸序列。19771977年年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學降解法，等發(fā)明的化學降解法，標志標志著第一代測序技術的誕生著第一代測序技術的誕生。 此后在三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產生了第二代測此后在三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產生了第二代測序技術，包括序技術，包括Roche公司的公司的454技術技術、Illumina公司公司的的SolexaSolexa技術技術和和ABI公司的公司的SOLiD技術技術。 最近，最近，Helicos公司的單分子測序技術、公司的單分子測序技術、Pacific Biosciences公司的單分子實時

5、公司的單分子實時( (Single Molecule Real Time, SMRT) )測序技術和測序技術和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔公司正在研究的納米孔單分子測序技術被認為是第三代測序技術。單分子測序技術被認為是第三代測序技術。 測序技術正在向著高通量、低成本、長讀取測序技術正在向著高通量、低成本、長讀取長度的方向發(fā)展。長度的方向發(fā)展?；瘜W降解法 基本原理：利用特異的基本原理：利用特異的選擇性試劑選擇性試劑，專一性的隨機斷裂專一性的隨機斷裂DNADNA成不同長短的片成不同長短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高

6、分辨力的辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶上的區(qū)帶位置，判斷位置，判斷DNADNA片段末端核苷酸的種類片段末端核苷酸的種類，從而測出，從而測出DNADNA的序列。的序列。將雙鏈將雙鏈DNADNA樣品變?yōu)闃悠纷優(yōu)閱捂渾捂?每個單鏈的同一方向末端都用放射每個單鏈的同一方向末端都用放射性同位素性同位素標記標記, ,以便顯示以便顯示DNADNA條帶條帶 分別用不同方法處理分別用不同方法處理, ,獲得只差獲得只差一個核苷酸的一個核苷酸的降解降解DNADNA群體群體 電泳電泳, ,讀取讀取DNADNA的核苷酸順序的核苷酸順序 化學降解法剛問世時，準確性較好，也容易為普化學降解法剛問世時，準

7、確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。通研究人員所掌握，因此用得較多。 而且化學降解較之鏈終止法具有一個明顯的優(yōu)點而且化學降解較之鏈終止法具有一個明顯的優(yōu)點，即所測序列來自，即所測序列來自原原DNADNA分子分子而不是酶促合成產而不是酶促合成產生的拷貝，排除了合成時造成的錯誤。生的拷貝，排除了合成時造成的錯誤。 但化學降解法操作過程較麻煩，且用到放射性物但化學降解法操作過程較麻煩，且用到放射性物質，逐漸被簡便快速的質，逐漸被簡便快速的SangerSanger法所代替。法所代替。 又稱為又稱為SangerSanger法。法。 原理：利用原理：利用DNADNA聚合酶，以待測聚合酶，以

8、待測單鏈單鏈DNADNA為模板，為模板，以以dNTPdNTP為底物，設立四種相互獨立的測序反應體為底物，設立四種相互獨立的測序反應體系，在每個反應體系中加入不同的系，在每個反應體系中加入不同的雙脫氧核苷三雙脫氧核苷三磷酸磷酸（ddNTPddNTP）作為鏈延伸終止劑。）作為鏈延伸終止劑。 在測序引物引導下，通過高分辨率的變性在測序引物引導下，通過高分辨率的變性聚丙烯聚丙烯酰胺凝膠電泳酰胺凝膠電泳分離，分離，放射自顯影放射自顯影檢測后，檢測后，合成鏈合成鏈序列序列，由此推知待測模板鏈的序列，由此推知待測模板鏈的序列 。 POHdNTPddNTP POHOH P P P POH Sanger法因操作

9、簡便，得到廣泛的應用。法因操作簡便，得到廣泛的應用。后來在此基礎上發(fā)展出多種后來在此基礎上發(fā)展出多種DNA測序技術測序技術，其中最重要的是，其中最重要的是熒光自動測序技術熒光自動測序技術。 熒光自動測序技術基于熒光自動測序技術基于SangerSanger原理，用原理，用熒光標記熒光標記代替同位素標記代替同位素標記，并用，并用成像系統(tǒng)成像系統(tǒng)自動檢測，從而自動檢測，從而大大提高了大大提高了DNADNA測序的速度和準確性。測序的速度和準確性。 目前，應用最廣泛的應用生物系統(tǒng)公司目前，應用最廣泛的應用生物系統(tǒng)公司(applied (applied biosystems biosystems ，ABI

