美國及歐洲藥典系統(tǒng)適應性要求

1、S/N = 2H/hFigure 5. Noise and chromatographic peak, compoi系統(tǒng)適應性一國藥典系統(tǒng)適應性是氣相和液相色譜分析方 法的重要組成部分，用于證明色譜系統(tǒng)的分 離度和重現(xiàn)性能滿足樣品的分析要求。測試基于這樣的原理：儀器、電路、方 法和樣品組成一個整體系統(tǒng)，我們可以對這 個系統(tǒng)進行測試評估。影響色譜系統(tǒng)的因素包括： 流動相的組成、離子強度、溫度和pH 值 柱子大小、流速、柱溫和壓力 固定相特點，包括填料類型，載體形狀、 粒徑、孔徑、表面積等。 常用固定相為反相硅膠，以十八碳烷基 健合硅膠最常用，其它經過化學修飾的 硅膠也有使用。分離度Rs是理論塔板

2、數(shù)n的函數(shù)（也 叫柱效），a是分離因子，k是容量因子（所 有符號的意義見前文“色i普定義和說明”部 分）。在規(guī)定的色譜條件序n表示洗脫物 中相鄰化合物的分離程度，可作為衡量色諾 系統(tǒng)柱效能的指標，但是不如直接測試的結 果可靠。峰的尖銳程度部分反映柱效，這個 參數(shù)對檢查微量物質至關重要。標準品或者標準溶液需要重岌進樣以 確保精密度。除非個論中有規(guī)定，系統(tǒng)適用 性五針的數(shù)據的相對標準偏差不超過2.0%. 如果超過2.0%的話，需要進樣六針。在含量測定中，如果純品含量100%, 則相對標準偏差沒有最大值限制，這個值可 根據多次進樣對照溶液來計算：%RSD=kB/n/t9o% n-1K 為常數(shù)0.34

3、9,由公式k=（0.6/）x（t90%T5/V6） 計算得來，省表示B=1.0時六次進樣的相對 標準偏差。B是個案中規(guī)定的上限。n是對 照溶液的進樣次數(shù)（3BW6）, t9o%m是自 由度為n-1、置信水平為90%,雙側檢驗時 的t值。除非另有規(guī)定，RSD不能超過卜.表中 的值。此規(guī)定不適用于相關物質檢測。Relative Standard Deviation Requirents進樣次數(shù)3456B%RSD上限2.00.410.590.730.852.50.520.740.921.063.00.620.891.101.27對稱因子AS,用于衡景峰的對稱性， 完全對稱時值為1。拖尾越嚴重，AS的

4、值 越大（見圖4）。偶爾也會有值小于1的情 況。如果對稱因子與1的差值越大，則枳分 的精密度越差。信噪比（S/N）是系統(tǒng)適應性的一個重 要參數(shù)，計算公式如下（圖5）：H是峰高，即峰最高點到基線的距離: h是噪音最大值和最小值之間的差值。系統(tǒng)適應性測試的數(shù)據通過重k進樣 標準品或者特定文件中規(guī)定的對照溶液而 得到，此文件中對相關參數(shù)的定義同樣適用 于其它操作條件，以卜情況可做相應調整: 標準品（包括參考物質）對適應性測試中的所有化合物均適用 在系統(tǒng)適應性測試中為改進色譜系統(tǒng)性能 而作適當調整寸色漕系統(tǒng)的調整不能彌補柱了 和系統(tǒng)本 身的缺陷.為滿足系統(tǒng)詁應性要求而對分析方法調整 時，除非另有規(guī)定，

5、以下每個變雖的最大值都應 考慮：這些調整需要附加有效數(shù)據。為驗證新方 法的系統(tǒng)適應性，需要對改變條件后的分析方法 重新評價。多處改動會對系統(tǒng)性能產生積累效果, 在分析之前能仔細號慮。在梯度洗脫中不推薦改 變流動性組成，如果必須改變，則只對溶劑體積 或滯后體積改變。流動相pH （HPLC）：在配備流動相時，水相緩 沖液的pH波動范圍在正負0.2個單位 緩沖液鹽濃度（HPLC）：在滿足pH伉條件下， 緩沖液中鹽的濃度波動范圍在±10% 流動相的組成（HPLC）：以I、調整限度詁用于 流動相中的小組分（比例小于等于50%）.這些 組分的量可在正負30%范圍內調整。但是不能 超過總流動相的1

