免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

1、第四章第四章 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)( (immunofluorescenceimmunofluorescence cytochemistrycytochemistry) ) 采用熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原作為探針，采用熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原作為探針，檢測待測細(xì)胞或組織內(nèi)的靶抗原或抗體，形成帶有熒檢測待測細(xì)胞或組織內(nèi)的靶抗原或抗體，形成帶有熒光素的抗原抗體復(fù)合物。利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，光素的抗原抗體復(fù)合物。利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，根據(jù)組織細(xì)胞中熒光物質(zhì)的存在，確定抗原或抗體的根據(jù)組織細(xì)胞中熒光物質(zhì)的存在，確定抗原或抗體的性質(zhì)并定位

2、，以及利用定量技術(shù)測定含量。性質(zhì)并定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。熒光抗體法：熒光抗體法：用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。 較常用較常用熒光抗原法：熒光抗原法：用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。熒光抗體法熒光抗體法+ +熒光抗原法熒光抗原法= =免疫熒光細(xì)胞（組織）技術(shù)免疫熒光細(xì)胞（組織）技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)包括熒光抗體法和熒光抗原法包括熒光抗體法和熒光抗原法v免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法：免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法： 直接法、間接法、補(bǔ)體法直接法、間接法、補(bǔ)體法v免疫熒光染色標(biāo)本制

3、備：免疫熒光染色標(biāo)本制備： 涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物、組織切片涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物、組織切片 經(jīng)適當(dāng)固定后染色，或不固定直接染色。經(jīng)適當(dāng)固定后染色，或不固定直接染色。 存檔蠟塊：存檔蠟塊：不能再用以免疫熒光染色不能再用以免疫熒光染色 存檔的存檔的HEHE染色標(biāo)本染色標(biāo)本：褪去蓋片和顏色，再作免疫熒光或其它免疫細(xì)胞化學(xué)褪去蓋片和顏色，再作免疫熒光或其它免疫細(xì)胞化學(xué)的染色。的染色。主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、熒光的特征一、熒光的特征二、熒光素二、熒光素三、熒光素標(biāo)記抗體的方法三、熒光素標(biāo)記抗體的方法四、熒光抗體的質(zhì)量鑒定四、熒光抗體的質(zhì)量鑒定五、免疫熒光組化染色方法五、免疫熒光組化染色方法六、熒光

4、顯微鏡六、熒光顯微鏡七、非特異性熒光的消除方法七、非特異性熒光的消除方法 八、八、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的對照染色免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的對照染色 九、激光掃描共聚焦顯微鏡九、激光掃描共聚焦顯微鏡一、熒光的特征一、熒光的特征 分子都含有電子，電子在不停地運(yùn)動著。根據(jù)量子理論，運(yùn)分子都含有電子，電子在不停地運(yùn)動著。根據(jù)量子理論，運(yùn)動著的電子可以處于一系列不連續(xù)的能量狀態(tài)中，電子遵守一定的規(guī)則，動著的電子可以處于一系列不連續(xù)的能量狀態(tài)中，電子遵守一定的規(guī)則，要以從一個能級向另一能級躍遷，并伴隨著與能級差相對應(yīng)的特定能量要以從一個能級向另一能級躍遷，并伴隨著與能級差相對應(yīng)的特定能量的吸收或釋放。的吸收或釋放。激

5、發(fā)激發(fā): : 當(dāng)電子吸收能量躍遷到較高能當(dāng)電子吸收能量躍遷到較高能級，這個過程叫激發(fā)。級，這個過程叫激發(fā)。發(fā)射發(fā)射: : 以輻射方式躍遷時，能量轉(zhuǎn)化以輻射方式躍遷時，能量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)波長的光，這個過程叫發(fā)射。成相應(yīng)波長的光，這個過程叫發(fā)射。v熒光熒光 (fluorescence) 躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重激發(fā)態(tài)。如果電子直接從單重躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重激發(fā)態(tài)。如果電子直接從單重激發(fā)態(tài)以輻射方式躍遷到基態(tài)，由于單重激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，半衰期很短，激發(fā)態(tài)以輻射方式躍遷到基態(tài)，由于單重激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，半衰期很短，發(fā)射持續(xù)的時間也很短，這種發(fā)射光，叫熒光。發(fā)射持續(xù)的時間也很短，這種發(fā)射光，

6、叫熒光。即指一個分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供即指一個分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時停止給，發(fā)光也瞬時停止( (一般持續(xù)一般持續(xù)lOlO-7-7lOlO-8-8s)s)。二二 熒光素?zé)晒馑?能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光素；能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光素； 必須具備：吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光。必須具備：吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光。 1 1 具備用于標(biāo)記抗體的熒光素條件具備用于標(biāo)記抗體的熒光素條件 (1) (1) 應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵共價鍵的化學(xué)基團(tuán)，結(jié)合后不易離解，而未的化學(xué)基團(tuán)，結(jié)

