病毒的分離鑒定

1、病毒的別離與鑒定要證明某種疾病是由某一感染性病毒所引起，那么必須滿足以下原那么： 從患病者體內(nèi)別離出病毒；在實驗動物或寄主細胞中可以培養(yǎng)；證明這種培養(yǎng)物具有濾過性； 在原始宿主或相關(guān)種屬內(nèi)能產(chǎn)生同樣的病癥；能重新別離出病毒。1. 病毒的別離1.1標本的處理標本的收集a) 糞便標本：將 5g 糞便標本和 50mlPBS 放入盛有 20-25 顆玻璃小 珠的100ml無菌瓶中，攪拌成懸液，倒出上清，3000X g, 4C離 心 6min 。b) 拭子和生物體液：拭子浸在 2-3ml 運載培養(yǎng)基中，將棉拭子中的 液體盡量擠出以獲得標本，如果液體被污染，應(yīng) 3000X g4C離心 30min。c) 組

2、織標本：用無菌乳缽或勻漿器研磨組織標本，同時參加足量的PBS制備成20%的懸液，3000Xg4C離心30min。除菌處理a) 糞便可加青鏈霉素使最終濃度為10000單位/毫升，置4C過夜。b) 鼻咽拭子一般加抗生素最終濃度為2000單位/毫升，置4C作用4小時c對乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、 腸道病毒、呼腸孤病毒、 腺病毒、 痘病毒等，那么可參加等量的乙醚 4 C過夜除菌。1.2病毒的別離培養(yǎng)病毒是嚴格的細胞內(nèi)寄生微生物， 培養(yǎng)病毒必須使用細胞。 根據(jù) 病毒的不同選用敏感動物動物接種 、雞胚雞胚接種或離體細 胞進行別離培養(yǎng)細胞培養(yǎng) 。雞胚接種a雞卵的選擇：一般都選新鮮、 10 天以內(nèi)的受精卵以保

3、證規(guī)格質(zhì)量 上的一致。b孵育：孵育時可將雞卵放入卵箱內(nèi)進行 ,氣室向上，孵育的最適溫 度為38-39 C相對濕度為40 70 %，孵育8日后，雞卵應(yīng)每天 翻動 12次，以幫助雞胚發(fā)育勻稱和防止雞胚膜粘連。c檢卵：雞卵孵育45天后，即可用檢卵器檢查雞胚發(fā)育情況二 天一次。未受精雞卵：在檢卵器上僅見到模糊的陰影?；铍u 卵：雞胚發(fā)育 4 天后，在檢卵器上就可見到清晰的血管，雞卵內(nèi) 有一小黑點雞胚，有明顯的自然轉(zhuǎn)動。死胎：如果發(fā)現(xiàn)雞卵 血管模糊、擴張、胚胎活動呆滯或不能自主地轉(zhuǎn)動，那么可判斷胚 胎頻死或已經(jīng)死亡，應(yīng)將其挑撿出來。雞胚孵育完畢后，用鉛筆 劃出氣室邊緣和胚胎的位置待用。d接種：圖1.雞胚卵

4、黃囊接種： 用58天雞胚，以細 長針頭由雞卵氣室端用1214天雞胚，將 12天雞胚，將標本接種 檢材注入羊膜腔，孵育 于尿囊腔，孵育后取尿e剖檢及收獲收獲前雞胚應(yīng)置4 C冰箱過夜，使 雞胚內(nèi)血液凝固。收獲時，用碘酒將氣 室部卵殼消毒，將氣室處卵殼剝?nèi)ゲ?要將碎片落入殼膜。然后用無菌手術(shù) 刀柄從胚胎背部輕輕下壓，切勿壓破卵黃囊再用吸管吸取尿囊 液，置青霉素小瓶內(nèi)，于低溫保存。f優(yōu)缺點優(yōu)點：技術(shù)簡單、來源充分、價格低廉、數(shù)量可大、不需特殊 設(shè)備。缺點：很多病毒不能適應(yīng)，主要是哺乳動物的病毒。圖4.絨毛尿囊膜接種：用1012天雞胚，以無 菌手續(xù)在蛋殼上開一細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)(cellculture)是

