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文檔簡介

1、環(huán)境微生物多樣性觀察徐萍(南京師范大學,教師教育學院)摘要:本文著重于環(huán)境微生物的觀察。主要從以下四步來完成:環(huán)境微生物的采集與分離、不同微生物類群菌落的比較及細菌多樣性的觀察與鑒定、放線菌、真菌、霉菌高等真菌形態(tài)觀察、自然界中噬菌體的分離。通過以上階段性的研究學習微生物采集、分離、菌落鑒定等基本實驗室操作方法;樹立無菌意識。前言微生物在自然界中可以說是無處不在。不管我們生活的周圍環(huán)境,還是我們體內(nèi)都有大量微生物的存在,微生物不光分布廣,而且種類繁多,數(shù)目龐大,讓我們無法想象。我們每時每刻都在與微生物打交道,所以微生物與人類的關系非常密切。到底微生物與人類有著怎樣的關系?實際上微生物與人類的關

2、系有兩個方面:有對人類有益的一面,也有對人類有害的一面。一、 微生物與人類日常生物人類要生存,就必須有食物。我們每天吃的很多的食品的制作都離不開微生物。比如:我們每天吃的饅頭、面包、泡菜等食品。我們喝的營養(yǎng)豐富的酸奶;各種酒類-調(diào)味品中的醋、醬油它們都是經(jīng)過微生物的發(fā)酵制作出來的。還有我們吃的營養(yǎng)豐富的菌類,如各種蘑菇、木耳,銀耳。還有藥用價值的靈芝,冬蟲夏草也微生物。二、 微生物與人類健康在人體腸道中有很多微生物,其中要有大腸桿菌,乳酸桿菌等,這些細菌生活在人的腸道中能合成核黃素,維生素k等多種維生素以及氨基酸,以供人體吸收利用。三、 微生物與農(nóng)、牧植物生長需要大量的營養(yǎng)物質(zhì),腐生性微生物能

3、將人、畜糞便、植物枯枝落葉分解,并能轉(zhuǎn)換成植物能夠吸收利用的養(yǎng)料。如果沒有這些微生物,植物就會由于沒有充足的營養(yǎng)物質(zhì)而無法正常生長發(fā)育。有的微生物能將空氣中的氮,轉(zhuǎn)化成植物可以吸收的含氮物質(zhì)。這樣可以減少對農(nóng)作物的施肥量。如根瘤菌。四、 微生物與環(huán)境近年來隨著人口的劇增,工業(yè)的迅速發(fā)展,環(huán)境受到了嚴重的污染。其中水域的污染是非常嚴重的。以前清澈見底,魚蝦嬉戲的景象再也看不見了。很多河流都變成了臭氣熏天的臭水河。有些水域會出現(xiàn)赤潮。這都是水域受到嚴重污染的結(jié)果。水域污染治理的方法很多,在眾多的污水、廢水處理方法中,生物學的處理方法具有經(jīng)濟方便,效果好的突出優(yōu)點被廣泛應用。有些微生物能將水中的含碳

4、有機物分解成二氧化碳等氣體。將含氮有機物分解成氨,硝酸等物質(zhì)。將汞、砷等對人體有毒的重金屬鹽在水體中進行轉(zhuǎn)化,以便回收或除去。在以后的污水處理。五、 微生物與自然界的物質(zhì)循環(huán)地球上每年都有大量的動,植物死亡,腐生性微生物會把這些動植物遺體分解,并能轉(zhuǎn)換成植物能吸收和利用的養(yǎng)料從而促進了自然界的物質(zhì)循環(huán)。試想,自然界中如果沒有這些微生物,那么地球上的動植物遺體早就堆積如山了。那么我們?nèi)祟悓捎跊]有生存空間而無法在地球上生存、繁衍。1微生物無處不在,也與我們?nèi)祟惷芮邢嚓P,所以我們有什么理由不去研究微生物呢?讓我們一起走進微生物奇妙王國吧!1環(huán)境微生物的采集與分離1.1實驗目的了解環(huán)境與微生物的關