6、0%.下面是兩相體系和三相 體系組分的調整范闈兩相體系：溶劑比為50:50時，50的30%是15%.超過了 10%的限度，因此流動相比例只能在40:60到 60： 40范圍內調整。容積比為2： 98時，2的30%時0.6%因此改 變范圍在14： 98.6到2.6:97.4三相體系：溶劑比為60:35:5時，第二組分35的30%時 10.5%,超過10%的限度，只能在25%到45% 的范圍內改變第三組分5的30%是1.5%。加 上組分一共同構成洗脫體系。因此三相體系的比 例變化范圍是50:45:5到70:25:5或者 58.5:35:6.5 jHJ 61.5:35： 3.5.紫外可見光檢測器的波

7、長：操作過程中不允許 波火有誤差，廠家或者其它機構對檢測器波K的 校正誤差不超過3nmo固定相：柱K：可變范圍為原柱長的±70%柱內徑（HPLC）：如果線速度恒定可做適當調節(jié)， 見流速項（HPLC）下.柱內徑（GC）：調整范圍為原柱內徑的±50% 薄膜厚度（毛細管GC）：調整范圍為-50%到 100%粒徑（HPLC）：填料顆粒尺、J.可以減小50%. 但是不能增大.粒徑（GC）：任滿足色譜系統(tǒng)適應性要求的情況 卜粒徑由大換小或者由小換大都W以，調料的 粒徑比率由最大顆粒的直徑除以最小顆粒的直 徑而來。流速（GC）：流速可調范國在±50%流速（HPLC）：柱了尺寸改

8、變時，流速可由下式 計算：F2=F1l2d22/l1dl2Fi是文件中規(guī)定的流速，單位是mL/min, F?是調整后的流速：k是文件中規(guī)定的柱K，12 是使用柱K；山為文件中規(guī)定的柱內徑，d2為使 用柱內徑。流速可變范刖是±50%。進樣體積（HPLC）：只要滿足精密度和檢測限， 進樣體積可以適當減少，但不能增加。進樣體積和分流體積（GC）：檢測器和重現(xiàn)性較 好時可做適當調整。柱溫（HPLC）：柱溫波動范用在±10°進樣口溫度（GC）：可調范圍±10°程序升溫（GC）：溫度可做適當改變，需要保持 定溫度或者改變到另溫度值時，溫度變化做 大容許范圍

9、是±20°。除非另有規(guī)定，系統(tǒng)適應性參數(shù)由待測物峰 的數(shù)據計算、樣品的R，RF, tR實測值應與對照品的實 測值一致，文件中給的相對保留時間值是為了方 便峰的指認，對于相對保留時間沒有評判標準。適應性測試時為了確保最終操作結果的有 效性。實驗過程中為確保系統(tǒng)適應性，進樣前應 做適當?shù)臏蕚涔ぷ?配置待測溶液時，溶液中包括一定景的待測 物和-些其它物質（如藥品輔料或者雜質）。當 色譜系統(tǒng)仃顯著變化時，或者要用特殊試劑，則 要重新做系統(tǒng)適應性實驗，否則不能進行樣品分 析。2.2.46色譜分離技術色譜分離技術是一種多級分離方法，樣 品在固定相和流動相之間多次分配，達到動 態(tài)平衡。固

10、定相一般是附在硅膠或者其它同 體我體上的固體或液體，可填充在層析柱上 或鋪在薄層版/薄膜上，流動相可以是氣體、 液體或者超臨界流體。分離原理包括吸附色 譜、分配色譜、離子交換色譜、分子排阻色 i普等,也可根據樣品分子的大小、空間體枳、 質量等物理化學性質來分離。本章介紹了系統(tǒng)適應性測試涉及的參 數(shù)定義及計算方法，分析方法和儀器介紹等 己分別在以下章節(jié)做了介紹： 紙色譜12.26 薄層色譜2227 氣相色譜2 2.28 液相色漕2.2.29 排阻色漕2 2 30 超臨界流體色譜2.2.45Peak 1Time (f)Figure 2.2.46.-1.定義卜.面分別介紹系統(tǒng)適應性和驗收標準 的相關

11、參數(shù)定義。有些儀器的軟件系統(tǒng)包含 了J些特定參數(shù)的計算方法（例如性噪比、 分離度）。操作人員有責任確認該計算方法 是否符合歐洲藥典要求，如果有差別，應對 該方法做適當調整以符合藥典規(guī)定。色譜圖反應檢洲器的響應信號、洗脫劑濃度或體積 與時間的關系等。理想的色譜圖是在平穩(wěn)的 基線上各色譜峰彼此分離，呈高斯分布。色譜峰色i普柱中洗脫的單個組分或者未分離的多 個組分在檢測器上的響應信號，是色譜圖的 一部分。一般用蜂面枳、峰高h和半高峰寬 Wh、峰高h和峰寬w,等參數(shù)來描述色漕峰。 高斯峰有如下關系（圖2.2.46-1）：Wh= 1 18Wx保留時間tR組分從進樣到出現(xiàn)最大峰所需時間保留體積Vr組分從進

