DNA的測(cè)序方法、原理及其應(yīng)用ppt課件

1、DNA的測(cè)序方法、原理及其應(yīng)用一、一、DNA序列測(cè)定概述及其發(fā)展序列測(cè)定概述及其發(fā)展 即即核酸核酸DNADNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項(xiàng)分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項(xiàng)重要的技術(shù)重要的技術(shù)。 1963年，年，Sanger和和Thompson等人第一次完成胰島素等人第一次完成胰島素51個(gè)個(gè)氨基酸的序列測(cè)定，這在當(dāng)時(shí)來說是一件了不起的大事。氨基酸的序列測(cè)定，這在當(dāng)時(shí)來說是一件了不起的大事。70年代后期，年代后期，Sanger和和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序等人又建立了核酸序列測(cè)定的方法，列測(cè)定的方法，Sanger雙脫氧末端終止法和雙脫氧末端終止法和Maxam-

2、Gilbert化學(xué)裂解法將核酸序列測(cè)定技術(shù)推進(jìn)到化學(xué)裂解法將核酸序列測(cè)定技術(shù)推進(jìn)到“直讀直讀”階段，階段，使核酸序列測(cè)定變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測(cè)定容易，這樣使核酸序列測(cè)定變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測(cè)定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。列。二、測(cè)序的常用方法二、測(cè)序的常用方法DNA序列測(cè)定常用方法有如下3種： 1、末端終止法2、化學(xué)裂解法3、DNA測(cè)序自動(dòng)化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長(zhǎng)度僅相差1個(gè)核苷酸的ssDNA，從而完成測(cè)序的方法。用

3、化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長(zhǎng)度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出。優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對(duì)寡核苷酸測(cè)序。1、高負(fù)荷，1塊膠可測(cè)16個(gè)樣品；2、機(jī)讀不需放射自顯影；3、安全不用同位素；4、簡(jiǎn)單迅速8-10h。 1）雙脫氧鏈終止法測(cè)序雙脫氧鏈終止法測(cè)序(the chain termination method) 基本原理： 通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測(cè)DNA分子的順序。用于終止

4、反應(yīng)的雙脫氧核苷酸： 將2 ，3 雙脫氧核苷酸（ddNTP）參入到新合成的DNA鏈中，由于參入的ddNTP缺乏3 羥基，因此不能與下一位核苷酸反應(yīng)形成磷酸二酯鍵，DNA合成反應(yīng)將中止。O堿基堿基CPOH12345O堿基堿基CPHH12345H2O脫氧核苷酸的連接脫氧核苷酸的連接O堿基堿基CPHH12345O堿基堿基CPOHH12345OHX雙脫氧核苷酸雙脫氧核苷酸?2）Maxam-Gilbert 化學(xué)降解法測(cè)序化學(xué)降解法測(cè)序基本原理：基本原理： 用放射性核素標(biāo)記待測(cè)用放射性核素標(biāo)記待測(cè)DNA一側(cè)末端一側(cè)末端 將標(biāo)記將標(biāo)記DNA分為分為G、A+G、C+T、C 4個(gè)反應(yīng)體系個(gè)反應(yīng)體系 用不同的化學(xué)

5、試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機(jī)斷裂用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機(jī)斷裂DNA片段某種堿基中的任何一個(gè)，產(chǎn)生一組一端為放射線標(biāo)記片段某種堿基中的任何一個(gè)，產(chǎn)生一組一端為放射線標(biāo)記的末端，另一端為不同大小的的末端，另一端為不同大小的DNA片段的混合物片段的混合物 電泳分離，放射自顯影得到互相錯(cuò)落的梯形圖譜，即可電泳分離，放射自顯影得到互相錯(cuò)落的梯形圖譜，即可讀出讀出DNA序列序列表表-特異斷裂特異斷裂4種脫氧核苷酸的方法種脫氧核苷酸的方法作用的堿基作用的堿基試劑與反應(yīng)試劑與反應(yīng)堿基釋放堿基釋放DNA斷裂斷裂強(qiáng)強(qiáng)G/弱弱A稀釋稀釋250倍硫酸二甲酯，在倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（卡可酸（PH8

