細(xì)胞培養(yǎng)-復(fù)蘇,傳代換液,凍存計數(shù)(自編)

1、細(xì)胞培養(yǎng)程序材料A、儀器1. 凈化工作臺，2. 離心機，3. 恒溫水浴箱，4. 冰箱（4）5. 倒置相差顯微鏡，6. CO2培養(yǎng)箱，7. 振蕩混合儀8. 酶聯(lián)免疫檢測儀，9. 移液槍，10. 電磁力攪拌機，11. 微孔濾器B、玻璃器皿1. 吸管，2. 小燒杯（100ml），3. 廢液缸，C、塑料器皿1. 吸頭，2. 槍頭，3. 96孔培養(yǎng)板，4. 15ml離心管，5. 50ml離心管，6. 膠塞，D、其他物品 1. 微量加樣槍，2. 紅血球計數(shù)板，F(xiàn)、試劑1. D-Hanks液，2. 小牛血清，3. RPMI1640，4. 雙抗（青霉素、鏈霉素），5. 0.25%胰酶，6.0.025% EDT

2、A 7. 二甲基亞砜（DMSO），8. MTT溶液：稱取250mgMTT，放入小燒杯中，加50ml培養(yǎng)液或平衡鹽溶液在電磁力攪拌機上攪拌30min，用0.22um的微孔濾器除菌，分裝，4保存?zhèn)溆茫瑑芍軆?nèi)有效。一、原代細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞株（系）復(fù)蘇培養(yǎng)：（一）細(xì)胞原代培養(yǎng)1.貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法：1）、組織塊培養(yǎng)法 將所取得的組織用含青霉素、鏈霉素400U/ml和400ug/ml的生理鹽水漂洗2遍，5分鐘/次。取出組織盡可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加兩滴小牛血清，用剪刀盡可能將其剪碎，用吸管將其泥狀的組織點種在培養(yǎng)瓶壁，倒置于37°、5%CO2條件下30分鐘后將培養(yǎng)瓶正置，從培養(yǎng)瓶的一端緩緩

3、加入完全培養(yǎng)液（小牛血清15%、青霉素、鏈霉素各100U、100ug/ml），使組織塊有培養(yǎng)液與其接觸為準(zhǔn)，輕輕放置于37°培養(yǎng)。待24小時候補液?；蛐K放置后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使瓶底朝上,然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞,將瓶傾斜放置在37溫箱內(nèi)。 培養(yǎng)24小時，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動作要輕，嚴(yán)禁搖動和來回振蕩，以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)24小時后再補液，培養(yǎng)35天時可換液，一方面補充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用

4、。其他方法：消化分離法 、器官培養(yǎng) 略2.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法 對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。 （二）細(xì)胞株(系)細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇的主要操作步驟(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。(2)迅速放入38水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其完全融化。(3) 然后在無菌下取出細(xì)胞。凍存管用75%酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。(4)在1000r/min速度下離心510分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種

5、濃度1×109/L，置37溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細(xì)胞密度較高，及時傳代?；驘o需離心直接將細(xì)胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)1224小時后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。加入的培養(yǎng)液的量依凍存的細(xì)胞數(shù)量，如果凍存數(shù)量為106，則稀釋10倍使細(xì)胞達(dá)到105即可。注意事項在細(xì)胞復(fù)蘇操作時，應(yīng)注意融化凍存細(xì)胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段(-50)。這樣復(fù)蘇的凍存細(xì)胞存活率高，生長及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細(xì)胞還受其他因素的影響，有時也會有部分細(xì)胞死亡。此時，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上(已死亡)的細(xì)胞輕輕倒掉，再補以