10、)3730ABI)3730系列自動測序儀即是基系列自動測序儀即是基于于毛細管電泳毛細管電泳和和熒光標記技術熒光標記技術的的DNADNA測序儀測序儀。3730全自動測序儀 該方法不同于化學降解法和該方法不同于化學降解法和SangerSanger法，是利用法，是利用DNADNA雜交原理，將一系列雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷已知序列的單鏈寡核苷酸片段酸片段固定在基片上，把待測的固定在基片上，把待測的DNADNA樣品片段變樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。信息。 雜交測序檢測速度快，采用標準化的高密度雜交測序檢測速度快，采用標

11、準化的高密度寡核寡核苷酸芯片苷酸芯片能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分第二代測序技術的特點。但該方法誤差較大，且第二代測序技術的特點。但該方法誤差較大，且不能重復測定。不能重復測定。 通過幾十年的逐步改進通過幾十年的逐步改進, , 第第1 1代測序儀的讀長可代測序儀的讀長可以超過以超過1000 bp, 1000 bp, 原始數(shù)據(jù)的準確率可以高達原始數(shù)據(jù)的準確率可以高達99.999%, 99.999%, 測定每千堿基序列的成本是測定每千堿基序列的成本是0.5 0.5 美元美元, , 每天的數(shù)據(jù)通量可以達到每天的數(shù)據(jù)通量可以達到600000 600000 堿基。堿

12、基。 第一代測序技術在分子生物學研究中發(fā)第一代測序技術在分子生物學研究中發(fā)揮過重要的作用揮過重要的作用, ,如人類基因組計劃如人類基因組計劃(human (human genome project,HGP)genome project,HGP)主要基于第一代主要基于第一代DNADNA測測序技術。目前基于熒光標記和序技術。目前基于熒光標記和SangerSanger的雙脫的雙脫氧鏈終止法原理的氧鏈終止法原理的熒光自動測序儀熒光自動測序儀仍被廣泛仍被廣泛地應用。地應用。 盡管第一代測序技術已經幫助人們完成了從噬盡管第一代測序技術已經幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工菌體基因組

13、到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在作，但由于其存在成本高成本高、速度慢速度慢等方面的不等方面的不足，并不是最理想的測序方法。足，并不是最理想的測序方法。 隨著人類基因組計劃的完成，后基因組時代，隨著人類基因組計劃的完成，后基因組時代，即功能基因組時代已向我們走來。第一代測序即功能基因組時代已向我們走來。第一代測序方法已經不能滿足方法已經不能滿足深度測序深度測序和和重復測序重復測序等大規(guī)等大規(guī)?；蚪M測序的需求，這促使了第二代測序，模基因組測序的需求，這促使了第二代測序，又稱下一代測序又稱下一代測序(nextgeneration (nextgeneration sequencing)

14、sequencing)的誕生。的誕生。 第二代測序技術包括：第二代測序技術包括：454454測序技術測序技術、SolexaSolexa測測序技術序技術和和SOLiDSOLiD測序技術測序技術。 基因組基因組DNA DNA DNA DNA片段（片段（cDNAcDNA）構建構建ssDNAssDNA文庫文庫測序測序（聚合酶合成測序聚合酶合成測序，連接酶合成測序連接酶合成測序） 由于所有的克隆都在同一平面上，這些反應就能夠大規(guī)模平行進由于所有的克隆都在同一平面上，這些反應就能夠大規(guī)模平行進行，每個延伸反應所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行，從而行，每個延伸反應所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行

15、，從而獲得測序數(shù)據(jù)。獲得測序數(shù)據(jù)。DNADNA序列延伸和成像檢測不斷重復，最后經過計算機序列延伸和成像檢測不斷重復，最后經過計算機分析就可以獲得完整的分析就可以獲得完整的DNADNA序列信息。序列信息。 在在聚合酶聚合酶、硫酸化酶硫酸化酶、熒光熒光素酶素酶和和雙磷酸酶雙磷酸酶的作用下，將每一個的作用下，將每一個的聚合與一次化學發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，的聚合與一次化學發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學發(fā)光信號的有無和強度，達到通過檢測化學發(fā)光信號的有無和強度，達到實時檢測實時檢測序列的目的。序列的目的。硫化酶硫化酶熒光素酶熒光素酶指示器指示器相機相機PTPPTP盒盒 454 454測序法的突出

