非洲豬瘟PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)方案參考

1、非洲豬瘟PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)方案參考非洲豬瘟病毒在入侵中國(guó)以來(lái)，中國(guó)的生豬產(chǎn)業(yè)鏈各個(gè)環(huán)節(jié)都受到很多影響，非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)建設(shè)迫在眉睫。首先，生豬生產(chǎn)企業(yè)需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。通過(guò)檢測(cè)豬的血清或唾液或環(huán)境土壤來(lái)判斷非洲豬瘟是否感染，通過(guò)豬場(chǎng)生物安全管理來(lái)截?cái)喾侵挢i瘟傳播，為豬場(chǎng)的順利生產(chǎn)提供安全保障。其次，定點(diǎn)屠宰企業(yè)需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。通過(guò)屠宰場(chǎng)場(chǎng)外檢測(cè)，排除非洲豬瘟感染的生豬進(jìn)入場(chǎng)內(nèi)，通過(guò)屠宰企業(yè)內(nèi)部實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)防止有非洲豬瘟感染的豬肉流入市場(chǎng)，檢測(cè)加工好的肉制品或分割肉來(lái)防止肉類(lèi)加工食品流入市場(chǎng)，避免企業(yè)受到不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。第三，各級(jí)畜牧局需要建立標(biāo)

2、準(zhǔn)化的非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，來(lái)加強(qiáng)生豬養(yǎng)殖企業(yè)、生豬屠宰企業(yè)的管理，加強(qiáng)非洲豬瘟的防控。第四，肉類(lèi)加工企業(yè)需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。肉類(lèi)加工企業(yè)，只要需要豬肉就需要檢測(cè)進(jìn)場(chǎng)豬肉的非洲豬瘟檢測(cè)項(xiàng)目，防止有感染非洲豬瘟的肉品流入企業(yè)生產(chǎn)線，防止生產(chǎn)線被非洲豬瘟病毒污染，保障企業(yè)的利益不受影響。一、什么是PCR實(shí)驗(yàn)室PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)的簡(jiǎn)稱(chēng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)也能夠當(dāng)作一項(xiàng)極其重要的酶促合成DNA技術(shù)。PCR又稱(chēng)為無(wú)細(xì)胞克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新，它可將極微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍。聚

3、合酶鏈反應(yīng)（PCR）是在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNAo可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等很多方面。一對(duì)合成DNA的引物經(jīng)過(guò)高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍，一般樣品是經(jīng)過(guò)30次循環(huán)，最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍；將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)漠化乙錠染色，在紫外燈照射下肉眼能見(jiàn)到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。二、PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：1、非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的

4、選址：符合國(guó)家檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)規(guī)定，具體適用于屠宰場(chǎng)來(lái)說(shuō)，可選擇辦公樓或者獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室空間，選址絕對(duì)不能和屠宰線相通，如果實(shí)驗(yàn)室陽(yáng)性對(duì)照污染，會(huì)污染整個(gè)屠宰生產(chǎn)線，勢(shì)必對(duì)屠宰場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。個(gè)別不專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建造公司因?yàn)椴涣私夥侵挢i瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)流程，造成設(shè)計(jì)布局不合理，對(duì)后期開(kāi)展工作造成很大的不便及生物安全隱患。2、主體結(jié)構(gòu)：當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室的主體多為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽(yáng)角均釆用鋁合金R50內(nèi)角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問(wèn)題。并且彩鋼板結(jié)構(gòu)牢固，線條簡(jiǎn)明，美觀大方，密封性好。3、標(biāo)準(zhǔn)的四區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：將PCR過(guò)程分成試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備和PCR擴(kuò)增區(qū)及產(chǎn)

5、物分析檢測(cè)區(qū)四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)。整個(gè)區(qū)域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時(shí)各區(qū)通過(guò)氣壓調(diào)節(jié)，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染。另外：PCR實(shí)驗(yàn)室根據(jù)使用儀器的功能合理設(shè)置各個(gè)工作區(qū)域，如采用聚合酶聯(lián)反應(yīng)：則設(shè)置試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域，這是最常用的分區(qū)方式。樣品需要粉碎處理的，還需增設(shè)樣品粉碎區(qū)；若使用實(shí)時(shí)熒光PCR法：基因擴(kuò)增區(qū)、基因產(chǎn)物分析區(qū)能夠合并在一個(gè)房間內(nèi)；釆用標(biāo)本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)為一體的全自動(dòng)化PCR分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并為一個(gè)區(qū)域，所以