6、適量的新培養(yǎng)液，也會獲得較為滿意的結(jié)果。二、細(xì)胞維持培養(yǎng)（細(xì)胞換液培養(yǎng)）、培養(yǎng)選拔常規(guī)觀察 (一)原代細(xì)胞的維持1、貼壁細(xì)胞（包括半貼壁細(xì)胞的換液） 一般三天后組織塊周圍即可見梭形細(xì)胞長出。第三天換液一次，其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量完全培養(yǎng)基。若希望細(xì)胞能在較長時間內(nèi)能維持存活，但不需增殖，此時要換成含2%小牛血清的維持液。 待不同組織塊周圍的細(xì)胞連接成片時即可傳代。2、懸浮細(xì)胞 凡經(jīng)培養(yǎng)后只在細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮生長而不貼壁的細(xì)胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細(xì)胞的形態(tài)和生長現(xiàn)象，淋巴細(xì)胞的短期培養(yǎng)無需換液，但加入生長因子或有絲分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM

7、、LPS等）后，細(xì)胞不僅會發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求，加之代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，細(xì)胞不適宜生長，需進(jìn)行換液。白血病細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞體外長期培養(yǎng)時，都需換液培養(yǎng)，待達(dá)到飽和密度時才能傳代。換液時，只能采用半量換液的方式，千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進(jìn)行換液。 半量換液的方法如下： 將原培養(yǎng)瓶豎起，在30分鐘內(nèi)，若細(xì)胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去，再加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基。若細(xì)胞不能沉于瓶底，可吸出細(xì)胞懸液，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基，混勻后再轉(zhuǎn)入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。 （二）傳代細(xì)

8、胞維持培養(yǎng)：同上（三）培養(yǎng)選拔常規(guī)觀察：1.培養(yǎng)液 2.細(xì)胞生長情況 3.細(xì)胞形態(tài)變化 4.污染情況三、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：(1)棄舊培養(yǎng)液：吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。 (2)漂洗：每瓶加入2mL，無鈣、鎂PBS或HANKS液，漂洗貼壁細(xì)胞一次后倒掉。（可以省略） (3)消化：每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面，在倒置顯微鏡下待1/2細(xì)胞變園后加適量完全培養(yǎng)液終止?；蚣?xì)胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時，倒掉消化液，再繼續(xù)作用23分鐘，輕輕搖動，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落

9、下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時應(yīng)立即終止消化）。在37°或25°以上環(huán)境進(jìn)行消化。 (4)終止：加入完全培養(yǎng)基適量（通常10-20%胎牛血清培養(yǎng)基）5ml，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，吹打時要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機械損傷。 (5)離心：離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞（5-10分鐘），去除培養(yǎng)基（含胰酶及EDTA）。(6)計數(shù)：離心前先滴好計數(shù)板待計數(shù)，計算細(xì)胞的濃度。(7)傳代或凍存：離心后用完全培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)（可1:3至1:5傳代，在25cm2的培

10、養(yǎng)瓶中長滿細(xì)胞可達(dá)5*106/ml，經(jīng)10倍稀釋每瓶達(dá)105/ml即可，25cm2的培養(yǎng)瓶每瓶5ml培養(yǎng)液）?；蛴脙龃嬉赫{(diào)整濃度（一般達(dá)1*107）凍存。（ 到此步時經(jīng)證實未被細(xì)菌或真菌污染，則撤去抗生素，以免對細(xì)胞的生長長生不利影響，指原代培養(yǎng)細(xì)胞）四細(xì)胞凍存：細(xì)胞凍存液：20% 小牛血清 10% 二甲基亞砜DMSO 70% 培養(yǎng)液或，10% 二甲基亞砜DMSO 90% 小牛血清操作步驟：選對數(shù)增生期細(xì)胞（證明無支原體污染），在凍存前一天換液。按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制成懸液，計數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)5*107/ml左右，離心，去上清液。（凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，密度達(dá)5*107/ml，在溶后稀釋20倍時

11、，仍能保持5*105ml數(shù)量）。一般25cm2的培養(yǎng)瓶滿瓶才達(dá)到105.加入配置好的凍存液，與去上清液相同的量一滴一滴的加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。凍存細(xì)胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10%二甲亞砜(DMSO)或甘油，可使冰點降低，使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。（細(xì)胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO和90-95%原來的細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意由于DMSO稀釋時會釋放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成）分裝于無菌凍存管中，每管1.5ml懸液。旋好凍存管并仔細(xì)檢查，一定要蓋緊，做好標(biāo)志。凍存：冰箱4放2小時，-75過夜，轉(zhuǎn)

