瓊脂糖凝膠電泳原理PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，主要是應(yīng)用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法，借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，核酸片段因其分子量或者分子形狀的不同，電泳速度有差異而分離，利用DNA、RNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。第1頁(yè)/共12頁(yè)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用膠床準(zhǔn)備靜置鋪膠凝膠準(zhǔn)備膠床置于電泳槽中加電泳緩沖液拔梳子上樣電泳取出凝膠拍照第

2、2頁(yè)/共12頁(yè)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用第3頁(yè)/共12頁(yè)結(jié)果初步分析結(jié)果初步分析數(shù)量分析：條帶的寬度， 熒光的亮度。質(zhì)量分析：純度 分子量瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析影響因素：DNA分子的大小：實(shí)驗(yàn)證明，DNA片段遷移距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比；瓊脂糖的濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂凝膠中，電泳遷移率不相同；DNA分子的構(gòu)型：不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大第4頁(yè)/共12頁(yè)凝膠電泳結(jié)果分析凝膠電泳結(jié)果分析常見(jiàn)問(wèn)題 原因?qū)Σ逥NA條帶模糊DNA降解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免核酸酶污染。電泳緩沖液陳舊電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度

3、降低，PH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。TBE建議使用10就更換。第5頁(yè)/共12頁(yè)所用電泳條件不合適 電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm，溫度30，巨大DNA鏈電泳，溫度15，檢查所用電泳緩沖液的緩沖能力，注意經(jīng)常更換。DNA上樣量過(guò)多減少凝膠中DNA上樣量DNA含鹽過(guò)高電泳前通過(guò)乙醇沉淀去除多余鹽分。有蛋白污染電泳前酚抽提去除蛋白。第6頁(yè)/共12頁(yè)有蛋白污染電泳前酚抽提去除蛋白。DNA變性電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶、片狀帶或地毯樣帶，往往由于酶量多或者酶的質(zhì)量差，dNTP濃度高，Mg2+濃度高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)多

4、。減少酶量或更換酶，減少dNTP濃度，適當(dāng)降低Mg2+濃度，增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。第7頁(yè)/共12頁(yè)不規(guī)則DNA帶遷移電泳條件不合適電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm，溫度30，巨大DNA鏈電泳，溫度15，檢查所用電泳緩沖液的緩沖能力，注意經(jīng)常更換。DNA變性電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。帶弱或無(wú)DNA帶DNA上樣量不夠增加DNA上樣量，聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度高，上樣量可適當(dāng)降低。第8頁(yè)/共12頁(yè)DNA降解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免核酸酶污染。DNA跑出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增加凝膠濃度。EB染色的DNA所用光源不合適應(yīng)用短波長(zhǎng)（254nm）的紫外光源。DNA帶缺

5、尖DNA跑出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增加凝膠濃度。分子大小相近的DNA帶不易分辨增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確凝膠濃度第9頁(yè)/共12頁(yè)DNA變性電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適。在脈沖凝膠電泳上個(gè)分析。電泳時(shí)ladder扭曲配膠的緩沖液與電泳的緩沖液不是同時(shí)配制。同時(shí)配制，電泳緩沖液高出膠的1-2mm即可。電泳時(shí)電壓過(guò)高電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm。第10頁(yè)/共12頁(yè)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用1、DNA的制備. 適合分離大片段DNA.瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段,其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低,但它制備容易,分離范圍廣,尤其適于分離大片段DNA.普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb,利用脈沖電泳,可分離高達(dá)107bp的DNA片段. 可提取大分子DNA利用瓊脂糖凝膠制成凝膠塊提取基因組DNA能夠獲得足夠大的DNA片段，可以完全符合構(gòu)建粘粒基因組文庫(kù)的