7、合后不易離解，而未 結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易排除。結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易排除。(2) (2) 熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光素質(zhì)量下降不多。熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光素質(zhì)量下降不多。(3) (3) 標(biāo)記后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響。標(biāo)記后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響。(4) (4) 結(jié)合方法簡便而快速，并且較穩(wěn)定。結(jié)合方法簡便而快速，并且較穩(wěn)定。(5) (5) 熒光素容易溶解，溶解后不會和其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。熒光素容易溶解，溶解后不會和其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(6) (6) 熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，

8、能清晰判斷結(jié)果。(1)(1)異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素(FITC)(FITC) 呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存2 2年以年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。呈現(xiàn)上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。呈現(xiàn)黃綠色黃綠色熒光。熒光。 在堿性條件下，在堿性條件下，F(xiàn)ITCFITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵, ,成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個一個IgGI

9、gG分子最多能標(biāo)記分子最多能標(biāo)記15-2015-20個個FITCFITC分子分子2 2 熒光素的種類：熒光素的種類：最大吸收光譜：最大吸收光譜：490490495nm495nm，最大發(fā)射光譜：最大發(fā)射光譜：520520530nm530nm。分子量：分子量：389.4KD389.4KDv(2)(2)四乙基羅達(dá)明四乙基羅達(dá)明(RB200)(RB200) 褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。呈褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。呈明明亮橙紅色亮橙紅色熒光。熒光。RB200RB200在五氯化磷在五氯化磷(PCl(PCl5 5) )作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯，

10、在堿性作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯，在堿性條件下易與蛋白質(zhì)的賴氨酸一氨基反應(yīng)結(jié)合而標(biāo)記在蛋白分子上。條件下易與蛋白質(zhì)的賴氨酸一氨基反應(yīng)結(jié)合而標(biāo)記在蛋白分子上。最大吸收光譜最大吸收光譜:570nm:570nm最大發(fā)射光譜最大發(fā)射光譜:596:596600nm600nm分子量：分子量：580KD580KD(3)(3)四甲基異硫氰酸羅達(dá)明四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(TMRITC)(TMRITC) 紫紅色粉末，紫紅色粉末，羅達(dá)明的衍生物，易溶于水，羅達(dá)明的衍生物，易溶于水，性質(zhì)較穩(wěn)定。呈性質(zhì)較穩(wěn)定。呈橙紅色熒橙紅色熒光光，與，與FITCFITC的黃綠色熒光對比清晰，與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同的黃綠色熒光對比清晰，與蛋白質(zhì)結(jié)合

11、方式同F(xiàn)ITCFITC。它可。它可用于用于雙標(biāo)記雙標(biāo)記示蹤研究。示蹤研究。 最大吸收光譜最大吸收光譜:550nm:550nm 最大發(fā)射光譜最大發(fā)射光譜:620nm:620nm (4) 4-(4) 4-乙酰胺乙酰胺-4-4-異硫氰酸異硫氰酸-2-2-硫酸芪（硫酸芪（SITSSITS）-藍(lán)色熒光藍(lán)色熒光(5) (5) 得克薩斯紅（得克薩斯紅（Texas redTexas red）(6) (6) 藻紅素藻紅素R R(7) (7) 花青（花青（Cyanine,Cy2Cyanine,Cy2綠色綠色,Cy3,Cy3紅色紅色,Cy5,Cy5）v三、熒光素標(biāo)記抗體的方法三、熒光素標(biāo)記抗體的方法( (一一)FI

12、TC)FITC標(biāo)記抗體的方法標(biāo)記抗體的方法1 1 MarsshallMarsshall法法(1)(1)原理：原理：當(dāng)當(dāng)FITCFITC在堿性溶液中與抗體反應(yīng)時，主要是抗體分子上的賴在堿性溶液中與抗體反應(yīng)時，主要是抗體分子上的賴氨酸氨酸- -氨基與氨基與FITCFITC上硫碳胺鍵結(jié)合，一個上硫碳胺鍵結(jié)合，一個IgGIgG分子中有分子中有8686個賴氨酸殘基，個賴氨酸殘基，一般最多能結(jié)合一般最多能結(jié)合15152020個。個。熒光素?zé)晒馑谾ITC-NC N-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) FITC- N C N - 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) S H H H S H (2)(2)操作流程操作流程 抗體與熒光素比例為抗體與熒光素比例