6、PCR實(shí)驗(yàn)室原則上設(shè)置五個(gè)區(qū)或四個(gè)區(qū)或三個(gè)區(qū)或二個(gè)單獨(dú)的工作區(qū).核酸擴(kuò)增前區(qū)和核酸擴(kuò)增后區(qū)可設(shè)在一個(gè)房間內(nèi)，但必須在滿(mǎn)足下列要求的前提下：a. 核酸擴(kuò)增前區(qū)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)設(shè)置兩個(gè)不同位置的實(shí)驗(yàn)區(qū)，試劑配置在超凈工作臺(tái)中操作，樣品處理在生物安全柜內(nèi)操作。b. 在核酸擴(kuò)增后區(qū)使用全封閉的擴(kuò)增和檢測(cè)系統(tǒng)，如實(shí)時(shí)熒光PCR儀等。c. 每個(gè)實(shí)驗(yàn)人員使用各自的試劑、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。d. 在實(shí)驗(yàn)前后對(duì)操作區(qū)域和共享器具進(jìn)行清潔及消毒。e. 各區(qū)域的試劑、器具、儀器和設(shè)備為該區(qū)專(zhuān)用，不得交叉使用。4、非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的布局：非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室用的儀器為熒光定量PCR,所以核酸擴(kuò)增和分析在一個(gè)區(qū)，實(shí)

7、驗(yàn)室設(shè)計(jì)需要如下功能房間：PCR緩存走廊、帶緩存間的配液室、帶緩存間的樣品處理室、帶緩存間的核酸擴(kuò)增分析區(qū)及實(shí)驗(yàn)室用具消毒室。5、非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全保護(hù)：理論上講非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室是BSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室，需要配置二級(jí)生物安全柜，推薦選擇70%外排，30%內(nèi)循環(huán)，各功能房間緩存設(shè)置更衣柜和消毒器，各區(qū)的實(shí)驗(yàn)服專(zhuān)用，物料流通需要配置帶紫外線的互鎖的傳遞窗，實(shí)行人流物流分開(kāi)設(shè)置。6、非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室消毒：在三個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)和三個(gè)緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試新準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū)還設(shè)置移動(dòng)紫外線燈，對(duì)實(shí)驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒。7、非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗：試劑和標(biāo)

8、本通過(guò)機(jī)械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過(guò)程中不受污染（人物分流）。8、非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室地面地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒(méi)有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mmx800mm）接縫需要小于2mm。9、非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室照明燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。PCR實(shí)驗(yàn)室布局PCR走廊及緩存間傳遞窗及觀察窗三、空氣流與壓差要求PCR實(shí)驗(yàn)室的空氣流向必須嚴(yán)格按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)-標(biāo)本制備區(qū)一擴(kuò)增區(qū)一擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)空氣壓力逐漸遞減方式進(jìn)行，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域。風(fēng)速流向

9、不得混亂。為了保證房間內(nèi)的壓差和避免污染，應(yīng)在空調(diào)面板處寫(xiě)清楚送風(fēng)機(jī)和排風(fēng)機(jī)的開(kāi)啟順序和關(guān)閉順序，先后順序不得混亂。空氣潔凈級(jí)別不同的相鄰房間之間的靜壓差應(yīng)大于5帕，潔凈室（區(qū)）與室外大氣的靜壓差應(yīng)大于10帕，應(yīng)配備監(jiān)測(cè)靜壓差的設(shè)備，并定期監(jiān)控。一般情況下，試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染；能夠通過(guò)控制進(jìn)風(fēng)風(fēng)量大于排風(fēng)風(fēng)量達(dá)到正壓效果。核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負(fù)壓，以防含核酸的氣溶膠擴(kuò)散出去污染試劑與樣品，能夠通過(guò)控制排風(fēng)風(fēng)量大于進(jìn)風(fēng)風(fēng)量達(dá)到負(fù)壓效果。在理想情況下，PCR實(shí)驗(yàn)室緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。PCR實(shí)