12、樣到出現(xiàn)最大峰所需的流動相體 積，可用保留時間乘以流速F。VR=tR X F死時間tM不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)最大Peak 2峰所需時間死體積Vm不被:固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)最大 峰所需流動相體積。Vm = 1m X F排阻色譜中用V。表示（見卜.而）保留因子k右時用容量因子£或者分配比Dm表示，計 算公式如下：K =固定-中的、分房=*坦流動相中的丁分星質Kc表示分配常數(shù)，也叫平衡分配系數(shù)V5表示固定相體積Vm表示流動相體積在色譜系統(tǒng)中某組分的保留因子也訂按F 式計算：K=LtM流動相總時間以當組分粒徑小于固定相膠 體孔徑的最小尺寸時，該組分從進樣到出現(xiàn) 最大峰所

13、需時間（圖2.2.46-2） 流動相總體積Vt,當組分粒徑小于固定相膠 體孔徑的最小尺、J.時，該組分從進樣到出現(xiàn) 最大峰所需流動相體積，可按下式計算Vt=ttXF滯留時間M：當組分粒徑大于固定相膠體孔 徑的最大尺寸時，該組分從進樣到出現(xiàn)最大 峰所需時間滯留體積Vo：當組分粒徑大于固定相膠體 孔徑的最大尺寸時，該組分從進樣到出現(xiàn)最 大峰所需體積，可按下式計算Vo=toXF分配常數(shù)戚：表示排阻色譜中某一組分的洗 脫能力，也叫分配系數(shù)，可用卜式計算：tRt?！耙?SLC 3nd GCSl20«KClUSI(M)ctironiatographysseEJ«no4)-on 107仲

14、1 o'1 (rTme (0Volume (V>Figure 2.246.-2.arbOBA. mobile phase front B. spot C. line of appheaUonFigure 2246.3B是分析物的移動距離A是溶劑前沿的移動距離100 %SC2XW2<滯留因子RF：在平面色譜中也叫保留因子 Rp表示組分在板上的點到原點之間的距離 與溶劑前沿到原點的距離的比值(圖 2 2 46-3 )o塔板數(shù)N： H反映柱效，又叫理論塔板數(shù), 計算公式如下：N = 5 54()2是組分的保留時間，Wh是該物質的半高峰 寬色譜柱類型、柱溫、流動相以及化合物類型 都

15、會影響理論塔板數(shù)的值滯后體積D：也叫梯度延遲體積，指從流動 相混合點至柱頭的系統(tǒng)體積，可用以下方法 計算：色譜柱:用適當?shù)拿毠?如1 mXO 12 mm) 代替流動相：A相是水，B相是0 1% (V/V)的 丙酮水流速F：能達到足夠的反壓為準(如Zml/imn)時間minA相體積百 分比B相體積百 分比0-20100-0Of 10020-300100檢測器：檢測波長265 nm記錄吸光度到達最大值的50%時的時間toj(圖 2 245-4)<0 5FineFigure 2.2.46.4DfXF圮=% 5-t 七預沒為20 minF為流速，單位為ml/min對稱因子A色諾峰的對稱因子(圖

16、2246-5)按卜.式計 算A=嘗I 2dW005表示在二十分之一峰高處峰寬d表示二十分之一峰高處到峰頂點投射到水 平線之間的距離A,值為1表示峰絕對對稱，大于1則為拖尾 峰，小于1則為前置峰5 _一Figure 2.2 46.-5分離度R.兩組分之間的分離度(2146-1)計算公式 如下tR!和tjc是色譜峰的保留時間Wh!和Wh2是半高峰寬在定量平面色漕中，用移動距離代替保留時間來計算兩組分之間的分離度，計算公式如T：皿=i.Ma絲M電Rfi和R口是色譜峰的阻滯因子WM和Wh2是半高峰寬a是溶劑前沿到基線的距離峰谷比(p/v)做有關物質的系統(tǒng)適應性測試時，如果兩峰 之間的基線分離效果不好，