13、為50-100:150-100:1抗體的準(zhǔn)備：抗體的準(zhǔn)備：20mg/ml(20mg/ml(抗體抗體+ +生理鹽水生理鹽水+ +碳酸鹽緩沖液）碳酸鹽緩沖液） 碳酸鹽緩沖液為總量的碳酸鹽緩沖液為總量的1/101/10。熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白總量，每毫克加入熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白總量，每毫克加入0.01mgFITC0.01mgFITC 結(jié)合（標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體溶液中（結(jié)合（標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體溶液中（5-10min)。 避免粘于瓶壁或攪拌棒上，繼續(xù)攪拌避免粘于瓶壁或攪拌棒上，繼續(xù)攪拌12-18h12-18h，44 透析：離心去沉淀，裝入透析袋透析

14、：離心去沉淀，裝入透析袋pH8.0pH8.0緩沖鹽水透析過夜，緩沖鹽水透析過夜，0-40-4 過柱：葡萄糖凝膠過柱：葡萄糖凝膠G50G50或或 G25G25柱柱 分離游離熒光素分離游離熒光素保存保存 4 -404 -40等量甘油分裝保存。等量甘油分裝保存。v2 Chadwick2 Chadwick法法v3 3 改良法改良法v4 4 透析標(biāo)記法透析標(biāo)記法v四、熒光抗體的質(zhì)量控制四、熒光抗體的質(zhì)量控制主要進(jìn)行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。主要進(jìn)行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。1 1 特異性染色效價測定特異性染色效價測定-與相應(yīng)抗原標(biāo)本染色與相應(yīng)抗原標(biāo)本染色 直接染色：倍比稀釋熒光抗體直接染色：倍比

15、稀釋熒光抗體1:21:2，1:4,1:81:4,1:8, ,“+”的最大稀釋度為染的最大稀釋度為染色滴度，實(shí)際染色可取低色滴度，實(shí)際染色可取低1-21-2稀釋度，如染色滴度稀釋度，如染色滴度1:641:64，實(shí)際為，實(shí)際為1:321:32或或1:161:16； 間接染色：間接染色：“+”的最大稀釋度為染色滴度。的最大稀釋度為染色滴度。2 2 非特異性染色測定非特異性染色測定-與相類似抗原標(biāo)本染色與相類似抗原標(biāo)本染色3 3 吸收試驗(yàn)吸收試驗(yàn)-在熒光抗體中加入過量抗原，吸收后再用相應(yīng)抗原陽性在熒光抗體中加入過量抗原，吸收后再用相應(yīng)抗原陽性 標(biāo)本染色，結(jié)果無明顯陽性熒光。標(biāo)本染色，結(jié)果無明顯陽性熒光

16、。4 F/P4 F/P比值的測定方法比值的測定方法F F（熒光素）和（熒光素）和P P（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量， F/P=1-2F/P=1-2， 過高過高-非特異染色增強(qiáng)；非特異染色增強(qiáng)； 過低過低-熒光很弱，降低敏感性。熒光很弱，降低敏感性。熒光抗體的保存熒光抗體的保存v0-40-4或或-20-20低溫保存，防止抗體活性降低和蛋白變性；低溫保存，防止抗體活性降低和蛋白變性；v加入防腐劑：硫柳汞或疊氮鈉；加入防腐劑：硫柳汞或疊氮鈉；v小量分裝；小量分裝；v真空干燥后更易長期保存。真空干燥后更易長期保存。 1 1

17、直接法直接法 （1 1）基本原理）基本原理 用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。位呈現(xiàn)特異性熒光。特點(diǎn)：特點(diǎn)：適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較低膚的檢查和研究。但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較低五、熒光抗體染色方法五、熒光抗體染色方法適用標(biāo)本

18、：涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物或組織切片，經(jīng)適當(dāng)固定或不固定；適用標(biāo)本：涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物或組織切片，經(jīng)適當(dāng)固定或不固定；方法：直接法、間接法、補(bǔ)體法方法：直接法、間接法、補(bǔ)體法 （2 2）器材）器材 熒光顯微鏡，恒冷箱切片機(jī)，剪刀，鑷子，載玻片熒光顯微鏡，恒冷箱切片機(jī)，剪刀，鑷子，載玻片。 （3 3）材料和試劑）材料和試劑 FITCFITCsIgsIg；0.01MPBS(Ph7.2).2)；100%100%丙酮；甘油緩沖液。丙酮；甘油緩沖液。 （4 4）操作步驟）操作步驟 1 1）恒冷箱切片，厚）恒冷箱切片，厚5m5m，風(fēng)吹干燥，風(fēng)吹干燥30min30min。 2 2）100100冷丙

