透明質酸的發(fā)酵生產工藝

1、食品與制藥工程學院課程論文透明質酸的發(fā)酵生產工藝專業(yè)：生物制藥姓名：鄧海艷課程名稱：發(fā)酵工程摘 要：透明質酸廣泛分布丁各種動物組織中，由丁動物組織原料有限，且透明 質酸的含量低，同時提取成本高，因而價格十分昂貴。而微生物發(fā)酵法，所需的原料 易得，大大降低了生產成本。同時由丁透明質酸存在丁菌體英膜上，易丁與菌體分離， 因而減少了提取成本。本篇文章就是以一株獸疫鏈球菌作為生產菌株進行研究重點討 論了溫度、pH值、攪拌轉速，發(fā)酵時間以及培養(yǎng)方式等發(fā)酵條件對透明質酸產量和分 子質量的影響。關鍵詞：透明質酸；產量；影響因素；發(fā)酵條件透明質酸（hyaluronic acid,簡稱HA） 乂名玻璃酸，是一種

2、高分子量的酸性黏多 糖，廣泛存在丁脊椎動物的各種組織細胞問質中。HA分子中的埃基和極性基團可與水形成氫鍵而結合大量的水，可以吸收與保持自身體重千倍以上的水分，是國際上公認 的最好的保濕劑，還具有潤滑，促進關節(jié)愈合等作用1。不同分子質量的HA有不同的 用途，低分子質量的HA通常用作食品原料，中等分子質量的 HA主要應用丁化妝品， 而高分子量的HA在醫(yī)學上有較高的應用價值。1. 透明質酸的微生物發(fā)酵法從上個世紀30年代開始，人們便開始進行微生物發(fā)酵法生產 HA的研究。微生物 發(fā)酵法生產HA較動物組織提取法有許多的優(yōu)點，比如生產成本低廉，規(guī)模不受原料 限制，因為發(fā)酵液HA以游離狀態(tài)存在所以易丁 HA

3、的分離純化。能夠產生 HA的鏈 球菌有A群和C群兩類，其中A群主要有化膿鏈球菌，一般不用作生產菌種，因為其 致病性較高；C群有獸疫鏈球菌、馬疫鏈球菌、類馬鏈球菌等均屆丁非人體致病菌， 所以可以用作HA的生產菌種羅瑞明等從患肺炎的羊肺液中分離出獸疫鏈球菌菌株， 通過培養(yǎng)基優(yōu)化得到的 HA產量為1.88 g/L。馮建成等以Streptococcus equiSHg出發(fā) 菌株，通過物理和化學誘變選育到1株遺傳穩(wěn)定、無溶血性且透明質酸酶缺陷型菌株SH0201，通過搖瓶發(fā)酵試驗得到相對分子量 2.06xl06 Da的HA。李自剛等從奶牛鼻黏 膜內分離到1株獸疫鏈球菌，經過紫外線誘變和業(yè)硝基月瓜誘變處理后

4、HA產量能達到6.94 g/L2。通過微生物發(fā)酵法生產 HA的品質和產量主要受到以下幾個方面的影響：首先是菌種選擇；其次是培養(yǎng)基的優(yōu)化和發(fā)酵條件的優(yōu)化；最后是生物工藝的下游技 術即HA的提取工藝。國內外諸多學者研究了微生物發(fā)酵法生產HA的工藝。國內，凌沛學等首先開始對 HA的發(fā)酵生產的工藝進行研究，分別進行了實驗室小試和生產 車間中試的研究；陳永浩等利用丫射線和紫外線結合方法和通過輻照進行誘變育種，得到了沒有溶血性的菌株，使得 HA產量及相對分子質量得到了進一步的提高；楊利 等對透明質酸分子量的影響因素進行了探索，得到溶氧水平和攪拌轉速與HA分子量的關系；付莉等從自然界蹄選到一株透明質酸的產生

5、菌；葉華等對丁透明質酸發(fā)酵流 加過程進行了研究；史鵬等，對發(fā)酵法生產透明質酸提取工藝方法進行了研究；郝寧 等對HA的生產菌進行了基因改造，基因重組菌的 HA產量得到很大程度的提高。HA 的發(fā)酵生產主要工藝流程如下:斜面種子一搖瓶種子一接種一發(fā)酵培養(yǎng)一補料一放罐一發(fā)酵液（加乙醇粗提）一 粗提液（加助濾劑、活性炭，調 pH）一過濾（去除雜質）一濾液（乙醇沉淀）一沉淀 物（脫水干燥）一成品透明質酸2. 發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件對HA的影響2.1不同碳源對發(fā)酵的影響當碳源為 2.0%,酵母膏 1.0%,蛋白豚 1.0%, KH2PO4 0.2%,NaCl 0.2%, MgSO4 7H2O 0.03%,