12、液氮保存，4°，0°，-20°各30分鐘（現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)P647），最后直接放入液氮中保存或-80°冰箱保存。附件一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀況觀察（一）細(xì)胞計數(shù)操作規(guī)程胎盤藍(lán)法原理：（產(chǎn)品批號：T8154，T6146和Z35,9629）使用胎盤藍(lán)染色決定血細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞數(shù)目，胎盤藍(lán)是用于染色的多種染料中能被活細(xì)胞排斥的一種染料，這種方法的成立是基于活細(xì)胞不能被染色：胎盤藍(lán)對血清蛋白比細(xì)胞蛋白有一種更強的親和力，如果背景太深，在計數(shù)之前細(xì)胞應(yīng)成球狀并重懸在無蛋白的培養(yǎng)基或鹽液中。方法：1、預(yù)先在平衡鹽液中懸浮細(xì)胞（例如：Hanks平穩(wěn)鹽液HBSS，產(chǎn)品

13、批號：H2513）2、取0.5ml0.4%胎盤藍(lán)于一試管中，加0.3ml（HBSS和0.2ml細(xì)胞懸液（稀釋倍數(shù)5）并且混勻，允許放置515分鐘。注意：如果細(xì)胞在胎盤藍(lán)中暴露時間過長，活細(xì)胞也會像死細(xì)胞一樣被染上色。3、在血細(xì)胞計數(shù)板上蓋上蓋玻片，使用巴斯德毛細(xì)吸管或其它合適的器材取少量的胎盤藍(lán)細(xì)胞懸液于血細(xì)胞計數(shù)板上的兩個小室中。將巴斯德毛細(xì)吸管小心的靠在蓋玻片邊緣，利用毛細(xì)張力充滿小室，不要過度或過少充盈。1）從血細(xì)胞計數(shù)板的一個小室開始，計數(shù)中間和四角邊長/mm的正方形中的所有細(xì)胞數(shù)（詳見sigmaP1845的圖樣I）死細(xì)胞被染成藍(lán)色，分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)。注意：壓線細(xì)胞的計數(shù)原則，

14、數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右（詳見sigmaP1845的圖II）2）重復(fù)上述步驟計數(shù)第2個小室注意：如果超過10%的細(xì)胞成串，應(yīng)重復(fù)全部程序通過吹打務(wù)必使細(xì)胞在原液中和在胎盤藍(lán)細(xì)胞懸液中一樣分散，如果在10個正方形方格中細(xì)胞數(shù)少于200個或多于500個（2050個細(xì)胞/正方形）應(yīng)重復(fù)這個步驟，以調(diào)節(jié)細(xì)胞稀釋倍數(shù)。3）準(zhǔn)備第二份樣品并重新計數(shù)以保證準(zhǔn)確4）細(xì)胞計數(shù)血細(xì)胞計數(shù)板上蓋好蓋玻片的每個正方形（指中央大方格，其長度寬度均為1mm的正方形，與蓋玻片的距離為0.1mm），總體積為0.1mm3或10-4cm3。若1cm3近仍等于1ml，那么每毫升中集中的細(xì)胞數(shù)（和細(xì)胞總數(shù)）則可以這樣來計算。每毫升細(xì)胞

15、數(shù)每個正方形的平均細(xì)胞數(shù)´稀釋倍數(shù)´104（10個正方形的細(xì)胞計數(shù)）例：如果每個正方形的平均細(xì)胞數(shù)是45´5´1042.25´106個細(xì)胞/ml總細(xì)胞數(shù)每毫升細(xì)胞數(shù)´最初的細(xì)胞樣品的體積例：2.25´106 (個細(xì)胞/ml) ´10ml（最初體積）2.25´107個細(xì)胞（總細(xì)胞）5）活細(xì)胞比例（%）總的活細(xì)胞數(shù)（沒染上色的）¸總的細(xì)胞（染上色的和沒染上色的）´100例：如果每個正方形中沒染上色的（活的）細(xì)胞平均數(shù)是37.5，總活細(xì)胞數(shù)(37.5´5´104)活細(xì)胞數(shù)