19、酮固定冷丙酮固定lOminlOmin。 3 3）0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次，次，5min/5min/次。次。 4 4）滴加）滴加1 1：5050100100的的FITCFITCsIgsIg，室溫或，室溫或3737濕盒內(nèi)染色濕盒內(nèi)染色30min30min。 5 5）0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次，次，5min/5min/次。次。 6 6）封片，鏡檢。）封片，鏡檢。 7 7）陰性對照：采用正常血清染色，結(jié)果為陰性。）陰性對照：采用正常血清染色，結(jié)果為陰性。 （5 5）結(jié)果）結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光部分為陽性細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)黃

20、綠色熒光部分為陽性細(xì)胞。 2 2 間接法間接法（1 1）基本原理）基本原理先用先用未標(biāo)記特異性抗原未標(biāo)記特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法?？贵w與熒光抗體之間，故稱夾心法。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：只需制備一種熒光抗體可檢出多種抗原，敏感性較高，能解決一只需制備一種熒光抗體可檢出多種抗原，敏感性較高，能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（麻疹）等的研究和檢查，廣泛應(yīng)用于自些不易制備動物免疫血清的病原體（麻疹）

21、等的研究和檢查，廣泛應(yīng)用于自身抗體和感染病人血清的檢驗(yàn)。身抗體和感染病人血清的檢驗(yàn)。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：非特異性著色機(jī)會較多，染色時間長。非特異性著色機(jī)會較多，染色時間長。（2 2）操作步驟：）操作步驟： 1 1）切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)；）切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)； 2 2）滴加）滴加未標(biāo)記的特異性抗原未標(biāo)記的特異性抗原作用切片于作用切片于3737，30min30min； 3 3）PBSPBS漂洗漂洗3 3次，次，5min/5min/次；次； 4 4）滴加）滴加FITCFITCsIgsIg再作用切片于再作用切片于3737，30min30min； 5 5）PBSPBS漂洗漂洗3 3次

22、，次，5min/5min/次。次。 6 6）緩沖甘油封固，鏡檢。）緩沖甘油封固，鏡檢。 7 7）封片，）封片， 陰性對照：用正常血清代替一抗，其余步驟同上。陰性對照：用正常血清代替一抗，其余步驟同上。結(jié)果結(jié)果 黃綠色熒光處即陽性細(xì)胞分布部位。黃綠色熒光處即陽性細(xì)胞分布部位。3 3 補(bǔ)體法補(bǔ)體法用用特異性抗體和補(bǔ)體混合液特異性抗體和補(bǔ)體混合液與標(biāo)本上的抗原反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在抗原抗與標(biāo)本上的抗原反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上，再用體復(fù)合物上，再用熒光標(biāo)記的抗補(bǔ)體的抗體熒光標(biāo)記的抗補(bǔ)體的抗體與補(bǔ)體結(jié)合，從而形成與補(bǔ)體結(jié)合，從而形成抗原抗原抗體抗體補(bǔ)體補(bǔ)體抗補(bǔ)體熒光復(fù)合物抗補(bǔ)體熒光復(fù)合物。熒光顯微

23、鏡下所見陽性熒光即為抗原所。熒光顯微鏡下所見陽性熒光即為抗原所在部位。在部位。特點(diǎn)：特點(diǎn)：很敏感，且不受特異性抗體種屬的限制，適用于各種動物抗體的很敏感，且不受特異性抗體種屬的限制，適用于各種動物抗體的檢查方法。檢查方法。方法：方法： 1 1）涂片或冰凍切片固定，）涂片或冰凍切片固定，PBSPBS水洗；水洗； 2 2）滴加免疫血清和補(bǔ)體等量混合液，）滴加免疫血清和補(bǔ)體等量混合液，3737，30min30min； 3 3）PBSPBS洗滌；洗滌； 4 4）滴加）滴加抗補(bǔ)體熒光抗體抗補(bǔ)體熒光抗體3737，30min30min； 5 5）水洗，緩沖甘油封固。）水洗，緩沖甘油封固。適用：腎穿刺組織活檢

24、診斷等；適用：腎穿刺組織活檢診斷等； 形態(tài)小的立克體、病毒顆粒或低濃度抗原。形態(tài)小的立克體、病毒顆?；虻蜐舛瓤乖?。4 4 雙重免疫熒光染色法雙重免疫熒光染色法適用：適用：在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需要同時顯示兩種抗原。在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需要同時顯示兩種抗原。方法：方法：如如A A抗原的抗體抗原的抗體- FITC - FITC 標(biāo)記，標(biāo)記， B B抗原的抗體抗原的抗體- RB200- RB200標(biāo)記。標(biāo)記。 (1)(1)一步雙染法一步雙染法 將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合（將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合（A+B)A+B)； 直接法進(jìn)行染色反應(yīng)。直接法進(jìn)行染色反應(yīng)。(2)(2)二步雙染法二步雙染法 先用先