6、 pH7.2,裝量為 10%; 37C, 100 rpm培養(yǎng) 18 h。以葡萄糖為碳源時，透明質酸的產量最高，其后依次是蔗糖、麥芽糖和果糖。而 木糖和半乳糖利用情況不好，以它們?yōu)樘荚磿r透明質酸產量只有0.4 g/L和0.42 g/L。其原因可能是UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄合成透明質酸的前體物質，也是 合成菌體的前體物質，菌體可以容易地分解蔗糖和麥芽糖得到葡萄糖，果糖也很容易 轉化為葡萄糖，所以它們能被比較好的利用，而其他兩種碳源的利用情況則相對差些。 因此本實驗采用葡萄糖為碳源。2.2不同氮源對發(fā)酵的影響當氮源為 2.0%,葡萄糖 2.0%, KH2PO40.2%, NaCl

7、0.2%, MgSO4 7H2O 0.03%, pH7.2,裝量為 10%, 37C, 100 rpm 培養(yǎng) 18 h。氮源不僅為菌體生長提供氮元素，而且大多數有機氮源還能提供多種必需的生長 因子。當發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源采用酵母膏時，透明質酸的產量最高。其次是酵母膏和蛋白豚的混合氮源，其余的均較底。而采用無機氮源（NH4）2SO4時，透明質酸含量和菌體量都是最低的。獸疫鏈球菌的營養(yǎng)要求比較高，TCA循環(huán)不完全，有多種氨基酸不能自身合成，而且不能完全由自身合成核昔酸。而酵母膏中含有大量的菌體生長所 需的生長因子，這可能是獸疫鏈球菌H-35以酵母膏為氮源時生長和發(fā)酵較好的原因之 02.3酵母膏用量對發(fā)

8、酵的影響當氮源為酵母膏，葡萄糖 2.0%, KH2PO40.2%, NaCl 0.2%, MgSO4 7H2O 0.03%, pH7.2,裝量為 10%, 37C, 100 rpm 培養(yǎng) 18 h。低酵母膏用量時，細胞產出的透明質酸含量較低，細胞量也較低，逐步提高酵母 膏的含量，透明質酸含量和細胞量均有大幅提高。當加入量為2%時，透明質酸含量達到最大值。所以本研究中選用酵母膏為氮源，用量為2.0%。2.4不同溫度對發(fā)酵產物的影響發(fā)酵過程中，溫度是一個關鍵的因素， 對菌體生長、代謝速度有很大的影響。當溫 度為35C時，HA 產量最局, 達到1.07g/L;當溫度高丁 35C,透明質酸的產量卻隨溫

9、 度的升高而呈下降的趨勢。但在實驗溫度范圍內菌體生長卻隨溫度的升高菌體量增多， 表明高溫有利丁菌體的生長，碳源更多的轉化為菌體。所以本實驗發(fā)酵溫度為35Co2.5攪拌轉速對HA產量和分子質量的影響攪拌轉速是影響發(fā)酵液溶解氧濃度的關鍵因素之一。HA是HA產生菌英膜的主要組成成分，攪拌可以強化氣-液問氧的傳遞，既維持發(fā)酵液中有足夠的溶氧，為細胞的 生長提供氧氣，乂可使發(fā)酵液中的各營養(yǎng)基質混合均勻，有利丁細胞的吸收和利用， 同時可以加速英膜從細胞表面脫離。高海軍報道，只有在高攪拌轉速時發(fā)酵體系才處 丁全部混合狀態(tài)，在較高的攪拌速率 650 r/min下發(fā)酵時可以得到較高的HA產量，為 411 g/L

10、,產率系數為0.083。這是因為HA溶液是假塑性物體，具有剪切變稀的特性， 高速攪拌時，發(fā)酵液傳質，傳氧性能得到改善，有利丁菌體生產和產物合成，同時， 較高速的攪拌能使英膜更快地脫落，解除其對細胞吸收營養(yǎng)物質的阻礙。Hasegawa卻認為，HA的產量在一定攪拌速度內會隨著攪拌速率的增加而增加，并且隨著換氣速率的加快，HA的產量也會增加，然而過高的攪拌速率會破壞細胞而導致 HA產量下降, 這是因為過高速的攪拌會產生很大的剪切作用，對所培養(yǎng)的菌體細胞造成傷害，使得受損細胞合成HA的能力大大下降了。而成霞則認為在發(fā)酵前期采用較低的攪拌轉速(200 r/min),使菌體細胞能快速生長，發(fā)酵開始10 h

11、后適當提高攪拌轉速(350 r/min), 一方面可通過降低菌體的生長速率來降低乳酸的積累量；另一方面由丁此時發(fā)酵液很 黏稠，提高攪拌轉速可以促進混合，有利丁HA發(fā)酵的進行。David將攪拌速度從3001000 r/min進行變化，HA的分子質量基本沒有改變4。2.6不同裝量對發(fā)酵產物的影響隨著裝量增大，菌體生長較好，但透明質酸的產量在 8%的裝量時出現高峰。說明 了裝量越大，溶氧越低，不利丁透明質酸的合成。因此發(fā)酵中發(fā)酵液的裝量采用8%。2.7發(fā)酵條件的優(yōu)化根據文獻選擇對獸疫鏈球菌生長及產透明質酸影響較大的四個因素(初始葡萄糖 濃度、MgSO4 7H2O的濃度、初始pH和搖床轉數)來設計正交