10、驗(yàn)室進(jìn)風(fēng)由原有中央空調(diào)控制的要求將中央空調(diào)風(fēng)口安裝到指定定點(diǎn)。四、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施要求：實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施設(shè)計(jì)：包括實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)裝修、實(shí)驗(yàn)室凈化工程、實(shí)驗(yàn)室供排水工程、實(shí)驗(yàn)室電路系統(tǒng)。1）實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)裝修需要潔凈天花、地板、隔斷，合理設(shè)置緩存間及配置凈化門(mén)、觀察窗、傳遞窗等。2）實(shí)驗(yàn)室凈化工程實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備單獨(dú)送排風(fēng)設(shè)施，試劑配置區(qū)、核酸提取區(qū)和擴(kuò)增分析區(qū)應(yīng)配備凈化系統(tǒng)。3）實(shí)驗(yàn)室供排水工程包括非手動(dòng)水龍頭、不銹鋼或PP水池和緊急淋浴器及供排水管線管路。4）實(shí)驗(yàn)室電路系統(tǒng)：根據(jù)儀器的功率配置合適的功率，特別注意高壓滅菌鍋的功率，注意實(shí)驗(yàn)室用電安全。5）配備適用的應(yīng)急器材，如應(yīng)急照明設(shè)備、消防器材、意外事故處理

11、器材等。五、實(shí)驗(yàn)室儀器及設(shè)備1）更衣室儀器及設(shè)備：更衣柜或掛衣架、鞋柜以及消毒器和烘干器。2）配液室儀器及設(shè)備：佰倫超凈工作臺(tái)、冰箱、小型離心機(jī)、旋渦振蕩器、微量移液器等。3）樣品處理室儀器及設(shè)備：離心機(jī)、組織研磨機(jī)、II級(jí)生物安全柜、恒溫水浴鍋、冰柜等、可移動(dòng)紫外消毒器。4）核酸提取室儀器及設(shè)備：核酸提取儀、II級(jí)生物安全柜、恒溫水浴鍋、小型離心機(jī)、微量移液器、可移動(dòng)紫外消毒器等。5）擴(kuò)增分析區(qū)儀器及設(shè)備：熒光定量PCR儀、電腦、打印機(jī)、不間斷電源、可移動(dòng)紫外消毒器等。6）消毒洗滌室：高壓滅菌器、干燥箱、器皿柜等。（一般配置參考）實(shí)時(shí)熒光定量PCR生物安全柜六、實(shí)驗(yàn)室面積及設(shè)備間距一般來(lái)說(shuō)各

12、房間的面積沒(méi)有嚴(yán)格要求，只需能放置所需儀器設(shè)備，并且便于人員操作即可，但是有生物安全柜的房間面積不能小于10平米，并且每增加一臺(tái)生物安全柜，房間就要增加10平米。各實(shí)驗(yàn)室緩沖間的面積一般為1300*（1300或1500）mm為宜，并且緩沖間的面積不能大于實(shí)驗(yàn)室房間面積的l/8o在做平面設(shè)計(jì)的時(shí)候，首先要考慮的因素是就是“安全”，實(shí)驗(yàn)室是最易發(fā)生爆炸、火災(zāi)、毒氣泄露等的場(chǎng)所。我們?cè)谧銎矫嬖O(shè)計(jì)的時(shí)候，應(yīng)盡量地要保持實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)流暢、逃生通道暢通。根據(jù)國(guó)際人體工程學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。我們做如下的劃分以供參照：實(shí)驗(yàn)臺(tái)與實(shí)驗(yàn)臺(tái)通道劃分標(biāo)準(zhǔn)（通道間隔用L表示）L>500mm時(shí)，一邊可站人操作；L>800