25、用RB200RB200標(biāo)記的標(biāo)記的B B抗體抗體, ,不必洗去；不必洗去； 再用再用FITCFITC標(biāo)記的標(biāo)記的A A抗體染色；抗體染色； 按間接法進(jìn)行。按間接法進(jìn)行。 結(jié)果：結(jié)果： A A抗原呈黃綠色熒光；抗原呈黃綠色熒光； B B抗原呈桔紅色熒光。抗原呈桔紅色熒光。5 5 膜抗原熒光抗體染色方法膜抗原熒光抗體染色方法v原理和步驟：原理和步驟：直接法或間接法；直接法或間接法；v適用：適用：可對活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色，常用于可對活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色，常用于T T和和B B細(xì)胞、細(xì)細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原、受體等。胞培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原、受體等。v結(jié)果：結(jié)果：陽性熒光主要在細(xì)胞膜上。陽性熒光

26、主要在細(xì)胞膜上。 6 6 熒光抗體再染色法熒光抗體再染色法熒光抗原染色法熒光抗原染色法抗原用熒光素標(biāo)記，少用?？乖脽晒馑貥?biāo)記，少用。v六、熒光顯微鏡檢查方法六、熒光顯微鏡檢查方法1 1 熒光顯微鏡熒光顯微鏡 超高壓光源、濾板系統(tǒng)超高壓光源、濾板系統(tǒng)( (包括激發(fā)和壓制濾板包括激發(fā)和壓制濾板) )、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。主要部件組成，是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。（1 1）光源）光源 光源的亮度應(yīng)根據(jù)熒光素的類型選擇。小功率汞燈可滿足激勵一般熒光染料光源的亮度應(yīng)根據(jù)熒光素的類型選擇。小功率汞燈可滿足激勵一般熒光染料的要

27、求。對于免疫熒光染色需用大功率超高壓汞燈。其工作時，兩個電極間的要求。對于免疫熒光染色需用大功率超高壓汞燈。其工作時，兩個電極間放電，引起球內(nèi)水銀蒸發(fā)，經(jīng)過放電，引起球內(nèi)水銀蒸發(fā)，經(jīng)過5 515min15min，球內(nèi)氣壓升至，球內(nèi)氣壓升至50507070標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，此時達(dá)到最高亮度，成為穩(wěn)定工作狀態(tài)。此時達(dá)到最高亮度，成為穩(wěn)定工作狀態(tài)。（2 2）濾板系統(tǒng)）濾板系統(tǒng)：包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，分光鏡和其他中性：包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，分光鏡和其他中性濾片。是熒光顯微鏡的重要組成部分，是獲得特定波長光，清晰的熒光影像濾片。是熒光顯微鏡的重要組成部分，是獲得特定波長光，

28、清晰的熒光影像和發(fā)揮顯微鏡最佳性能之關(guān)鍵。了解濾片性能，正確地選擇濾片是觀察熒光和發(fā)揮顯微鏡最佳性能之關(guān)鍵。了解濾片性能，正確地選擇濾片是觀察熒光效應(yīng)的前提和必要條件。效應(yīng)的前提和必要條件。熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng)熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng)激勵法激勵法分光鏡分光鏡激發(fā)濾光片激發(fā)濾光片截止濾光片截止濾光片 用途用途U UDM400DM400BP330-385BP330-385BP360-370BP360-370BA420BA420自動熒光觀察法，自動熒光觀察法，DAPIDAPI( (聯(lián)脒基吲哚聯(lián)脒基吲哚) )：DNA DNA HoechestHoechest 33358,33342 33358,33342

29、染色體染色體V VDM455DM455BP400-410BP400-410BA455BA455兒茶酚胺觀察兒茶酚胺觀察BVBVDM455DM455BP400-440BP400-440BA475BA475芥子喹吖因；染色體芥子喹吖因；染色體BP420-440BP420-440硫磺素硫磺素S S：淋巴細(xì)胞：淋巴細(xì)胞吖淀黃素：核酸吖淀黃素：核酸B BDM500DM500BP450-480BP450-480BA515BA515異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素：熒光抗體觀察：熒光抗體觀察BP470-490BP470-490吖啶橙吖啶橙：DNADNA，RNARNABP420-480BP420-480金胺結(jié)核桿