17、可以用峰谷比作 為評價依據(圖2.246-6)0p/v = p/v*Hp表示基線以上最小峰的最高點到基線的 距離Hr表示基線以上最小峰和主峰之間的最低 點到基線的距離在平面色譜中,用滯留因子RFjtfflRF1代替保留時間tpst和tRj信噪比(S/N)小的噪音峰會影響定最分析的精密度。信噪比計算公式如下：S/N=當nH表示組分的峰高，在參比溶液的色譜圖中, 測星從信號峰的最高點到基線之間的距離。 該信號峰的峰寬至少大于半高峰寬的5倍(圖 2.2.46-7 )oh表示色譜圖中噪音峰的最高點到最低點之 間的距離系統(tǒng)重現(xiàn)性系統(tǒng)重復性表示至少連續(xù)進樣三次后，所得 相村標準偏差的百分數(shù)。計算公式如下：

18、yi表示內部標準方法中的峰面積、峰高或若 而枳比的值y表示平均值n表示值的個數(shù)Figuie 2.2.46.SFiguiv 22.46.-7.相對保留因子T相對保留因子的計算公式如Rr =Vst+W鼠表示待測峰的保留時間表示參照峰的保留時間H表示滯留時間未調整相對保留因子K計算公式如卜.：七=關除北另有規(guī)定，相對保留因子和未調整的相 對保留因子的值基本一致系統(tǒng)適應性用于測試的成分應該明確，能滿足系統(tǒng)性能 和含量測定的要求。系統(tǒng)適應性測試反映了色譜系統(tǒng)的性能，是 建立分析方法不可或缺的一部分。柱效、保 留因子、分離度、相對保留因子和對稱因子 等參數(shù)用來描述柱子的性能。這些參數(shù)可能 從以下方而影響色

19、譜行為： 流動相的組成、離子強度、溫度和pH 值- 流速、色譜柱尺寸、柱溫和柱壓- 固定相特性，包括填充劑類型、填充劑 粒徑、孔徑、比表面積反相材料類型或者對固定相表面進行 其它的結構修飾除非另有規(guī)定，還需滿足以卜要求：- 在相關物質測定或含量測定中，用于定 園的參照色譜峰，其對稱因子取值范圍 必須在0 8到15之間- 如果某成分的純度為100%,則可容許 的參比溶液的相對標準偏差最大值計 算公式如下：e （%）= KB 而Sy '/o' max【90%. n-1K是常數(shù)0 349,由公式K=?x瞽計算 V2 y6而來，裟表示當B = 1。時，六次進樣后的相對標準偏差百分數(shù)B表

20、示方法中規(guī)定的含景上限減去100%n表示進樣次數(shù)（3< n <6）戚加】表示雙側檢驗、置信度為90%、自由 度為n-1時的t值除TF另有規(guī)定，可允許的相對標準偏差最大 值不能超過下表（表2 2 46-1）的值，此規(guī) 定不透用于有關物質測試。表2 2.46-1重復性要求進樣次數(shù)3456B (%)最大容許標準偏差200410.590.730.852 50520310921 06300 620 891 101 27測試有關物質時，定晨限度與此表相等或小 于表中數(shù)值測試員要根據些致變因素來選擇合適的 方案驗證色譜系統(tǒng)，以保證在測試過程中色 譜系統(tǒng)的適應性不受影響。色譜條件的調整為滿足系統(tǒng)適

21、應性，在不對分析方法做根本 改變的情況下，可對色譜參數(shù)做適當調整。 在梯度洗脫時，改變洗脫條件會導致基線漂 移，不利于色譜峰的劃分識別，甚至會出現(xiàn) 假峰和延長洗脫時間。因此要改變梯度洗脫 的條件時，需重新驗證方法的有效性。 系統(tǒng)話應性是定性分析或含鼠測定結果的 有效保障。市竹液相色譜柱的固定相材料類 型多樣，可滿足不同色譜行為需要，為滿足 系統(tǒng)適應性要求，可對色譜條件做適當調整。 但是在反相色譜系統(tǒng)中，調整色譜參數(shù)不能 總是達到既定要求，這時可選擇替換色譜柱。 網站EDQM上有各種柱子的性能信息，可 根據分析需要選擇合適的色譜柱。一般文件會明確規(guī)定一些重要參數(shù)以滿足 系統(tǒng)適應性。薄層色譜和紙色

22、譜展開劑的組成：對其中較少的組分，調整范 圍為相對差值±30%或絕對差值±泓，可選 其中較大的-種，但任何組分的絕對差值不 得超過±10%。例如含量為10%的組分，按 相對差值±3次計算其可調范困在7%-13%, 按絕甘專值±2%計算可調范圍在 固訶按相對差值計算的范圍來調整。假如- 組分含量為5%,按相對差值計算其可調范 圍在3 5-6.5%,按絕對差值計算其可調范困 在3-7%,巧時可按絕對差值范圍調整，但 是改變范圍絕對不能超過10%。除非另有規(guī)定，流動相水相pH值可調范困 在±0 2個單位，非離子溶劑可調范圍在±1