5、指利用機械、酶或化學(xué)方法使動物組織 或傳代細胞分散成單個乃至24個細胞團懸液進行培養(yǎng)。根據(jù)細胞 的類型和培養(yǎng)細胞代數(shù)的不同，可將其分為兩種：原代細胞培養(yǎng)； 傳代細胞培養(yǎng)。組織細胞培養(yǎng)的病毒，當出現(xiàn)穩(wěn)定的細胞病變后，就可取培養(yǎng) 液或培養(yǎng)液與細胞培養(yǎng)物混和物，細胞培養(yǎng)物中的病毒可采用凍 融、超聲波等方法使其釋放出來。優(yōu)點：a) 每個細胞生理特性根本一致，對病毒易感性相等；b) 無個體差異，準確性和重復(fù)性好；c) 可嚴格執(zhí)行無菌操作；d) 細胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長特征；e) 應(yīng)用空斑技術(shù)可進行病毒的克隆化。2. 病毒的鑒定2.1形態(tài)學(xué)鑒定細胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect, CPE

6、)：病毒在細胞內(nèi)增殖 后，可引起細胞的不同變化。常見的形態(tài)學(xué)改變?nèi)缂毎麍A縮、聚 合、溶解或脫落。CPE出現(xiàn)的時間是鑒定病毒的標志之一。某些病毒感染細胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化,在普通光學(xué)顯微 鏡下可見胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小數(shù)量不 等的圓形或不規(guī)那么形的團塊狀結(jié)構(gòu),病毒學(xué)上稱為包涵體。 2.2血吸附和血凝作用多見于以出芽方式釋放的病毒。血吸附指感染細胞具有吸附紅 細胞的能力；血凝作用指感染細胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存 在，具有凝集紅細胞的作用。2.2.1 血吸附實驗 具有血凝能力的病毒能使感染的細胞吸附紅細胞，這種現(xiàn)象被稱作 吸附作用。大多數(shù)粘液病毒能引起吸附。具體檢驗步驟

7、如下：a用PBS配制10%的豚鼠紅細胞懸液，4C保存，用前按需要量稀 釋成的濃度10%懸液1ml加19mlPBS混勻。b吸去對照和試驗管培養(yǎng)細胞的上清液，試驗管的上清液留待電鏡 觀察。c每管參加紅細胞懸液，4C孵育30min。用4C的PBS清洗培養(yǎng) 細胞 3 次。d顯微鏡下讀取結(jié)果并記錄，根據(jù)吸附紅細胞的量可分為 0陰 性 4完全吸附級。e37C孵育60min，有神經(jīng)氨酸酶的病毒將會從紅細胞上游離下 來。2.2.2 血凝實驗a在血凝板第一排的112孔參加50卩I生理鹽水。b在第1孔中參加50卩I病毒，混勻后吸50卩I到第2孔，如此倍 比稀釋直到第10孔，混勻后棄50卩I;最后兩孔11、12為紅

8、 細胞對照。c將1%的紅細胞輕輕搖動混勻，在112孔中每孔參加50卩I。d手工震蕩，37C靜置30min 室溫40min后觀察結(jié)果。2.3電子顯微鏡檢查病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進 行檢查。對于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感 染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細胞培養(yǎng)收獲的材料作電 子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。2.3.1 正染法：超薄切片法取材-固定戊二醛/四氧化鋨-清洗與脫水-浸透、包埋與聚合-切片-染色鈾染/鉛染a優(yōu)點：可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程。b缺點：操作復(fù)雜，費時，但標本可長時間保存。2.3.2 負染技術(shù)負染是指通過重金屬鹽在樣品四周

9、的堆積而加強樣品外周的電 子密度，使樣品顯示負的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。具體步 驟漂浮法為：現(xiàn)將需負染的樣品滴幾滴在干凈的載玻片上，再 將有支持膜的載網(wǎng)漂浮在樣品液滴上以沾取樣品，用濾紙吸干樣品 余液使樣品在載網(wǎng)上僅有一薄層液膜，在樣品未干時即加一滴復(fù)染 液的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干多余的染液即可。a優(yōu)點：快速簡易10-20min;分辨率高；圖象清晰地病毒結(jié)構(gòu)。b缺點：敏感性低，要求病毒量在 1 07以上；所有樣品應(yīng)處于懸浮狀態(tài)2.4血清學(xué)試驗可采用 ELISA 、瓊脂擴散、中和試驗、標記抗體技術(shù)等免疫血 清學(xué)方法檢查病畜的抗體消長情況和發(fā)病組織中的病毒抗原。2.4.1 中和反響 利用病毒與特異性中和抗體結(jié)合的特性鑒定病毒的種類，觀察 特異性抗體能否保護易感的試驗動物死亡，能否抑制病毒的細胞病 變效應(yīng)。2.4.2 酶聯(lián)免疫吸附