30、菌金胺結(jié)核桿菌IBIBDM505DM505PB460-490PB460-490BA515IFBA515IFBP470-490BP470-490G GDM570DM570BP510-550BP510-550BA590BA590羅丹明羅丹明BP530-550BP530-550四甲基羅丹明異硫氰酸鹽四甲基羅丹明異硫氰酸鹽：熒光抗體觀察：熒光抗體觀察BP480-550BP480-550碘化丙啶：碘化丙啶：DNADNAIGIGDM565DM565BP520-550BP520-550BA580IFBA580IFDM600DM600BP545-580BP545-580BA610IFBA610IF德克薩斯紅：

31、熒光抗體觀察德克薩斯紅：熒光抗體觀察v2 2 標(biāo)本制作要求標(biāo)本制作要求(1) (1) 載玻片載玻片厚度應(yīng)在厚度應(yīng)在0.60.61.2mm1.2mm之間（有時需石英玻璃載玻片之間（有時需石英玻璃載玻片) )(2) (2) 蓋玻片蓋玻片應(yīng)光潔，厚度在應(yīng)光潔，厚度在0.17mm0.17mm左右（有時需干涉蓋玻片左右（有時需干涉蓋玻片) )(3) (3) 標(biāo)本標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發(fā)光；細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋易非特異著色。察到的上部不能充分激發(fā)光；細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋易非特異著色。 (4) (4

32、) 封片劑封片劑 常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5pH8.59.59.5時較亮，不易很快褪去。甘油和時較亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.00.5mol/L pH9.09.59.5的碳酸鹽緩的碳酸鹽緩沖液等量混合作封片劑（室溫過夜，待氣泡消失可使用沖液等量混合作封片劑（室溫過夜，待氣泡消失可使用) )。熒光信號增強(qiáng)封片劑熒光信號增強(qiáng)封片劑 mowiolmowiol 40-88 4.8g 40-88 4.8g 甘油甘油 12ml12ml 蒸餾水蒸餾水 12ml12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5

33、) 24ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml混合加熱溶解，混合加熱溶解，5000g5000g離心，離心，15min15min，最后加入，最后加入DABcosDABcos，終濃度，終濃度2.52.5，溶解后，分裝存，溶解后，分裝存于于-20-20中。中。(5) (5) 鏡油鏡油: :無熒光；可用甘油、液體石蠟替代。無熒光；可用甘油、液體石蠟替代。v3 3 使用熒光顯微鏡注意事項(xiàng)使用熒光顯微鏡注意事項(xiàng)(1) (1) 嚴(yán)格按說明書操作，不要隨意改變程序；嚴(yán)格按說明書操作，不要隨意改變程序；(2) (2) 應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。汞燈點(diǎn)燃應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。汞燈點(diǎn)燃5-15min5-1

34、5min，光源穩(wěn)定后觀察；，光源穩(wěn)定后觀察；(3) (3) 防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；(4) (4) 檢查時間每次以檢查時間每次以1 12h2h為宜，超過為宜，超過90min90min，超高壓汞燈強(qiáng)度逐漸下降，超高壓汞燈強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本在紫外線照射熒光減弱；標(biāo)本在紫外線照射3-5min3-5min后，熒光減弱；最多不超后，熒光減弱；最多不超2-3h; 2-3h; (5) (5) 熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護(hù)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護(hù)光源。光源關(guān)閉后

35、必須在光源。光源關(guān)閉后必須在30min30min后才能再啟動光源，一天中應(yīng)避免數(shù)次后才能再啟動光源，一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源；點(diǎn)燃光源；(6) (6) 標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察。標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察。(7) (7) 熒光高度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，分四級熒光高度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，分四級“ ”為陰性，為陰性，“ ”為僅能見為僅能見明確可見的熒光；明確可見的熒光；“ ”為可見有明亮的熒光；為可見有明亮的熒光；“ ”為可為可見耀眼的熒光。見耀眼的熒光。4 4 熒光圖像的記錄方法熒光圖像的記錄方法v熒光圖像：具有形態(tài)學(xué)特征、熒光的顏色和亮度熒光圖像：具有形態(tài)學(xué)特征、熒光的顏色和亮度v熒光顯微鏡攝影：熒光顯微鏡攝影： 基本同

36、普通顯微鏡攝影技術(shù)基本同普通顯微鏡攝影技術(shù) 高速感光膠片如高速感光膠片如ASA200以上或以上或24 以上以上 半自動或全自動顯微攝影系統(tǒng)裝置，或半自動或全自動顯微攝影系統(tǒng)裝置，或CCD與計算機(jī)聯(lián)接，與計算機(jī)聯(lián)接， 將圖像存在軟盤上將圖像存在軟盤上v缺點(diǎn)：紫外光對熒光猝滅作用大（如缺點(diǎn)：紫外光對熒光猝滅作用大（如FITC標(biāo)記物，紫外光照射標(biāo)記物，紫外光照射30s，熒光，熒光亮度降低亮度降低50%），曝光速度要求高。），曝光速度要求高。 v七、非特異性染色的產(chǎn)生及消除方法七、非特異性染色的產(chǎn)生及消除方法產(chǎn)生的原因：產(chǎn)生的原因：（1 1）部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析

