SSR分析的原理及操作技術(shù)

1、SSR分析的原理及操作技術(shù)分析的原理及操作技術(shù) DNA分子標(biāo)記技術(shù)類型分子標(biāo)記技術(shù)類型以以SouthernSouthern雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)：雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)：限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性標(biāo)記（限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性標(biāo)記（RFLPRFLP）以以PCRPCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)：為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)：隨機引物隨機引物PCRPCR標(biāo)記標(biāo)記和和特異引物特異引物PCRPCR標(biāo)記標(biāo)記隨機擴增多態(tài)性隨機擴增多態(tài)性DNADNA（RAPDRAPD）擴增的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（擴增的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（AFLPAFLP）相關(guān)序列擴增多態(tài)性（相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAPSRAP）簡單

2、重復(fù)序列（簡單重復(fù)序列（SSRSSR）或簡單序列長度多態(tài)性（）或簡單序列長度多態(tài)性（SSLPSSLP）以以mRNAmRNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)：為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)：差異顯示（差異顯示（DDDD）逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR（RTRTPCRPCR）以單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)：以單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)：單核苷酸多態(tài)性（單核苷酸多態(tài)性（SNPSNP）SSR簡介簡介在在生物的基因組中，特別是高等生物的基因組中含有大量的重復(fù)生物的基因組中，特別是高等生物的基因組中含有大量的重復(fù)序列，序列，根據(jù)重復(fù)序列在基因組中的分布形式可分為根據(jù)重復(fù)序列在基因組中的分布形式可分為：串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重

3、復(fù)序列（Tandemly repeated sequencesTandemly repeated sequences）分散重復(fù)序列（分散重復(fù)序列（Interspersed repeated sequencesInterspersed repeated sequences）依據(jù)重復(fù)基序的依據(jù)重復(fù)基序的長度長度、拷貝數(shù)拷貝數(shù)和和位置位置等又將串聯(lián)等又將串聯(lián) 重復(fù)序列分為：重復(fù)序列分為：衛(wèi)星衛(wèi)星DNADNA：基序（：基序（motifmotif）長）長1010300bp300bp，甚至長，甚至長1,0001,000100,000bp100,000bp；小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNADNA：基序長：基序長10106

4、0bp60bp；微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNADNA：基序長：基序長1 16bp6bp，其，其功能功能：重組熱點、對基因的調(diào)節(jié)和表達以重組熱點、對基因的調(diào)節(jié)和表達以及性別決定等。及性別決定等。SSR簡介簡介 微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNADNA即即簡單重復(fù)序列簡單重復(fù)序列（simple sequence repeatsimple sequence repeat，SSRSSR），），或者或者微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列（microsatellitemicrosatellite，MSMS），），又稱又稱短串聯(lián)重復(fù)短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeatsshort tandem repeats，STRSTR），），是一

5、類由幾個核苷酸（多為是一類由幾個核苷酸（多為2 24 4個）為個）為基本基本單位單位多次串聯(lián)重復(fù)而多次串聯(lián)重復(fù)而形形成的成的DNADNA片段片段，其長度一般較短，其長度一般較短，多多在在200bp200bp以內(nèi)。以內(nèi)。 微衛(wèi)星在植物基因組中的含量非常豐富，均勻分布于整個植物微衛(wèi)星在植物基因組中的含量非常豐富，均勻分布于整個植物基基因組中，但不同植物中微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率變化非常大，但因組中，但不同植物中微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率變化非常大，但（ATAT）n n最多。最多。SSR標(biāo)記的基本原理標(biāo)記的基本原理 盡管微衛(wèi)星盡管微衛(wèi)星DNADNA分布于整個基因組中的不同位置，但某分布于整個基因組中的不同位置，但某一

