艾滋病HIV檢測(cè)方法匯總

1、艾滋?。℉IV）檢測(cè)方法匯總一、 艾滋病簡(jiǎn)介艾滋病日的概念來(lái)源于1988年，全球衛(wèi)生部大臣關(guān)于艾滋病預(yù)防計(jì)劃的高峰會(huì)議上(W orld Summit of Ministers of Health on Programmes for AIDS Prevention)提出的。從此，這個(gè)概念被全球各國(guó)政府、國(guó)際組織和慈善機(jī)構(gòu)采納。從此，這個(gè)概念被全球各國(guó)政府、國(guó)際組織和慈善機(jī)構(gòu)采納。自1981年世界第一例艾滋病病毒感染者發(fā)現(xiàn)至今，短短20多年間，艾滋病在全球肆虐流行，已成為重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題，引起世界衛(wèi)生組織及各國(guó)政府的高度重視。為號(hào)召全世界人民行動(dòng)起來(lái)，團(tuán)結(jié)一致共同對(duì)抗艾滋病，1988年

2、1月，世界衛(wèi)生組織在倫敦召開(kāi)了一個(gè)有100多個(gè)國(guó)家參加的“全球預(yù)防艾滋病”部長(zhǎng)級(jí)高級(jí)會(huì)議，會(huì)上宣布每年的12月1日為“世界艾滋病日” (World Aids Day) ;1996年1月，聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署(UNAIDS)在日內(nèi)瓦成立;1997年聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署將“世界艾滋病日”更名為“世界艾滋病防治宣傳運(yùn)動(dòng)”，使艾滋病防治宣傳貫穿全年。二、 艾滋?。℉IV）檢測(cè)方法(一)抗體檢測(cè)主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。ELISA用去污劑裂解HIV或感染細(xì)胞液提取物作抗原，IFA用感染細(xì)胞涂片作抗原進(jìn)行抗體檢測(cè)，如果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性標(biāo)本應(yīng)重復(fù)一次。為防止假陽(yáng)性，可做Western

3、blot(WB，蛋白印跡法)進(jìn)一步確證。WB法是用聚丙烯酰胺凝膠電泳將HIV蛋白進(jìn)行分離，再經(jīng)傳移電泳將不同蛋白條帶轉(zhuǎn)移于硝酸纖維膜上，加入病人血清孵育后，用抗人球蛋白酶標(biāo)抗體染色，就能測(cè)出針對(duì)不同結(jié)構(gòu)蛋白抗體，如抗gp120、gp41、P24抗體，特異性較高?？焖贆z測(cè)法，也稱(chēng)為金標(biāo)法，也是抗體檢測(cè)的一種方法，根據(jù)免疫層析法的原理，用于HIV抗體檢測(cè)的定性檢測(cè)。(二)抗原檢測(cè)用ELISA檢測(cè)P24抗原,在HIV感染早期尚未出現(xiàn)抗體時(shí),血中就有該抗原存在.由于P24量太少,陽(yáng)性率通常較低?，F(xiàn)有用解離免疫復(fù)合物法或濃縮P24抗原，來(lái)提高敏感性。(三)核酸檢測(cè)用PCR法檢測(cè)HIV基因，具有快速、高效

4、、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)，目前該法已被應(yīng)用于HIV感染早期診斷及艾滋病的研究中。(四)病毒分離常用方法為共培養(yǎng)法，即用正常人外周血液分離單個(gè)核細(xì)胞，加PHA刺激并培養(yǎng)后，加入病人單個(gè)核細(xì)胞診斷及艾滋病的研究中。三、 艾滋病（HIV）抗體、抗原檢測(cè)HIV抗體一般在人感染后幾周逐漸出現(xiàn),可延續(xù)至終生15，血清學(xué)試驗(yàn)分為初篩和確認(rèn)試驗(yàn)。最常用的初篩試驗(yàn)和確認(rèn)試驗(yàn)分別是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫印跡試驗(yàn)(WB)。常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)(WestBlot)、間接免疫熒光法(IFA)?？焖贆z測(cè)方法：明膠顆粒凝集試驗(yàn)、斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)、P24抗原的檢測(cè)、分子生物學(xué)方法、RT?PCR檢測(cè)法、熒光實(shí)