37、）部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。除去。（2 2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。結(jié)合。（3 3）組織中還可能存在類屬抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合。）組織中還可能存在類屬抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合。（4 4）制備的免疫血清中混雜抗其他組織成分的抗體。）制備的免疫血清中混雜抗其他組織成分的抗體。（5 5）抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰）抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。離子，可吸附于正常

38、組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。（6 6）熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)?。）熒光素不純，?biāo)本固定不當(dāng)?shù)取?v非特異性染色的消除方法非特異性染色的消除方法v1 1 動物臟器粉末吸收法：動物臟器粉末吸收法： 常用：肝粉（豬、鼠）、骨髓粉、鼠腦粉、雞胚粉常用：肝粉（豬、鼠）、骨髓粉、鼠腦粉、雞胚粉 原理：對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸收作用，消除非特異著色原理：對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸收作用，消除非特異著色 方法：每毫升熒光抗體中加入肝粉方法：每毫升熒光抗體中加入肝粉50-100mg50-100mg混勻混勻44過夜過夜離離 心心取上清取上清臨用前加入熒光抗體進(jìn)行吸收臨用前加入熒光抗體進(jìn)行吸收v2 2

39、 透析法透析法 原理：熒光素如原理：熒光素如FITCFITC分子可通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可分子可通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可 將未結(jié)合的熒光素透析除去。將未結(jié)合的熒光素透析除去。 方法：將標(biāo)記完畢的熒光蛋白液裝入透析袋方法：將標(biāo)記完畢的熒光蛋白液裝入透析袋 浸入浸入pH7.2-7.4pH7.2-7.4的的PBSPBS中，中，44，每日更換，每日更換3-43-4次次PBSPBS，約，約5-75-7天，透天，透析液無熒光即可（熒光光源照射）析液無熒光即可（熒光光源照射） v3 3 葡聚糖葡聚糖G-50G-50柱層析法柱層析法目的：除去游離熒光素目的：除去游離熒光素v方法：方

40、法：加入熒光抗體加入熒光抗體15-18ml-15-18ml-即將入柱時加即將入柱時加PBS-PBS-關(guān)閉下口關(guān)閉下口30-40min-30-40min-游離熒光素進(jìn)入分游離熒光素進(jìn)入分子篩孔氏加入洗脫液子篩孔氏加入洗脫液-熒光抗體向下移行熒光抗體向下移行并與游離熒光素拉開距離并與游離熒光素拉開距離-熒光抗體流出熒光抗體流出- -前、中、后三部分收集，測前、中、后三部分收集，測F/PF/P比值，合比值，合并、濃縮、分裝并、濃縮、分裝-繼續(xù)加入洗脫液，直繼續(xù)加入洗脫液，直至洗脫液中無蛋白和熒光素止。至洗脫液中無蛋白和熒光素止。4 DEAE4 DEAE纖維素柱層析法纖維素柱層析法 去除標(biāo)記過多或過少

41、熒光素的抗體分子去除標(biāo)記過多或過少熒光素的抗體分子5 5 熒光抗體稀釋法熒光抗體稀釋法6 6 純化抗原方法純化抗原方法7 7 純化抗體方法純化抗體方法8 8 伊文氏藍(lán)襯染方法：伊文氏藍(lán)襯染方法： 0.01%0.01%伊文氏藍(lán)伊文氏藍(lán) + 0.01mol/LPH7.2PBS + 0.01mol/LPH7.2PBS 稀釋熒光抗體，可將背景細(xì)胞稀釋熒光抗體，可將背景細(xì)胞和組織染色呈紅色熒光，與特異性熒光成對比，減少非特異性熒光，宜作和組織染色呈紅色熒光，與特異性熒光成對比，減少非特異性熒光，宜作常規(guī)應(yīng)用。常規(guī)應(yīng)用。9 9 胰酶消化或胰酶消化或10%10%牛血清蛋白封閉牛血清蛋白封閉八、八、 免疫熒光