6、特定的微衛(wèi)星的兩端一特定的微衛(wèi)星的兩端側(cè)翼序列側(cè)翼序列通常都是通常都是保守性較強的保守性較強的單一單一序列序列，將重復(fù)序列及其兩側(cè)的將重復(fù)序列及其兩側(cè)的DNADNA片段進行片段進行克隆克隆和和測序測序，然后根據(jù)兩端的側(cè)翼序列，然后根據(jù)兩端的側(cè)翼序列設(shè)計一對特異引設(shè)計一對特異引物物，通過，通過PCRPCR技術(shù)將技術(shù)將目的目的微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNADNA片段片段擴增出來擴增出來。SSR標(biāo)記的基本原理標(biāo)記的基本原理 由于單個微衛(wèi)星位點由于單個微衛(wèi)星位點的的重復(fù)單元在數(shù)量上的不同重復(fù)單元在數(shù)量上的不同，導(dǎo)致擴，導(dǎo)致擴增產(chǎn)物在長度上發(fā)生變化，即產(chǎn)生長度多態(tài)性，這增產(chǎn)物在長度上發(fā)生變化，即產(chǎn)生長度多態(tài)性，這種

7、種多態(tài)多態(tài)性稱為性稱為簡單序列長度多態(tài)性簡單序列長度多態(tài)性( (simple sequence length polymorphism，SSLP) )，每一擴增位點就代表了該位點的，每一擴增位點就代表了該位點的一對等位基因。一對等位基因。 SSR標(biāo)記的多態(tài)性主要依賴于基本單位重復(fù)次數(shù)的變異，標(biāo)記的多態(tài)性主要依賴于基本單位重復(fù)次數(shù)的變異，而這種變異在生物群體中是大量存在的，因此，而這種變異在生物群體中是大量存在的，因此，SSR具有具有大量的等位差異，多態(tài)性十分豐富。大量的等位差異，多態(tài)性十分豐富。PCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain

8、 reactionpolymerase chain reaction，PCRPCR）是）是利用單鏈寡核苷酸引物對特異利用單鏈寡核苷酸引物對特異DNADNA片段進行體外快速擴增的片段進行體外快速擴增的一種方法。一種方法。特點一：特點一：使使特定的特定的DNADNA片段得到片段得到了迅速大量的擴增，理了迅速大量的擴增，理論上的最高值達論上的最高值達2 2n-2n-2；特點二：能夠特點二：能夠指導(dǎo)指導(dǎo)特定特定DNADNA片段片段的合成。的合成。 如何實現(xiàn)？如何實現(xiàn)？PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系一對特異引物：一對特異引物：1.1.引物長度引物長度：典型的引物長度為：典型的引物長度為18-2418-24bpb

9、p，引物需要足夠，引物需要足夠長長，保證序列，保證序列獨特性。但是長度大于獨特性。但是長度大于2424bpbp的引物并不意味著更高的特異性。較長的序的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量；從而降低了產(chǎn)量；2.2.引物濃度引物濃度：一般：一般0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L，過高的引物濃度會加劇錯配發(fā)生，過高的引物濃度會加劇錯配發(fā)生，特異性下降；特異性下降；3.3.合理的合理的G/CG/C含量含量：一般為：一般為40406060。PCR反應(yīng)

10、體系反應(yīng)體系MgMg2 2溶液溶液 ：其濃度直接影響引物：其濃度直接影響引物退火的特異性退火的特異性、產(chǎn)物特異性產(chǎn)物特異性以及以及酶的酶的催化能力和準(zhǔn)確性催化能力和準(zhǔn)確性等，適當(dāng)降低等，適當(dāng)降低MgMg2 2濃度可增加特異性濃度可增加特異性。模板模板DNADNA：一般：一般1ng/1L1ng/1L，模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加；，模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加；dNTP dNTP ：常用濃度為：常用濃度為50-20050-200 mol/Lmol/L，種，種dNTPdNTP濃度應(yīng)相等，濃度過高易產(chǎn)濃度應(yīng)相等，濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量。生錯誤堿基的摻入，