16、/ml´10ml（最初體積）1.875´107個活細(xì)胞，活細(xì)胞比率（%）1.875´107（活細(xì)胞數(shù)）¸2.25´107(總細(xì)胞數(shù)) ´10083%.血球計數(shù)板的使用16×25型的計數(shù)板 將計數(shù)室放大，可見它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四個中方格（100個小方格）計數(shù)（見圖二）。將每一中格放大，可見25個小格。計數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計數(shù)完畢后，依下列公式計算：酵母細(xì)胞個數(shù)1mL=100個小方格細(xì)胞總數(shù)/ 100 ×400×10000×稀釋倍數(shù)或：4個中格的細(xì)胞數(shù)/4×

17、16×10000×稀釋倍數(shù)有一種計數(shù)板的結(jié)構(gòu)為25×16，計算如下：4個中格的細(xì)胞數(shù)/4×25×10000×稀釋倍數(shù)（二）.細(xì)胞生長曲線（細(xì)胞貼壁率、細(xì)胞分裂率：略）概念：細(xì)胞生長曲線是測定細(xì)胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長，進(jìn)入平頂期，然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個過程中細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)變化，典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，斜率較大的指數(shù)生長期，呈平

18、臺狀的平頂期及退化衰亡4個部分。以存活細(xì)胞數(shù)(萬mL)對培養(yǎng)時間(h或d)作圖，即得生長曲線。方法：計數(shù)法：1取生長良好接近匯合的細(xì)胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計數(shù)(見四、細(xì)胞傳代培養(yǎng)的實驗步驟)。如是非粘壁細(xì)胞，則離心棄舊培養(yǎng)基后，換上一定量的新鮮培養(yǎng)基然后制成細(xì)胞懸液計數(shù)。 2根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果按每個小方瓶5×104mL作傳代培養(yǎng)接種細(xì)胞，共接種21瓶細(xì)胞。324 h后開始計數(shù)細(xì)胞，以后每隔24 h計數(shù)一次，每次取3瓶細(xì)胞，分別進(jìn)行計數(shù)。計算平均值。連續(xù)計數(shù)7 d。 4根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)mL)為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。 MTT法：1制備1

19、 mL細(xì)胞懸液。空白對照以1 mL培養(yǎng)基代替細(xì)胞懸液。加入01 mL MTT于37孵育4 h。使MTT還原為藍(lán)紫色甲月贊結(jié)晶。 2加1 mL DTW脫色液，37至少靜置30 min(甚至過液)，使甲質(zhì)顆粒充分溶解。 3吸取200 L該溶解液至96孔板孔中，在酶標(biāo)儀上讀取OD值，檢測波長570 nm，參考波長630 nm。 4每隔24 h測量一個點，每個點為3個平行樣品的平均值。CCK-8法：略CCK-8法的優(yōu)點： 1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機溶劑； 2、CCK-8法能快速檢測； 3、CK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度； 4、CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于M

20、TT法； 5、CCK-8法對細(xì)胞毒性?。?6、CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。 CCK-8法的缺點: 1、與MTT法相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。 2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。（三）.活選細(xì)胞觀察：相差倒置顯微鏡使用：略附件二：細(xì)胞裂解液：提取RNA用0.5% SDS 0.1mmol/L EDTA(PH8.0) 10 mmol/L Tris.cl(PH8.0) 20 ug/ml RNaseTE:RNA、DNA溶解用1mmol/L EDTA(PH8.0) 10 mmol/L Tris.cl(PH8.

21、0)附件三.IC50半抑制率實驗：MTT法：MTT原理、步驟、結(jié)果分析方法及注意事項：MTT全稱為3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長

22、處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。 缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4 避光保存即可

23、。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4ºC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成

24、的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60水浴助溶。PBS配方：Nacl 8gKcl 0.2g Na2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4定容1LMTT法實驗步驟貼壁細(xì)胞：1、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2.、5%CO2，37孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但

25、我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況3.、5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶

26、解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）懸浮細(xì)胞：1、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)⒀a足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測物10ul；細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100ml 1640）。2、置37，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

27、（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。5、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。注意事項：（1）選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。（2）避免血清干擾：一般選小于10的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。（3）設(shè)空