16、優(yōu)勢是測序法的突出優(yōu)勢是較長的讀長較長的讀長，目前，目前GS FLXGS FLX測序系統(tǒng)的序列讀長已超過測序系統(tǒng)的序列讀長已超過400 bp400 bp。雖。雖然然454454平臺的測序成本比其他新一代測序平臺要平臺的測序成本比其他新一代測序平臺要高很多，但對于那些需要長讀長的應用，如從高很多，但對于那些需要長讀長的應用，如從頭測序，它仍是最理想的選擇。頭測序，它仍是最理想的選擇。 缺點是缺點是無法準確測量同聚物的長度無法準確測量同聚物的長度。 Illumina公司的新一代測序儀公司的新一代測序儀Genome Analyzer最早由最早由Solexa公司研發(fā)，利用合成測序公司研發(fā)，利用合成測序

17、( (Sequencingby Synthesis) )的的原理，實現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平行測序。原理，實現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平行測序。原理：原理： 將基因組將基因組DNA的隨機片段附著到光學透明的玻的隨機片段附著到光學透明的玻璃表面（即璃表面（即Flow cell），這些），這些DNA片段經過延伸和片段經過延伸和橋式擴增后，在橋式擴增后，在Flow cell上形成了數(shù)以億上形成了數(shù)以億Cluster，每個每個Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性

18、終止的過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術對待測（邊合成邊測序）技術對待測的模板的模板DNA進行測序。進行測序。 GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的系統(tǒng)需要的樣品量低至樣品量低至100ng，文庫構建過程簡單，減少了樣品分離，文庫構建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間，配對末端讀長可達到和制備的時間，配對末端讀長可達到250bp，每次運行后可獲得超過每次運行后可獲得超過20 GB的高質量過濾數(shù)的高質量過濾數(shù)據(jù)，且運行成本較低，是性價比較高的新一代據(jù)，且運行成本較低，是性價比較高的新一代測序技術。測序技術。 SOLID通過連接反應進行測序。其基本原理通過連接反應進行測序。其基本原理是以四

19、色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成，是以四色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應。具體步驟包括：取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應。具體步驟包括：文庫準備文庫準備擴增擴增微珠與玻片連接微珠與玻片連接連接測序連接測序測序過程測序過程： 超高通量超高通量是是SOLID系統(tǒng)最突出的特系統(tǒng)最突出的特點，目前點，目前SOLID 3單次運行可產生單次運行可產生50 GB的序列數(shù)據(jù)，相當于的序列數(shù)據(jù)，相當于17倍人類基因組覆蓋倍人類基因組覆蓋度。度。 第二代的高通量測序技術已經得到了很好的發(fā)第二代的高通量測序技術已經得到了很好的發(fā)展和應用展和應用, , 但是由于其但是由于其測序速度、成本、準

20、確度測序速度、成本、準確度等等關鍵問題的解決仍存在困難關鍵問題的解決仍存在困難, ,研究者們很快將目光轉研究者們很快將目光轉向了更高更新的測序解決方案。向了更高更新的測序解決方案。 單分子測序也就應單分子測序也就應運而生。運而生。 20092009年年1212月月, ,中科院北京基因組研究所與浪潮中科院北京基因組研究所與浪潮成立成立“中科院北京基因組研究所中科院北京基因組研究所浪潮基因組科學浪潮基因組科學聯(lián)合實驗室聯(lián)合實驗室”三代測序技術是以三代測序技術是以單分子測序單分子測序為特點的測序技術為特點的測序技術v 單分子即時單分子即時DNA測測序技術序技術( (SMRT) )v HeliScop

21、e單分子測序單分子測序v 基于熒光共振能量轉移的即時基于熒光共振能量轉移的即時DNA測序測序v 納米孔單分子測序技術納米孔單分子測序技術第三代測序技術第三代測序技術1 1、目前一期的讀取速度為目前一期的讀取速度為3bp/ s3bp/ s2 2、它實現(xiàn)了、它實現(xiàn)了DNADNA聚合酶內在自身的聚合酶內在自身的processivity（延續(xù)性，也就是（延續(xù)性，也就是DNADNA聚合酶一次可以合成很聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應就可以測非常長的序列。長的片段），一個反應就可以測非常長的序列。 3 3、它的精度非常高，達到、它的精度非常高，達到99.9999%99.9999%。標記熒光基因標記