12、試驗表。其它相同的條 件為：酵母膏 2.0%, KH2PO4 0.2%, NaCl 0.2%，裝量為 8%,培養(yǎng) 18 h。通過極差分析，影響因素大小依次是：pH搖床轉速MgSO4;含量初始葡萄糖。 最優(yōu)組合是pH7.0,搖床轉速200 rPm, MgSO4含量0.06%，初始葡萄糖濃度4.0%。在初始葡萄糖濃度 4.0%,酵母膏 2.0%, NaCl0.2%, KH2PO4 0.2%, MgSO4 7H2O 0.06%,初始pH7.0,裝量為8%, 35C, 200 rpm培養(yǎng)18 h。實驗的結果是透明質酸產 量為1.43 g/L,比優(yōu)化前提高了 28.8%。pH是一項重要的發(fā)酵參數，它對菌

13、體的生長和產物的積累有很大的影響，發(fā)酵液 的pH可以影響微生物細胞原生質的電荷，引起各種酶活力的改變，影響菌體對基質的 利用速度和細胞的結果，以致影響菌體的生長和產物的合成5。從實驗數據可知，pH7.0 時對發(fā)酵有利，過低和過高都不利丁發(fā)酵產物的積累。搖床轉速表明，轉數越高，越有利丁透明質酸的合成和分泌。原因是高轉數，發(fā) 酵液傳質、傳氧性能得到改善，有利丁菌體的生長和產物合成。由丁英膜會阻止營養(yǎng) 物進入細胞，從而影響細胞的生長代謝和透明質酸的合成以及分泌。較高的轉數能使 英膜更快的脫落，解除英膜對細胞吸收營養(yǎng)物質的阻礙。透明質酸合成酶是透明質酸合成途徑中的關鍵酶 ，該酶位丁原生質體膜上。它催化

14、 透明質酸的前體 UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖轉化成 H,此酶的活性受 Mg2+離子濃度的影響很大6。當MgSO4 7H2O為0.06%時透明質酸合成酶活性最高。因 此獸疫鏈球菌H-35最佳發(fā)酵條件是初始葡萄糖濃度 4.0%,酵母膏2.0%, NaCl 0.2%, KH2PO4 0.2%, MgSO4 7H2O 0.06%,初始 pH7.0, 35 C，裝量為 8%, 200 rpm 培養(yǎng) 18 h。3. 透明質酸的純化參照應國活分離純化玻璃酸的研究，采用陰離子交換樹脂DEAE-纖維素對透明質酸粗品進行洗脫。以去離子水為淋洗液，0.6 mol/LNaCl溶液作為洗脫液，分別測定

15、流出液中透明質酸的O.D530值和蛋白質的O.D280值。從中可看出，0.6 mol/LNaCl溶液作 為洗脫劑時，透明質酸出峰時間早，峰形陡峭，峰值較高，拖尾較小，并且含蛋白質 的量很低。通過考馬斯亮藍染料結合法測得粗品和純品的蛋白質含量分別為2.84%和0.38%,說明經過DEAE-纖維素純化以后，透明質酸得到很好的分離。結論雖然目前國內對微生物發(fā)酵法生產 HA的研究逐漸增多，但是大部分還只是在實 驗室進行研究，對丁將其投入工業(yè)化生產的技術還不夠成熟。盡管相對丁動物提取法， 產量有了很大提高，但是由丁 HA的需求增長非常快，產量仍是一個需要突破的瓶頸。 因此，發(fā)酵工藝條件作為影響 HA產量

16、的一個重要因素，特別是從工業(yè)化的角度上考 慮時，仍需進一步的研究和探索。今后，應在以下幾方面展開進一步的研究：一是選 育透明質酸酶缺陷型菌株，并根據 HA的合成和代謝途徑，進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，并 通過建立動力學模型對生產進行評估；二是目前對發(fā)酵法生產HA的研究多集中丁分批發(fā)酵，而分批發(fā)酵的轉化率低，有底物抑制，葡萄糖效應，代謝阻礙等問題，不適 合投入工業(yè)化的生產，應在補料分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵方面進行深入的研究。參考文獻1 郭學平,透明質酸在保健品中的應用J,中國生化藥物雜志，2002, 23 (1): 49-512 周榮活，透明質酸發(fā)酵液的絮凝預處理研究J,食品與發(fā)酵業(yè)，2001, 27 (12):16-183 李建武，生物化學實驗原理和方法M,北京大學出版社，2001, 4: 1744 杭生，透明質酸的離子交換層析純化J,中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2001,32( 11): 485-4885 高海軍，營養(yǎng)條件對獸疫鏈球菌發(fā)酵生產透明質酸的影響J,生物工程學報，2000,16 (3): 396-3996 魯念慈，透明質酸的制備及其應用