DNA的電泳檢測(cè)

1、DNA的瓊脂糖凝膠檢測(cè)的瓊脂糖凝膠檢測(cè) 在分光光度計(jì)檢測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA的純度與濃度，重點(diǎn)檢測(cè)DNA是否降解，是否含RNA與蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私猸傊请娪痉z測(cè)DNA質(zhì)量與濃度的原理掌握瓊脂糖電泳法檢測(cè)DNA質(zhì)量與濃度的方法學(xué)會(huì)分辨不同質(zhì)量DNA的電泳帶型實(shí)驗(yàn)原理 電泳是現(xiàn)在用于分離和純化DNA片段的最常用技術(shù)。制備好一塊“膠”即一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)，并把它置于靜電場(chǎng)中，DNA分子將向陽(yáng)極移動(dòng)，這是因?yàn)镈NA分子沿其雙螺旋骨架兩側(cè)帶有富含負(fù)電荷的磷酸根殘基。當(dāng)DNA長(zhǎng)度增加時(shí)，來(lái)自電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)力和來(lái)自凝膠的阻力之間的比率就會(huì)降低，不同長(zhǎng)度的DNA片段就會(huì)出現(xiàn)不

2、同的遷移率。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。 瓊脂糖濃度 凝膠中的瓊脂糖含量%（W/V）DNA/RNA分子的分離范圍（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.232.00.12用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長(zhǎng)度為200bp至近50kb的DNA/RNA片段。瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 溴化乙錠（EB）是一種吖啶類染料，它在紫外燈照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍，電泳后就可直接紫外燈照射下檢測(cè)瓊脂糖中的DNA。 EB染料電泳緩沖液的組成 常用的電泳緩沖液的

3、配制緩沖液使用液濃貯存液（每升）Tris乙酸（TAE）1：0.04moL/L Tris乙酸 0.001moL/L EDTA 50：242g Tris堿57.7mL 冰乙酸100mL 0.5moL/L EDTA (PH8.0)Tris磷酸（TPE）1：0.09moL/L Tris磷酸 0.002moL/L EDTA10：108g Tris堿15.5mL 85%磷酸40mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)Tris硼酸（TBE）0.50.045moL/L Tris硼酸 0.001moL/L EDTA5：54g Tris堿27.5g硼酸20mL 0.5moL/L EDTA(PH8.0)加樣緩

4、沖液緩沖液類型 6緩沖液貯存溫度I 0.25%溴酚藍(lán) 0.25%二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液4II 0.25%溴酚藍(lán) 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖水溶液室溫III 0.25%溴酚藍(lán) 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液4IV 0.25%溴酚藍(lán) 40%（W/V蔗糖水溶液）4 V（堿性加樣緩沖液） 300m moL/L NaoH 6 mmoL/L EDTA 18%聚蔗糖水溶液 015%溴甲酚綠 025%二甲苯青FF4增大樣品密度，確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)。使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利。溴酚藍(lán)移動(dòng)的速率約為二甲苯青FF的2.2倍, 溴酚藍(lán)移動(dòng)的速率約與長(zhǎng)300bp

5、雙鏈線性DNA相同,而二甲苯青FF的速率則與4kb雙鏈線性DNA相同。 DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)記 DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)記通常叫作 DNA Marker,本實(shí)驗(yàn)使用Bio DL2000 為DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)記，分別由100bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000 bp、DNA Marker不僅可以作為凝膠中DNA片段長(zhǎng)度的一個(gè)標(biāo)記，還可以作為電泳的對(duì)照。每次取5ul電泳時(shí)，每條帶的DNA量為50ng，750bp為100ng。所需儀器、耗材 電泳儀、電泳槽微量移液器凝膠成像系統(tǒng)天平各種玻璃器皿（燒杯、容量瓶及廣口瓶）所需試劑 溴化乙錠（EB）瓊脂糖TBE緩沖液加樣緩沖液實(shí)驗(yàn)方法

6、視頻 實(shí)驗(yàn)方法 1.配制瓊脂糖凝膠稱取0.2g瓊脂糖,放入250ml錐形瓶中，加入0.5TBE緩沖液20 ml,于微波爐中溶解，定容至20ml。冷卻至60左右，加入1ul goldview，混勻。將凝膠床水平放置，插入兩端的擋板，用滴管吸取少量的凝膠封好膠床邊緣。放入梳子，使梳齒高于底板0.5-1mm。倒入瓊脂糖凝膠溶液，其厚度為3-5mm，放置待冷卻，膠硬化。去掉兩端的擋板，小心撥出梳子，檢查樣品孔是否完整。2.加樣取一PCR小管，加入5ul DNA樣品，再加入3ul電泳上樣緩沖液，混勻后加樣于凝膠的孔格內(nèi)。操作時(shí)，可用右手持移液器，左手握住右手腕，左肘支撐桌面，防止點(diǎn)樣時(shí)右手晃動(dòng)。同樣操作在第一樣品孔內(nèi)加入5ul DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物。3.電泳電泳槽中加入電泳緩沖液，將膠床放入，液面高出膠面1-2mm。蓋上電泳槽蓋，接通電源，樣品端接負(fù)極（DNA向陽(yáng)極移動(dòng)），以5V/cm電壓電泳。使DNA移入瓊脂糖膠內(nèi)，一般為溴酚藍(lán)遷移2cm左右。4.觀察取出凝膠，置短波紫外線（254nm）下觀察照像。比較樣品DNA與DNA標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算出樣品中DNA濃度。觀察有無(wú)RNA、蛋白質(zhì)及DNA降解條帶。標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品結(jié)果分析結(jié)果分析DNA樣品中有RNA污染DNA樣品中有蛋白質(zhì)DNA有降解，從總DNA開(kāi)始拖尾注意事項(xiàng)防止紫外線對(duì)人皮膚及眼睛的損傷，避免直接