23、個單位。緩沖溶液中的鹽濃度可調范圍在±10%。點樣體積：如果薄層板或層析紙的粒度良好 （2-10呻），點樣體積可為規(guī)定的10-20%液相色譜：等度洗脫流動相組成：對其中較少的組分，調整范困 為相對差值±30%或絕對差值±泓，可選其 中較大的一種，但任何組分的絕對差值不得 超過±10%。除非另有規(guī)定，流動相水相pH值可調范闈 在±02個單位，非離子溶劑可調范圍在±1 個單位。緩沖溶液中的鹽濃度可調范圍在±10%。流速：一般可在±50%范圍內調整，如果改 用大尺寸的柱子，調整范圍可適當加大。 色譜柱參數(shù) 固定相： 不能

24、改變固定相填料類型（例如不能用 C8柱替換C18柱）- 粒徑：最多訂將粒徑減小到原來的50%,但是不能增加填料粒徑色譜柱尺寸： 長度：可調范闈±5次 內徑：可調范困±25%如果色譜柱尺寸改變，流速也需按以卜.公式 做適當調整：FT帝Fi：方法中規(guī)定的流速，單位ml/minF2：改變后的流速，單位ml/min h：方法中規(guī)定的柱長，單位mm b：改變后的柱長，單位mm di：方法中規(guī)定的柱內徑，單位mm d2：改變后的柱內徑，單位mm柱溫：±10°C，除非另有說明，操作時的柱 溫需明確規(guī)定檢測波長：不能改變進樣體枳：在滿足檢測限和重現(xiàn)性的情況下 可減少進樣

25、體枳，但不能增加進樣體積 液相色譜：梯度洗脫梯度洗脫不像等度洗脫，要改變洗脫條件的 話需要慎重考慮流動相：只有在滿足卜列條件時才可對流動 相組成做微小調整： 滿足系統(tǒng)詁應性要求主峰的洗脫時間改變范圍不超過方法 中規(guī)定的±15% 改變后的流動相洗脫能力不能比方法 中規(guī)定的差如果改變條件不能滿足系統(tǒng)適應性要求，則 需考慮滯留體積和換色譜柱滯留體枳：實驗儀器的布屋能顯著改變分離 度、保留時間和相對保留時間等。如有此情 況，可能是滯留體積過大。在開始梯度洗脫 程序之前，會有一段等度洗脫過程?？紤]到 規(guī)定的方法與實際使用方法中的滯留體積 有差異，何在等度洗脫時調整開始梯度洗脫 的時間。測試員有

26、責任使等度洗脫時間話應 所用的分析儀器。如果方法中規(guī)定了滯留體 枳，梯度洗脫的開始時間可根據卜面公式換 成實際開始時間：L = t罕D：滯留體積，單位mlDo：實際滯留體積，單位mlF：流速，單位ml/min如果沒有等度洗脫這個步驟也不影響數(shù)據的有效性，那么此步驟可以省略流動相pH,不能改變緩沖液鹽濃度：不能改變流速：色譜柱尺寸改變時可改變流速（公式見前面）色譜柱參數(shù)固定相：- 不能改變填料類型- 不能改變粒徑大小色諾柱尺寸：- 長度：可調范圍±70% 內徑:可調范圍±25%如果色譜柱尺寸改變，流速也需按以卜公式做話當調整：F? = FiFi：方法中規(guī)定的流速，單位ml/m

27、inF2：改變后的流速，單位ml/min11：方法中規(guī)定的柱長，單位mm12：改變后的柱長，單位mm由：方法中規(guī)定的柱內徑，單位mmdj：改變后的柱內徑，單位mm柱溫：±5°C,除非另有說明，操作時的柱溫需明確規(guī)定檢測波長：不能改變進樣體枳：在滿足檢測限和重現(xiàn)性的情況卜可減少進樣體積，但不能增加進樣體積氣相色譜色譜柱參數(shù)固定相：- 粒徑：（填充柱）最多可減少50%,不能 增大粒徑尺寸- 薄膜厚度：（毛細管柱）可調范圍從-5 0%到 +100%色譜柱尺寸：- 長度：可調范W±7（M- 內徑：可調范圍±50%流速：±50%柱溫：±10%進樣體枳和分流體積：住滿足檢測限和市.現(xiàn)性的情況下可做適當調整超臨界流體色譜流動相組成：填充色譜中，對其中較少的組 分，調整范圍為相對差值±30%或