11、濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量。TaqTaq酶酶 ：DNADNA聚合酶，熱穩(wěn)定，最適溫度聚合酶，熱穩(wěn)定，最適溫度72 72 ，酶量增加使反應(yīng)特異性，酶量增加使反應(yīng)特異性下降下降; ;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 1010bufferbuffer緩沖液（不含緩沖液（不含MgMg2 2 ）：）：維持維持PCRPCR pHpH的穩(wěn)定。的穩(wěn)定。PCR循環(huán)條件循環(huán)條件高溫變性：雙鏈高溫變性：雙鏈DNADNA模板加熱變性成單鏈；模板加熱變性成單鏈； 低溫退火低溫退火：在低溫下引物與單鏈：在低溫下引物與單鏈DNADNA互補配對互補配對； 退火溫度針對不同的引物差別較大，退火溫度過低，極易形退火溫度針

12、對不同的引物差別較大，退火溫度過低，極易形成非特異擴增，成非特異擴增，而而退火溫度過高，退火溫度過高，又又難以擴增出條帶，對于長度為難以擴增出條帶，對于長度為20bp20bp，GCGC含量為含量為5050的核苷酸的典型引物，的核苷酸的典型引物，55 55 是比較適宜的退火溫度。是比較適宜的退火溫度。適溫延伸：在適宜溫度下適溫延伸：在適宜溫度下Taq DNATaq DNA酶催化引物沿著模板酶催化引物沿著模板DNADNA延伸。延伸。PCR條件優(yōu)化條件優(yōu)化 優(yōu)化引物設(shè)計：這是最關(guān)鍵的，可以借助計算機來輔助設(shè)優(yōu)化引物設(shè)計：這是最關(guān)鍵的，可以借助計算機來輔助設(shè)計引物。計引物。 熱啟動技術(shù)：在熱啟動技術(shù)：

13、在PCR反應(yīng)的第一個循環(huán)中待溫度升高且超反應(yīng)的第一個循環(huán)中待溫度升高且超過模板過模板TmTm值（值（8080）后，）后，再再加入關(guān)鍵試劑如加入關(guān)鍵試劑如Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶等。這樣操作可以減少非特異性擴增。等。這樣操作可以減少非特異性擴增。 創(chuàng)造一個有利于增加特異性擴增的條件：如創(chuàng)造一個有利于增加特異性擴增的條件：如降低降低MgMg2 2，dNTPdNTP濃度濃度，優(yōu)化優(yōu)化pHpH及及減少減少TaqTaq酶的用量酶的用量，減少循環(huán)中各部分減少循環(huán)中各部分的時間或循環(huán)數(shù)的時間或循環(huán)數(shù)，提高退火溫度提高退火溫度等。等。電泳原理電泳原理 在生理條件下，核酸分子之糖磷酸骨架中的磷酸

14、基團，在生理條件下，核酸分子之糖磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的。當(dāng)核酸分子被放置在電場中時，他們是呈離子化狀態(tài)的。當(dāng)核酸分子被放置在電場中時，他們就會向就會向正電極正電極的方向遷移。的方向遷移。 在一定的電場強度下，在一定的電場強度下，DNADNA分子的這種遷移速度，亦即電泳分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較小的小的DNADNA分子，比分子量較大的分子，比分子量較大的DNADNA分子，具有較緊密的構(gòu)分子，具有較緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移率較快。型，所以其電泳遷移率較快。電泳介質(zhì)電泳介質(zhì) 瓊脂糖

15、瓊脂糖凝膠凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 優(yōu)點：優(yōu)點： 分辨率極高分辨率極高，可分開長度僅相差，可分開長度僅相差0.10.1的的DNADNA分子，即分子，即 1000bp1000bp中相差中相差1bp1bp；從聚丙烯酰胺凝膠中從聚丙烯酰胺凝膠中回收的回收的DNADNA純度很高純度很高，可用于要求，可用于要求最高的實驗。最高的實驗。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠是由聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺丙烯酰胺單體，在催化劑單體，在催化劑TEMEDTEMED(N,N,N,N(N,N,N,N一四甲基乙二胺一四甲基乙二胺) )和和過硫酸銨過硫酸銨的作用下，的作用下，聚合形成線狀長鏈，在交聯(lián)劑如