6、.0）10MMgCl2、0.1MEDTA20060分鐘，分鐘，DNAG的的N7和和A的的N3甲基化甲基化甲基化嘌呤不穩(wěn)定，甲基化嘌呤不穩(wěn)定，在中型在中型PH加熱被破壞加熱被破壞在在0.1M堿中，堿中，9015分鐘，戊糖脫落，分鐘，戊糖脫落，DNA鏈斷裂，鏈斷裂，G斷裂斷裂比比A快快5倍倍A同上同上0.2NHCl、0、60分分鐘，堿基被破壞鐘，堿基被破壞同上，同上，A斷裂比斷裂比G快快C+T15-18M聯(lián)苯胺、聯(lián)苯胺、2050分鐘，嘧啶環(huán)被破壞釋放分鐘，嘧啶環(huán)被破壞釋放0.5M哌啶處理，斷裂哌啶處理，斷裂DNA鍵，鍵，C與與T有同有同樣速率樣速率C2MNaCl，聯(lián)氨處理方法同上，聯(lián)氨處理方法同上

7、，100分鐘，此時(shí)，分鐘，此時(shí)，T的破壞被抑制，只有的破壞被抑制，只有C被破壞釋放被破壞釋放同上，只在同上，只在C處斷裂處斷裂DNA鏈鏈在在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地?cái)嗔逊N反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地?cái)嗔袲NA的機(jī)制是：的機(jī)制是： G反應(yīng)反應(yīng)-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后斷開甲基化，其后斷開了了C8-C9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。 G+A反應(yīng)反應(yīng)-（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，弱了嘌呤脫氧核糖核苷

8、酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。然后哌啶置換了嘌呤。 T+C反應(yīng)反應(yīng)-肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。 C反應(yīng)反應(yīng)-在在NaCl存在時(shí)，只有存在時(shí)，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。 堿基特異性修飾及裂解堿基特異性修飾及裂解反應(yīng)體系反應(yīng)體系堿基修飾試劑堿基修飾試劑堿基修飾反應(yīng)堿基修飾反應(yīng)主鏈斷裂試劑主鏈斷裂試劑斷裂點(diǎn)斷裂點(diǎn)G硫酸二甲酯硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化鳥嘌呤甲基化六氫吡啶六氫吡啶GG+A甲酸甲酸脫嘌呤作用脫嘌呤作用六氫吡啶六氫吡啶G和和AC+T肼肼嘧

9、啶開環(huán)嘧啶開環(huán)六氫吡啶六氫吡啶C和和TC肼（加鹽）肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶六氫吡啶C3） DNA自動(dòng)化測(cè)序自動(dòng)化測(cè)序特點(diǎn)特點(diǎn)原理同末端終止法原理同末端終止法標(biāo)記物為熒光染料標(biāo)記物為熒光染料激光掃描自動(dòng)測(cè)序激光掃描自動(dòng)測(cè)序結(jié)果清晰、準(zhǔn)確、分辨率高結(jié)果清晰、準(zhǔn)確、分辨率高測(cè)序速度快測(cè)序速度快 200bp/h.三、三、3種方法的比較種方法的比較 化學(xué)法沒有末端終止法應(yīng)用廣泛，但有一個(gè)明化學(xué)法沒有末端終止法應(yīng)用廣泛，但有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測(cè)序列來自原顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測(cè)序列來自原DNA分子而不是酶促分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學(xué)法可以對(duì)合合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學(xué)

10、法可以對(duì)合成的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序，可以分析諸如甲基化等成的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，不能通過化學(xué)保護(hù)及修飾干擾實(shí)修飾的情況，不能通過化學(xué)保護(hù)及修飾干擾實(shí)驗(yàn)來研究驗(yàn)來研究DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。的相互作用。.Maxam-Gilbert法只需簡(jiǎn)單化學(xué)試劑。所測(cè)序列來自原法只需簡(jiǎn)單化學(xué)試劑。所測(cè)序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學(xué)法可以對(duì)合成的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序，可以分析諸如甲基學(xué)法可以對(duì)合成的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序，可以分析諸如甲基化等化等DNA修飾的情況。但所能測(cè)定的