28、白對照：與試驗平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。（4）MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系，IC50是半抑制率：一定濃度的某種藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度. IC50值可以用來衡量藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，即誘導(dǎo)能力越強，該數(shù)值越低,當(dāng)然也可以反向說明某種細(xì)胞對藥物的耐受程度。意思是抑制率50的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！舉個例子：各組濃度

29、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 計算公式：Pm=0.95，Pn=0.06，P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1，lgI=lg0.1/0.01=1，lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025 有一個公式可供參考;lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應(yīng)

30、率之和Pm:最大陽性反應(yīng)率Pn:最小陽性反應(yīng)率抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率 例：用96孔板培養(yǎng)SMMC-7721肝癌做MTT測細(xì)胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少MTT和DMSO合適?根據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測定一般每孔4000個細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。一般要低于IC50，避免非

31、調(diào)亡性殺傷的細(xì)胞太多，造成流式細(xì)胞儀檢測碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用時間為36h。一般腫瘤細(xì)胞系空白處理的調(diào)亡率應(yīng)低于1%，用藥后一般為5-10%（Annexin V），細(xì)胞周期的亞G0峰比較明顯。培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇n Polge等人（1949）發(fā)現(xiàn)了甘油對低溫下貯存的細(xì)胞具有保護作用，。接下來的重大進(jìn)展是Luyet（1951）與Lovelock（1953）等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)了電解質(zhì)濃度對貯存細(xì)胞的損傷作用。他們的結(jié)論是，電解質(zhì)濃度增大是造成貯存細(xì)胞損傷的主要原因。1949年至1960年這一段時間可以稱為冷凍保存的“甘油時期”，這一時期對生物材料的冷凍保存一般都是以甘油作

32、為保護劑。Lovelock（1959）等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護劑，這就是人們熟悉的二甲基亞砜（DMSO）。n 冷凍保存與復(fù)蘇原理 在低于-700C的超低溫條件下，有機體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。水在低于零度的條件下會結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲

33、漏，在復(fù)溫時，大量水分會因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常

34、的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護劑對細(xì)胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。 冷凍速率 冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細(xì)胞在冷凍過程中會發(fā)生如下變化：當(dāng)細(xì)胞被冷至-50C時，因溶液中加有冷凍保護劑而降低溶液的冰點，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷至-5-150C之間時，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是，細(xì)胞內(nèi)水分子為了和細(xì)胞外水分子保持化學(xué)能的平衡，會向細(xì)胞外流動。冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向外流動的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多

35、，細(xì)胞脫水，體積縮小，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不會發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰；如果冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯瑒t細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）。不同的冷凍速度既然能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對細(xì)胞產(chǎn)生不同的損傷。當(dāng)冷凍速度過慢時，細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過一定程度時即失去活性。同時冷凍速度過慢，還會引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過快時，細(xì)胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較多冰晶，造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。超快速

36、玻璃化冷凍對細(xì)胞存活來說是最為理想的冷凍方法。細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細(xì)胞膜和細(xì)胞器不致造成損傷，細(xì)胞也不會在高濃度的溶質(zhì)中長時間暴露而受損。 不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、人紅細(xì)胞的最適冷凍速率分別為1.60C/min、70C/min和2000C/min。細(xì)胞與細(xì)胞之間的最適冷凍速率可在1.60C3000C/min，故對一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前，首先需要測定其最適冷凍速率，以保證獲得最高的冷凍存活率。 冷凍保存溫度 冷凍保存溫度是指能長期保存細(xì)胞的超低溫度，在此溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止，但經(jīng)過長期保存，在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功

37、能。 但從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度（-1960C）是 目前最佳的冷凍保存溫度。在-1960C時，細(xì)胞的生命活動幾乎完全停止，但復(fù)蘇后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍過程得當(dāng)，一般生物樣品在-1960C下均可保存十年以上。應(yīng)用-700C-800C保存細(xì)胞，短期內(nèi)對細(xì)胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細(xì)胞存活率明顯降低。在冰點到-400C范圍內(nèi)保存細(xì)胞的效果不佳。復(fù)蘇速率 冷凍保護體外培養(yǎng)物，除了必須有最佳的冷凍速率、合適的冷凍保護劑和凍存溫度外，在復(fù)蘇時也必須有最佳的復(fù)溫速率，這樣才能保證最后獲得最佳冷凍保存效果。 復(fù)溫速率是指在細(xì)胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。復(fù)溫速率不當(dāng)也會降低凍存細(xì)胞存