16、聚合形成線狀長鏈，在交聯(lián)劑如N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺參與參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯胺的鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯胺的鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成三維帶狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠成三維帶狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠。 這些網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑這些網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度的濃度。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 變性聚丙烯酰胺凝膠變性聚丙烯酰胺凝膠 用于用于單鏈單鏈DNADNA片斷的分離與純化。這些凝膠在片斷的分離與純化。這些凝膠在尿素尿素或或甲酰胺甲酰胺等等抑制核抑制核酸堿基配對酸堿基配對的試劑的存在下發(fā)生聚合。變性的的試劑的存在

17、下發(fā)生聚合。變性的DNADNA在這些凝膠中的遷移在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)。率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)。 非變性聚丙烯酰胺凝膠非變性聚丙烯酰胺凝膠 用于用于雙鏈雙鏈DNADNA片段的片段的分離和純化。雙鏈分離和純化。雙鏈DNADNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率通常與其大小的常用對數(shù)值成反比。然而，電泳遷移率也受的遷移率通常與其大小的常用對數(shù)值成反比。然而，電泳遷移率也受其堿基組成和序列的影響，因此，大小完全相同的兩條其堿基組成和序列的影響，因此，大小完全相同的兩條DNADNA的遷移率可的遷移率可相差相差1010。非變性聚丙烯酰胺凝膠主要

18、用于。非變性聚丙烯酰胺凝膠主要用于制備高純度的制備高純度的DNADNA片段片段和和檢檢測蛋白質(zhì)測蛋白質(zhì)DNADNA復(fù)合物復(fù)合物。 用聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測時，通用聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測時，通常常PCR產(chǎn)物在產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠變性聚丙烯酰胺凝膠上分離效果上分離效果優(yōu)優(yōu)于于非變性膠。因為雜合個體在非變性膠。因為雜合個體在PCR后期的循環(huán)中后期的循環(huán)中會產(chǎn)生異源雙鏈分子，導(dǎo)致在雜合的情況下膠中會產(chǎn)生異源雙鏈分子，導(dǎo)致在雜合的情況下膠中產(chǎn)生了產(chǎn)生了3 3條帶甚至是條帶甚至是4 4條帶，條帶，而而不是正常的不是正常的2 2條帶。條帶。這種情況出現(xiàn)會干擾等位基因的統(tǒng)計。這

19、種情況出現(xiàn)會干擾等位基因的統(tǒng)計。染色方法與原理染色方法與原理 溴化乙錠（溴化乙錠（EBEB）染色）染色法：法：但是聚丙烯酰胺對熒光燃料溴化乙錠但是聚丙烯酰胺對熒光燃料溴化乙錠的熒光有的熒光有猝滅猝滅作用，作用，EBEB染色法很難檢測到少于染色法很難檢測到少于10ng10ng的的DNADNA條帶條帶。 銀染法銀染法（硝酸銀）（硝酸銀）：是一種檢測微量是一種檢測微量DNADNA的理想方法。的理想方法。優(yōu)點：經(jīng)濟、簡便、快速、靈敏，無污染、分辨率高、結(jié)果可永優(yōu)點：經(jīng)濟、簡便、快速、靈敏，無污染、分辨率高、結(jié)果可永久保存久保存原理：原理：銀染液中的銀染液中的銀離子銀離子(Ag+)(Ag+)可與可與DN

20、ADNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如還原劑如甲醛甲醛在在堿性條件堿性條件下使下使Ag+Ag+還原成銀顆粒，可把還原成銀顆粒，可把DNADNA電泳帶電泳帶染色成黑褐色染色成黑褐色載樣緩沖液（載樣緩沖液（loading buffer）指示劑（溴酚藍或二甲苯氰）一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖指示劑（溴酚藍或二甲苯氰）一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400400等組成載等組成載樣緩沖液，加入到擴增好的樣緩沖液，加入到擴增好的PCRPCR產(chǎn)物當(dāng)中。產(chǎn)物當(dāng)中。作用作用：1.1.增加樣品密度，使其比重增加，以確保增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNADNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。均勻沉入加樣孔內(nèi)。