5、時(shí)PCR檢測(cè)技術(shù)、支鏈DNA(bDNA)、連接酶酶促鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA法的基本原理是免疫反應(yīng)物通過(guò)化學(xué)或免疫學(xué)的方法形成酶結(jié)合物，酶結(jié)合物能與待檢樣品中相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合成為免疫復(fù)合物,然后加入酶底物,經(jīng)酶的催化或水解作用,無(wú)色底物產(chǎn)生顏色,用肉眼、分光光度計(jì)觀察結(jié)果。初篩用的HIV ELISA試劑目前已經(jīng)發(fā)展到第四代檢測(cè)試劑。第一代試劑主要以病毒裂解物或部分純化的病毒抗原包被反應(yīng)板,以檢測(cè)血清中的抗體。由于包被的抗原不很純,假陽(yáng)性率較高。第二代試劑使用基因工程方法得到的重組抗原和合成肽包被反應(yīng)板，由于

6、純化抗原的使用,特異性有了很大提高。第三代試劑使用雙抗原夾心法檢測(cè)抗體,進(jìn)一步提高了敏感性。第四代試劑則在第三代的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加了P24抗原的檢測(cè),把HIV抗原和抗P24的抗體同時(shí)包被反應(yīng)板,可同時(shí)檢測(cè)血清中的HIV抗體和P24抗原。2、免疫印跡試驗(yàn)免疫印跡試驗(yàn)主要用于確認(rèn)試驗(yàn)，基本原理是HIV全病毒抗原經(jīng)過(guò)SDS?PAGE電泳,將分子量大小不等的蛋白帶分離開(kāi)來(lái),然后再把這些已經(jīng)分離的不同蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將此膜切割成條狀,每一條硝酸纖維素膜上均含有經(jīng)電泳分離過(guò)的HIV病毒抗原。將待檢血清樣品用稀釋液稀釋成1/100,再把它直接加到硝酸纖維素膜上,恒溫震蕩,使其充分接觸反應(yīng),血清

7、中若含有抗HIV抗體,就會(huì)與膜條上的抗原帶相結(jié)合。加入抗人IgG酶結(jié)合物和底物后,即可使有反應(yīng)的抗原?抗體結(jié)合帶呈現(xiàn)紫褐色,根據(jù)出現(xiàn)條帶情況判定結(jié)果。有報(bào)告說(shuō)，免疫印跡試驗(yàn)的特異性不是很好, 有大約2%的假陽(yáng)性率，但免疫印跡試驗(yàn)依然是目前最常用的HIV確認(rèn)試驗(yàn)。3、免疫熒光試驗(yàn)(IFA)基本原理為應(yīng)用H?9或HUT?78培養(yǎng)細(xì)胞作為載體,用HIV感染細(xì)胞,該細(xì)胞內(nèi)就會(huì)含有HIV抗原,將HIV感染的淋巴細(xì)胞涂于玻片上,固定，制備為抗原片,加入待檢血清，待檢血清中的抗 HIV抗體與抗原結(jié)合后,再與熒光素標(biāo)記的抗人Ig結(jié)合,在熒光顯微鏡下可見(jiàn)到細(xì)胞內(nèi)有黃綠色熒光。4、明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA)PA的基

8、本過(guò)程是先將樣品稀釋,然后分別加入經(jīng)抗原致敏的和未致敏的明膠顆粒,混勻后保溫(一般為室溫)。當(dāng)血清中有HIV抗體存在時(shí),經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng),根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結(jié)果。PA操作簡(jiǎn)便,無(wú)需特殊儀器設(shè)備,適合對(duì)少量標(biāo)本的檢測(cè)。5、斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)(或免疫層析/或滲濾)斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)一般采用硝酸纖維素膜作固相載體, 用HIV抗原包被于固相載體,加入待測(cè)標(biāo)本(可為血清、血漿、尿液和其他體液),一定溫度反應(yīng)后洗去未結(jié)合于固相載體上的標(biāo)本,包被抗原和被檢血清中抗體結(jié)合,用膠體金(或膠體硒)代替底物連接在葡萄球菌蛋白A上,金標(biāo)記蛋白A具有與人Ig結(jié)合的能力,因而可與被捕獲的HIV

9、抗體結(jié)合。若樣品中有HIV抗體,則薄膜上就會(huì)產(chǎn)生一桔紅色斑點(diǎn)(或線條),一般310 min出結(jié)果,特異性較好, 較為適宜于偏遠(yuǎn)地區(qū)臨床用血檢測(cè),但不適于城市地區(qū)的獻(xiàn)血員篩查。四、 艾滋病（HIV）檢測(cè)時(shí)間艾滋病檢測(cè)的最佳檢測(cè)時(shí)間，對(duì)于艾滋病患者來(lái)說(shuō)是一個(gè)非常重要的事項(xiàng)，因?yàn)榛加邪滩〉娜?，在早期極少出現(xiàn)讓人們感到異常的癥狀，所以常常被人們所忽略。一直到了發(fā)現(xiàn)癥狀的時(shí)候，艾滋病就已經(jīng)到了晚期了，治療已經(jīng)極為不容易了。所以在感染早期，及時(shí)的進(jìn)行艾滋病檢測(cè)，是一項(xiàng)很重要的事項(xiàng)，他能幫助患者及早的發(fā)現(xiàn)艾滋病的癥狀 高危后，一般需要2-4周時(shí)間就可以檢測(cè)出艾滋病HIV抗體。高危行為后，一般需2周時(shí)間即可