11、長(zhǎng)度要比修飾的情況。但所能測(cè)定的長(zhǎng)度要比Sanger法法短一些，它對(duì)放射性標(biāo)記末端短一些，它對(duì)放射性標(biāo)記末端 250個(gè)核苷酸以內(nèi)的個(gè)核苷酸以內(nèi)的DNA序序列效果最佳。列效果最佳。Sanger 法雖需要單鏈模板和特異寡核苷酸，并需獲得大法雖需要單鏈模板和特異寡核苷酸，并需獲得大腸桿菌腸桿菌DNA 聚合酶聚合酶IKlenow 片段的高質(zhì)量酶制劑，而隨片段的高質(zhì)量酶制劑，而隨著著M13 噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引物容易獲得及測(cè)序反應(yīng)日期完善，雙脫氧鏈終止法如今遠(yuǎn)物容易獲得及測(cè)序反應(yīng)日期完善，雙脫氧鏈終止法如今遠(yuǎn)比比Maxam-Gilber

12、t法應(yīng)用得廣泛。法應(yīng)用得廣泛。由于由于Sanger法既簡(jiǎn)便又快速，目前大多數(shù)測(cè)序策略都是法既簡(jiǎn)便又快速，目前大多數(shù)測(cè)序策略都是為為Sanger法而設(shè)計(jì)的。法而設(shè)計(jì)的。 DNA自動(dòng)測(cè)序與手工測(cè)序的不同點(diǎn)自動(dòng)測(cè)序與手工測(cè)序的不同點(diǎn)1）標(biāo)記物不同：手工測(cè)序采用放射性核素標(biāo)記，而自動(dòng)測(cè)）標(biāo)記物不同：手工測(cè)序采用放射性核素標(biāo)記，而自動(dòng)測(cè)序采用序采用4種熒光染料分別標(biāo)記種熒光染料分別標(biāo)記ddNTP或標(biāo)記引物或標(biāo)記引物2) 加樣方式不同：手工測(cè)序，一個(gè)樣品的加樣方式不同：手工測(cè)序，一個(gè)樣品的4個(gè)測(cè)序反應(yīng)物分個(gè)測(cè)序反應(yīng)物分別在不同泳道進(jìn)行，而自動(dòng)測(cè)序可在一個(gè)泳道內(nèi)電泳別在不同泳道進(jìn)行，而自動(dòng)測(cè)序可在一個(gè)泳道內(nèi)

13、電泳3) 檢測(cè)手段不同：手工測(cè)序采用放射自顯影，從檢測(cè)手段不同：手工測(cè)序采用放射自顯影，從4種寡聚核種寡聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出苷酸的梯子形圖譜中讀出DNA序列，而自動(dòng)測(cè)序則采用序列，而自動(dòng)測(cè)序則采用激光掃描器同步掃描，計(jì)算機(jī)進(jìn)行閱讀和編輯激光掃描器同步掃描，計(jì)算機(jī)進(jìn)行閱讀和編輯四、四、DNA序列測(cè)定的應(yīng)用序列測(cè)定的應(yīng)用1) 測(cè)序測(cè)序 PCR克隆測(cè)序驗(yàn)證 突變體檢測(cè) 新基因測(cè)序 全基因組測(cè)序 系統(tǒng)發(fā)育及物種鑒定2) 2) 片段分離片段分離 個(gè)體識(shí)別：親緣鑒定 SNP關(guān)聯(lián)分析 疾病診斷等26一、在線分析的核心網(wǎng)站一、在線分析的核心網(wǎng)站http

14、:/bip.weizmann.ac.il/tools/#primaryhttp:/www.ebi.ac.uk/embl/http:/www.ddbj.nig.ac.jp/二、本地分析的重要軟件二、本地分析的重要軟件Vector NTI Suite 6.0及以上的版本：綜合分析、載體分析。及以上的版本：綜合分析、載體分析。DNA Star：綜合分析：綜合分析Primer Premier 5.0：引物設(shè)計(jì)：引物設(shè)計(jì)Oligo 7：寡核苷酸分析，引物計(jì)算：寡核苷酸分析，引物計(jì)算GCG：蛋白質(zhì)、核酸序列：蛋白質(zhì)、核酸序列2 2、核苷酸序列的生物信息分析、核苷酸序列的生物信息分析西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程271) Genbank序列檢索序列檢索.氨基酸序列同源性分析.堿基序列同源性.分子進(jìn)化樹分析親緣性關(guān)系 HUN0801 JS08