38、活率。一般來說，復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在370C水浴中，于1-2分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過慢，細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。復(fù)溫時造成的細(xì)胞損傷非?？欤跇O短的時間內(nèi)發(fā)生。 冷凍保護劑 冷凍保護劑是指可以保護細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護劑常常配制成一定的溶液。一般來講，只有紅細(xì)胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳動物細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護劑的水或簡單的鹽溶液中，并以最適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對于大多數(shù)有核哺乳動物細(xì)胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護劑的平衡鹽溶液中，并以0.

39、36000C/min的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細(xì)胞會死亡；而加入甘油冷凍保護劑進(jìn)行冷凍保存時，98%以上的細(xì)胞都可存活。 冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護機制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時，細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等成分滲透

40、到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護作用。目前DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對細(xì)胞的毒性作用較大，而在40C時，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。所以，凍存時DMSO平衡多在40C下進(jìn)行，一般需要4060分鐘。 非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護機制的假說很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從

41、而減輕溶質(zhì)損傷。 不同的冷凍保護劑有不同的優(yōu)、缺點。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護劑組成保護液。由于許多冷凍保護劑（如DMSO）在低溫下能保護細(xì)胞，但在常溫下卻對細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫后應(yīng)及時洗滌冷凍保護劑。 n 冷凍保存方法 按照冷凍保護液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-700C-800C，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是利用電子計算機程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用

42、多種高濃度的冷凍保護劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護液保護懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒有冰晶的形成。但目前細(xì)胞凍存最常用的仍是前一種方法。 非玻璃化凍存方法 ² 主要材料 （1）儀器設(shè)備：普通冰箱、-300C低溫冰箱和-700C-800C超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機、電子計算機程控降溫儀等； （2）凍存管：容量為1ml或1.5ml； （3）冷凍保護液：一般是以9份小牛血清或細(xì)胞培養(yǎng)液與1份DMSO混合而成。現(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后防入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解； （4）待凍存細(xì)胞：各種腫瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。 ² 操作過程

43、1. 待凍存細(xì)胞懸液的制備 (1) 按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備單細(xì)胞懸液，并計算細(xì)胞總數(shù)； (2) 將細(xì)胞懸液以8001000r/min離心5min，去上清夜； (3) 向細(xì)胞沉淀物中加入冷凍保護液，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞密度達(dá)1×1061×107個/ml； (4) 按每管11.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋； (5) 再凍存管上做好標(biāo)記，包括細(xì)胞代號及凍存日期。 2. 分級冷凍 (1) 先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（480C），約40min； (2) 接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-100C-200C），約3060min； (3) 將凍存管轉(zhuǎn)入低溫

44、冰箱（-300C），放置30min左右； (4) 然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（-700C-800C），過夜； (5) 最后將凍存管投入液氮保存。 3. 記錄 做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。 凍存結(jié)果 如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上。 討論 在使用DMSO前，不要對其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制時最好帶手套。 在將細(xì)胞凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對皮膚造成凍傷。操作過程中最

45、好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。 應(yīng)注意控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細(xì)胞具有高活力，還要確保無微生物污染，這樣的細(xì)胞才具有凍存價值。另外，在每批細(xì)胞凍存一段時間后，要復(fù)蘇12管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因為在復(fù)蘇時，需要從-1960C的液氮中取出凍存管，立即投入37400C溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險。 玻璃化凍存方法² 主要材料 （1）冷凍保護液：為Hanks平衡鹽溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用。 （2）凍存管：SILASTIC玻璃小管，內(nèi)徑3mm，外徑4.5mm； （3）設(shè)備：液氮儲存罐； （4）待凍存細(xì)胞：人類外周血單核細(xì)胞。