10、檢測(cè)出艾滋病抗體。也就是說(shuō)2周后就適合作艾滋病檢測(cè)。時(shí)間越往后，檢測(cè)的準(zhǔn)確性就越高(不同時(shí)間檢測(cè)準(zhǔn)確率、。 絕大多數(shù)被HIV感染的人，在4周后就能產(chǎn)生足夠多的抗體，這個(gè)數(shù)量能夠滿(mǎn)足使用目前的HIV抗體測(cè)試方法檢測(cè)出HIV陽(yáng)性。五、 艾滋?。℉IV）潛伏期自1981美國(guó)報(bào)道首例艾滋病患者以來(lái), 艾滋病在全球范圍內(nèi)廣泛傳播, 嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。盡管全世界對(duì)艾滋病的防治方法進(jìn)行了大量的研究, 但至今仍未獲得有效的預(yù)防藥物和治方法, 因此對(duì)感染者從感染到艾滋病發(fā)病這一段潛伏期時(shí)間長(zhǎng)度的研究對(duì)于了解艾滋病的然史、評(píng)價(jià)治療效果、進(jìn)行流行預(yù)測(cè)等方面都有著重要的意義。30年以來(lái), 針對(duì)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的不同監(jiān)測(cè)數(shù)

11、據(jù), 對(duì)艾滋病潛伏期進(jìn)行了大量的研究,提出了多種不同的方法, 不同方法對(duì)艾滋病潛伏期得出了不同的數(shù)據(jù)，所得到的艾滋病潛伏期結(jié)果普遍都在8-9年。至今為止，除了極少數(shù)未被確認(rèn)的個(gè)體報(bào)告之外，還沒(méi)有任何可證實(shí)的資料證明有短于1年或者長(zhǎng)達(dá)20年的艾滋病潛伏期存在。OKHIV.COM編輯整理！六、 艾滋?。℉IV）的臨床分期1、急性期大部分病人在艾滋病感染初期，沒(méi)有任何癥狀。但有一部分病人在感染數(shù)天至3個(gè)月后，有如流行性流感冒樣或傳染性單核細(xì)胞增多癥樣癥狀：發(fā)熱、賽戰(zhàn)、關(guān)節(jié)疼、肌肉痛、嘔吐、腹瀉、喉痛等，一般在艾滋病毒感染后2至8周出皮疹，血中出現(xiàn)艾滋病毒抗體。最長(zhǎng)約半年后出現(xiàn)抗體。2、無(wú)癥狀感染期在

12、急性期后，沒(méi)有臨床癥狀，為無(wú)癥狀的健康人，但體內(nèi)有艾滋病毒，又稱(chēng)為艾滋病潛伏期。此后，8年內(nèi)將有50%的人發(fā)展為艾滋病。有報(bào)告稱(chēng)，1至7年內(nèi)從感染病毒到發(fā)病，其比例依次為1.5%,5%,10%,15%,25%,30%和40%。兒童艾滋病潛伏期短，平均為12個(gè)月。這時(shí)用很敏感的方法檢測(cè)艾滋病感染者漿中的病毒核醒量，可預(yù)測(cè)5年內(nèi)發(fā)病的機(jī)率。3、艾滋病前期無(wú)癥狀感染期之后，出現(xiàn)明顯的與艾滋病有關(guān)的癥狀和體征，有人稱(chēng)之為艾滋病相關(guān)綜合征，也有人稱(chēng)之為持續(xù)性全身性淋巴腺病等。主要表現(xiàn)在：持續(xù)性的淋巴腺腫大，開(kāi)始于頸部，其次為腋、腹股溝淋巴結(jié)等。一般少有兩處以上淋巴結(jié)腫大者。體重減輕10%以上。周期性發(fā)熱