13、mm時(shí)，一邊可坐人操作；L>1200mm時(shí)，一邊可坐人，一邊可站人，中間不可過(guò)人；L>1500mm時(shí)，兩邊可坐人，中間可過(guò)人；L>1800mm時(shí)，兩邊可坐人，中間可過(guò)人可過(guò)儀器天平臺(tái)、儀器臺(tái)不宜離墻太近，離墻400mm為宜。為了在工作發(fā)生危險(xiǎn)時(shí)易于疏散，實(shí)驗(yàn)臺(tái)間的過(guò)道應(yīng)全部通向走廊。另：實(shí)驗(yàn)室建筑層高宜為3.7米.4.0米為宜，凈高宜為2.7米.2.8米，有潔凈度、壓力梯度、恒溫恒濕等特殊要求的實(shí)驗(yàn)室凈高宜為2.5米.2.7米（不包括吊頂）；實(shí)驗(yàn)室走廊凈寬宜為2.5米-3.0米.普通實(shí)驗(yàn)室雙門(mén)寬以1.1米.1.5米（不對(duì)稱(chēng)對(duì)開(kāi)門(mén)）為宜，單門(mén)寬以0.8米.0.9米為宜。七、潔凈

14、裝修要求潔凈室（區(qū)）的內(nèi)表面應(yīng)平整光滑、無(wú)裂縫、接口嚴(yán)密、無(wú)顆粒物脫落，并能耐受清洗和消毒，墻壁與地面的交界處宜成弧形或釆取其他措施，以減少灰塵積聚和便于清潔潔凈室（區(qū)）內(nèi)各種管道、燈具、風(fēng)口以及其他公用設(shè)施，在設(shè)計(jì)和安裝時(shí)應(yīng)考慮使用中避免出現(xiàn)不易清潔的部位。潔凈室（區(qū)）的窗戶(hù)、天棚及進(jìn)入室內(nèi)的管道、風(fēng)口、燈具與墻壁或天棚的連接部位均應(yīng)密封。八、人流路徑與物流路徑進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室區(qū)域工作人員應(yīng)該按照以下路徑：公共清潔區(qū)更衣間（更換潔凈服）緩沖間污染實(shí)驗(yàn)區(qū)工作人員退出實(shí)驗(yàn)室的路徑為：污染試驗(yàn)區(qū)一緩沖間一淋浴間（有條件的可設(shè)置）-更衣間公共清潔區(qū)所有的物品進(jìn)入實(shí)驗(yàn)區(qū)必須經(jīng)過(guò)雙扉互鎖傳遞窗，利用傳遞窗消毒

15、后才可進(jìn)入，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有物品的也必須經(jīng)過(guò)傳遞窗才能夠傳遞到實(shí)驗(yàn)室以外的清潔公共區(qū)。門(mén)的開(kāi)啟方向?qū)嶒?yàn)室建筑層高宜為3.7米.4.0米為宜，PCR實(shí)驗(yàn)室凈高宜為2.5米.2.7米（不包括吊頂）；實(shí)驗(yàn)室走廊凈寬宜為2.5米.3.0米.普通實(shí)驗(yàn)室雙門(mén)寬以1.1米-1.5米（不對(duì)稱(chēng)對(duì)開(kāi)門(mén)）為宜,單門(mén)寬以0.8米.0.9米為宜。一般實(shí)驗(yàn)室門(mén)主要向里開(kāi)，但如有危險(xiǎn)的房間，房門(mén)應(yīng)朝外開(kāi)，房門(mén)材質(zhì)最好選擇壓力玻璃。有壓差梯度的房間，門(mén)的開(kāi)啟方向應(yīng)朝向正壓方向一側(cè)開(kāi)啟；考慮到消防安全，對(duì)于那些主要逃生門(mén)的開(kāi)啟方向應(yīng)朝向清潔區(qū)方向開(kāi)啟。九、工作服要求在凈化車(chē)間內(nèi)工作的人員應(yīng)穿著符合要求的工作服。工作服的選材、式樣及穿戴方式應(yīng)與生產(chǎn)操作和空氣潔凈度級(jí)別要求相適合，并不得混用。潔凈工作服的質(zhì)地應(yīng)光滑、不產(chǎn)生靜電、不脫落纖維和顆粒性物質(zhì)。無(wú)