42、細(xì)胞化學(xué)的對照染色免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的對照染色 為了排除某些非特異性染色，保證免疫熒光細(xì)胞化學(xué)為了排除某些非特異性染色，保證免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，必須在初次試驗(yàn)時進(jìn)行以上對照試驗(yàn)，染色的準(zhǔn)確性，必須在初次試驗(yàn)時進(jìn)行以上對照試驗(yàn)，從而檢測抗原與抗體的結(jié)合是否是特異的。常用對照如從而檢測抗原與抗體的結(jié)合是否是特異的。常用對照如下：下： 陽性對照陽性對照 陰性對照陰性對照 自發(fā)熒光對照自發(fā)熒光對照1 1 陽性對照陽性對照用已知存在某相應(yīng)抗原組織標(biāo)本染色，結(jié)果為陽性用已知存在某相應(yīng)抗原組織標(biāo)本染色，結(jié)果為陽性2 2 陰性對照陰性對照(1)(1)吸收實(shí)驗(yàn)吸收實(shí)驗(yàn) 用已知的相應(yīng)抗原與標(biāo)記的抗體反應(yīng)，

43、然后離心除去反應(yīng)物，再用吸收用已知的相應(yīng)抗原與標(biāo)記的抗體反應(yīng)，然后離心除去反應(yīng)物，再用吸收過熒光抗體的液體與標(biāo)本內(nèi)抗原反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)為陰性。過熒光抗體的液體與標(biāo)本內(nèi)抗原反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)為陰性。 (2)(2)抑制實(shí)驗(yàn)抑制實(shí)驗(yàn) 用未標(biāo)記熒光素的抗體與標(biāo)本內(nèi)相應(yīng)靶抗原反應(yīng)，然后再加入用熒光用未標(biāo)記熒光素的抗體與標(biāo)本內(nèi)相應(yīng)靶抗原反應(yīng)，然后再加入用熒光素標(biāo)記的相同抗體進(jìn)行染色反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)為陰性。素標(biāo)記的相同抗體進(jìn)行染色反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)為陰性。 二步抑制法二步抑制法： 標(biāo)本先加未標(biāo)記的特異性抗體，再加標(biāo)記熒光抗體。標(biāo)本先加未標(biāo)記的特異性抗體，再加標(biāo)記熒光抗體。 一步抑制法：一步抑制法： 先將熒光抗體用未標(biāo)記抗體作適

44、量混合，再加在標(biāo)本上染色。先將熒光抗體用未標(biāo)記抗體作適量混合，再加在標(biāo)本上染色。效果較二步法好，并且簡便。效果較二步法好，并且簡便。 (3)(3)抗原對照抗原對照 用確知不存在某相應(yīng)抗原的標(biāo)本染色。用確知不存在某相應(yīng)抗原的標(biāo)本染色。 (4)(4)抗體對照抗體對照 用與特異性抗體種屬相同的動物正常血清或同一動物免疫前血清標(biāo)記熒用與特異性抗體種屬相同的動物正常血清或同一動物免疫前血清標(biāo)記熒光素代替免疫血清。光素代替免疫血清。3 3 自發(fā)熒光對照自發(fā)熒光對照 標(biāo)本只加標(biāo)本只加PBSPBS或不加或不加PBSPBS。結(jié)結(jié) 束束v九、激光掃描共聚焦顯微鏡九、激光掃描共聚焦顯微鏡 LSCMLSCM 是是80

45、80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品。年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品。實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層掃描成像，從而對被檢物體樣品從停實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層掃描成像，從而對被檢物體樣品從停留到表面單層，靜態(tài)平面的觀察進(jìn)行到立體，斷層掃描、動態(tài)全面的觀察，留到表面單層，靜態(tài)平面的觀察進(jìn)行到立體，斷層掃描、動態(tài)全面的觀察，在生命科學(xué)研究中得到迅速應(yīng)用。在生命科學(xué)研究中得到迅速應(yīng)用。1 1 儀器構(gòu)成儀器構(gòu)成 (1)(1)計算機(jī)系統(tǒng)：控制著機(jī)械，光學(xué)、聲學(xué)系統(tǒng)及各種外圍設(shè)備。計算機(jī)系統(tǒng)：控制著機(jī)械，光學(xué)、聲學(xué)系統(tǒng)及各種外圍設(shè)備。 (2)(2)激光照射系統(tǒng)：氬離子激光器和聲光調(diào)節(jié)器。激光照射系統(tǒng)：氬離子激光器和聲光調(diào)節(jié)器。 (3)(3) 顯微鏡系統(tǒng)，它主要由倒置顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)組成。顯微鏡系統(tǒng)，它主要由倒置顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)組成。 (4)(4)檢測系統(tǒng)，由檢測器，檢測放大器等元件組成。檢測系統(tǒng)，由檢測器，檢測放大器等元件組成。 (5)X(5)XY Y平臺平臺 (6)Z-(6)Z-軸步進(jìn)馬達(dá)軸步進(jìn)馬達(dá)2 2 共聚焦成像原理共聚焦成像原理 激光器發(fā)出的激光束經(jīng)