13、(38攝氏度左右)，常持續(xù)數(shù)月。夜間盜汗。發(fā)生單純皰疹病毒、白色念珠菌(屬真菌類(lèi))等各種感染。4、艾滋病期由于免疫系統(tǒng)被嚴(yán)重破壞，各種致命性機(jī)會(huì)感染、腫瘤等極易發(fā)生。病變可表面在肺、口腔、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心臟、腎臟、眼、關(guān)節(jié)、皮膚等等。已發(fā)生機(jī)會(huì)性感染者，平均存活期為9個(gè)月。七、 病毒檢測(cè)方法的發(fā)展1、核酸檢測(cè)方法研究進(jìn)展隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸檢測(cè)越來(lái)越受到人們的重視并將其與抗原抗體反應(yīng)的高特異性結(jié)合起來(lái)形成了免疫PCR技術(shù)。這一技術(shù)具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，可用于單個(gè)抗原的檢測(cè)。這促進(jìn)了應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行HIV核酸檢測(cè)的快速發(fā)展。自2001年起25，COBAS A

14、mpliscreen HIV? 1 Test等4種HIV核酸檢測(cè)技術(shù)通過(guò)了FDA的批準(zhǔn)，作為進(jìn)篩選分析技術(shù)來(lái)進(jìn)行HIV?1的檢測(cè)。最近，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用使HIV核酸檢測(cè)技術(shù)又進(jìn)入到一個(gè)新境界26。通過(guò)這種技術(shù)，不但可以進(jìn)行定性檢測(cè)，更重要的是可以進(jìn)行定量檢測(cè)。Barletta等將這一技術(shù)應(yīng)用到HIV的檢測(cè)中，大大降低了病毒載量的檢測(cè)限(0.66個(gè)拷貝相當(dāng)于0.33個(gè)病毒粒子)。2002年4月國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(SDA)批準(zhǔn)了第一個(gè)HIV熒光PCR檢測(cè)試劑盒。2、p24抗原檢測(cè)方法研究進(jìn)展隨著檢測(cè)靈敏度不斷提高， p24抗原的檢測(cè)逐漸從主要用于在窗口期輔助早期診斷和進(jìn)一步縮短窗口期，

15、發(fā)展到用于病毒載量測(cè)定。目前，p24抗原在以下幾方面都有重要應(yīng)用：HIV?1抗體不確定或窗口期的輔助診斷;HIV?1抗體陽(yáng)性母親所生嬰兒早期的輔助鑒別診斷;第4代HIV?1抗原/抗體ELISA試劑檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)，但HIV?1抗體確認(rèn)陰性者的輔助診斷;監(jiān)測(cè)病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。但現(xiàn)有監(jiān)測(cè)病程進(jìn)展和抗病毒治療效果均采用昂貴、操作復(fù)雜的病毒RNA測(cè)定方法。我國(guó)HIV/AIDS患者絕大部分是在基層，檢測(cè)1次病毒載量需要上千元(約1 500元)，很難在基層普及，對(duì)疾病的治療和控制很不利。高靈敏度p24 抗原檢測(cè)方法的建立成為在發(fā)展中國(guó)家使用的病毒載量測(cè)定方法的一種選擇。近幾年，國(guó)外對(duì)建立高靈敏度檢測(cè)

16、p24抗原的研究一直沒(méi)有停止，如為了提高檢測(cè)血清中p24抗原的敏感性，將血清中免疫復(fù)合物解離后再進(jìn)行測(cè)定，發(fā)展了ICD p24抗原測(cè)定法。2003年Sutthent27等將免疫復(fù)合物熱解離后通過(guò)TSA信號(hào)放大系統(tǒng)使用ELISA進(jìn)行檢測(cè)，使p24抗原檢測(cè)的最小檢出值由原來(lái)的10 pg/mL降低到0.5 pg/mL，在HIV?1抗體陽(yáng)性母親所生嬰兒早期的診斷中與RNA檢測(cè)相當(dāng)，與HIV核酸檢測(cè)具有可比性，具有重要的實(shí)用價(jià)值。2004年，來(lái)自HIV病毒的發(fā)現(xiàn)者之一美國(guó)馬里蘭大學(xué)Dr.Robert C.Gallo所領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室的一篇高靈敏度檢測(cè)p24抗原的研究論文引起了廣泛的關(guān)注，p24抗原的檢測(cè)成為比病毒核酸檢測(cè)更靈敏的方法。2005年來(lái)自美國(guó)馬里蘭大學(xué)的一篇長(zhǎng)篇綜述也開(kāi)始關(guān)注p24抗原的檢測(cè)，認(rèn)為這可以作為低成本、適合在發(fā)展中國(guó)家使用的替代現(xiàn)有昂貴的RNA測(cè)定方法的一種選擇。目前，商品化的p24 抗原的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法主要是依據(jù)夾心ELISA原理。該方法是用抗p24抗原的抗體包被固相的雙抗體夾心法，是檢