21、2.2.形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測核酸電泳的速度和位置。形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測核酸電泳的速度和位置。3.3.使樣品呈色，使加樣操作更方便。使樣品呈色，使加樣操作更方便。實驗方法與步驟實驗方法與步驟1.1.實驗材料實驗材料 馬貴荔馬貴荔（母本）（母本）焦核三月紅焦核三月紅（父本）（父本）F1F1雜種群體中部分個雜種群體中部分個體的基因組體的基因組DNADNA溶液。每人做溶液。每人做4 4個模板個模板。 一對特異引物：一對特異引物：B-F09 FB-F09 F：5TCTGCTTACCAGCATGAGTGA 35TCTGCTTACCAGCATGAGTGA 3B-F09 RB-F09 R：5CTG

22、TTGGTCTGCAGGTTTTG 35CTGTTGGTCTGCAGGTTTTG 32.2.配制配制SSRSSR擴增的反應(yīng)液：擴增的反應(yīng)液：各組份的用量及終濃度如下表，各組份的用量及終濃度如下表，做多個反應(yīng)做多個反應(yīng)時時，可將所用的的相同組份，可將所用的的相同組份一次取樣、混勻后再分裝至各個反應(yīng)中。一次取樣、混勻后再分裝至各個反應(yīng)中。組分組分1 1個反應(yīng)體積個反應(yīng)體積終濃度終濃度4 4個反應(yīng)體積個反應(yīng)體積ddHddH2 2O O10.210.2L L40.840.8L L1010bufferbuffer緩沖液緩沖液（含（含15mM Mg15mM Mg）2.02.0L L1 18 8L L2.5

23、mM dNTP2.5mM dNTP1.61.6L L0.2mM0.2mM6.46.4L L5 5M M 引物引物F F1.01.0L L0.25M0.25M4 4L L5 5M M 引物引物R R1.01.0L L0.25M0.25M4 4L L模板模板DNADNA（5ng/5ng/L L）4 4L L1ng/L1ng/LTaqTaq酶（酶（5U/5U/L L）0.20.2L L1U1U0.80.8L L總體積總體積2020L L8080L L3.SSR-PCR3.SSR-PCR配制好反應(yīng)液后，放入配制好反應(yīng)液后，放入PCRPCR儀中進行擴增反應(yīng)，擴增程序為：儀中進行擴增反應(yīng)，擴增程序為：94

24、94 3min3min（預(yù)變性）；（預(yù)變性）；9494 50s50s5555 50s50s727250s50s（3535個循環(huán)）；個循環(huán)）；7272 10min 10min（延伸反應(yīng)）（延伸反應(yīng)）4.4.制備制備5 5的變性聚丙烯酰胺凝膠：的變性聚丙烯酰胺凝膠：將將長、短長、短玻璃板固定在制膠板上，用玻璃板固定在制膠板上，用1.01.0的瓊脂糖封口的瓊脂糖封口，將配好的將配好的膠溶液沿玻璃板點樣端小心灌入，排除氣泡，待膠灌滿后插入梳子膠溶液沿玻璃板點樣端小心灌入，排除氣泡，待膠灌滿后插入梳子，靜置，靜置1h1h，讓其聚合凝固。，讓其聚合凝固。5 5變性膠變性膠100ml100ml尿素尿素 （UreaUrea）42g42g5 5TBE bufferTBE buffer20ml20ml4040丙稀酰胺丙稀酰胺12.5ml12.5ml1010過硫酸銨過硫酸銨400400l lTEMEDTEMED87.587.5l l4040丙稀酰胺溶液（丙稀酰胺溶液（1919：1 1）100ml100ml丙稀酰胺（丙稀酰胺（AcrylamideAcrylamide）38g38g甲義甲義- -丙稀酰胺（丙稀酰胺（Bis-Acryla