22、熒光基因DNA聚合酶作用 顯微鏡下進行熒光探測顯微鏡下進行熒光探測 零級波導的納米結構零級波導的納米結構來實來實現(xiàn)即時觀察和背景熒光干擾現(xiàn)即時觀察和背景熒光干擾l 小孔的尺寸低于光的波長，小孔的尺寸低于光的波長，小孔底部形成消逝波，創(chuàng)造小孔底部形成消逝波，創(chuàng)造很小體積的很小體積的檢測空間檢測空間l DNADNA鏈周圍游離的熒光標記鏈周圍游離的熒光標記dNTPdNTP有限，非常快速進出于有限，非?？焖龠M出于小孔，穩(wěn)定的小孔，穩(wěn)定的背景熒光信號背景熒光信號l 熒光標記熒光標記dNTPdNTP被摻入到被摻入到DNADNA合合成鏈，其攜帶的特定熒光會成鏈，其攜帶的特定熒光會持續(xù)一小段時間持續(xù)一小段時間

23、( (熒光光曝熒光光曝) )DNA聚合酶 優(yōu)點：采用了一種新的熒光類似物和更加靈敏的監(jiān)測系統(tǒng)，能夠直接記錄優(yōu)點：采用了一種新的熒光類似物和更加靈敏的監(jiān)測系統(tǒng)，能夠直接記錄到到單個堿基單個堿基的熒光，從而克服了第二代測序必須用的熒光，從而克服了第二代測序必須用PCRPCR擴增出數(shù)千個拷貝以擴增出數(shù)千個拷貝以增加信號亮度的缺陷。增加信號亮度的缺陷。DNADNA聚聚合合酶酶熒光標熒光標記的記的dNTPdNTP產生熒光產生熒光 CCD記錄記錄發(fā)生了堿基延伸反應發(fā)生了堿基延伸反應平面基板模擬圖平面基板模擬圖 熒光供體熒光供體 DNA DNA聚合酶聚合酶 熒光受體熒光受體 4 4種種dNTPdNTP具體過

24、程具體過程優(yōu)點：優(yōu)點： 游離的游離的dNTPdNTP不發(fā)光，只有其摻入到新合成的不發(fā)光，只有其摻入到新合成的DNADNA鏈時才會發(fā)光，極大地降低了背鏈時才會發(fā)光，極大地降低了背景熒光干擾景熒光干擾 此方法不需要用到持續(xù)的高能量的激發(fā)光照射，因此也能夠極大地減少此方法不需要用到持續(xù)的高能量的激發(fā)光照射，因此也能夠極大地減少DNADNA聚合聚合酶的光損傷作用，進一步延長了測序長度。酶的光損傷作用，進一步延長了測序長度。能量 DNADNA分子以一次一個堿基的速度依次通過納米小孔分子以一次一個堿基的速度依次通過納米小孔, ,利用核酸外切酶的特性來識別出不同的利用核酸外切酶的特性來識別出不同的DNADN

25、A堿基堿基 優(yōu)點：納米孔測序的優(yōu)勢在于它不需要對優(yōu)點：納米孔測序的優(yōu)勢在于它不需要對DNADNA進行標記，進行標記，也就省去了昂貴的熒光試劑和也就省去了昂貴的熒光試劑和CCDCCD照相機。照相機。內部：核酸外切酶和環(huán)式糊精由生物分子組由生物分子組成的納米孔成的納米孔優(yōu)點： 直接測直接測RNARNA序列。序列。 既然既然DNADNA聚合酶能夠即時觀測，那么以聚合酶能夠即時觀測，那么以RNARNA為為模板復制模板復制DNADNA的逆轉錄酶也同樣可以應用于第三代的逆轉錄酶也同樣可以應用于第三代測序平臺。測序平臺。 直接測甲基化的直接測甲基化的DNADNA序列。序列。 SMRT SMRT技術也可利用甲基化堿基特有的熒光信技術也可利用甲基化堿基特有的熒光信號來識別模板號來識別模板DNADNA中的甲基化修飾，如中的甲基化