5、系及其多樣性;學習環(huán)境微生物(土壤、水體、人體等)采樣的基本方法;初步掌握觀察微生物的實驗方法;了解光學顯微鏡顯微觀察的基本操作和油鏡頭的使用方法; 了解并熟悉微生物的稀釋涂布分離方法與技術(shù);樹立嚴格的無菌意識和掌握正確的無菌操作方法。1.2實驗內(nèi)容與方法天然環(huán)境微生物樣品的采集、分離、培養(yǎng)1.2.1環(huán)境微生物樣品采集(分組采集) 空氣中微生物采集:牛肉膏蛋白胨平板和馬鈴薯培養(yǎng)基,打開皿蓋在空氣中暴露5min后蓋上皿蓋(全班室外和室內(nèi)各一個)。 土壤微生物采集:五點對角法取樣,混勻,稱取1 g土壤放入含9 ml無菌水的三角瓶中(內(nèi)含玻璃珠數(shù)粒),振蕩分散。 水體微生物采集與稀釋:用滅菌三角瓶分

6、別取污水和水庫水約100 ml。1. 2.2樣品稀釋土壤樣品的稀釋:稱量2 g土壤放入含18 ml無菌水的三角瓶中(內(nèi)含玻璃珠數(shù)粒),混勻后用移液槍和槍頭在離心管中進行10倍比逐級稀釋成10-2,10-3的梯度樣品。 水體微生物樣品的稀釋:將污水和潔凈水, 分別稀釋成10-1,10-2, 10-3等系列。土壤加入水后已稀釋了10倍!0.1ml 樣品0.9ml 無菌水逐級稀釋的樣品要混勻!1.2.3樣品的平板稀釋涂布取100l稀釋液于固體培養(yǎng)基平板表面中央,用無菌的玻璃涂棒將樣品液滴均勻涂布分散在平板表面。土壤樣品:10-2,10-3樣液(單號組10-2,雙號組10-3)1塊 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

7、1塊 高氏一號培養(yǎng)基1塊 馬鈴薯培養(yǎng)基水體樣品:庫水:10-1,10-2, 污水:10-2,10-3樣液(單號組庫水,雙號組污水)2塊 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 涂布時要涂至培養(yǎng)基表面略干為止!1.2.4培養(yǎng)將平板倒置放入培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基: 30 24 h 高氏一號培養(yǎng)基: 28 1 week 馬鈴薯培養(yǎng)基上: 28 1 week 下周每個班提前一天課前半小時轉(zhuǎn)接斜面, 培養(yǎng)。無菌操作使用滅菌器材取水和土樣;使用酒精燈灼燒實驗器材;使用酒精燈火焰制造局部無菌環(huán)境,甚至使用超凈工作臺。1.3口腔微生物的觀察1.31取樣:用無菌棉簽在口腔內(nèi)反復擦拭幾遍,然后將棉簽涂布于載玻片上(事

8、先放1/3滴水)。1.3.2制片(單染色法) 涂片固定沙黃染色2分鐘水洗至無色流液吸去殘留水酒精燈干燥。1.3.3顯微鏡油鏡觀察:按照低倍-高倍-油鏡的順序進行觀察。油鏡:擦鏡紙擦去鏡頭上的油,擦鏡紙沾取二甲苯擦拭鏡頭,干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯??偨Y(jié).移液槍的正確使用二.養(yǎng)成良好的無菌操作的意識1.涉及到的實驗材料要滅菌(水、槍頭、涂棒、接種環(huán)等)2.手要用75%的酒精擦拭3.盡量靠近在酒精燈邊操作三.稀釋涂布操作1.涂棒滅菌和冷卻 2.涂布要均勻四.人體微生物的采集和觀察1.涂片要薄而均勻 2.固定溫度不能高,以免影響細胞形態(tài) 3.染色后水洗要輕五.顯微鏡的使用,油鏡正確使用六.菌種的轉(zhuǎn)接

9、1.4實驗結(jié)果口腔微生物觀察2不同微生物類群菌落的比較及細菌多樣性觀察與鑒定2.1實驗目的1.學習觀察細菌、放線菌以及霉菌的群體形態(tài)及 培養(yǎng)特征2.了解革蘭氏染色原理,掌握革蘭氏染色技術(shù)3.熟悉細菌芽孢和莢膜的染色方法4.初步掌握平板菌落轉(zhuǎn)接平板及固體斜面的菌種純化方法5.初步學習平板菌落計數(shù)以及活菌檢測的方法2.2實驗材料1.光學顯微鏡,載玻片,接種環(huán),酒精燈,無菌蓋玻片;2.結(jié)晶紫,沙黃,無水酒精,碘液,蒸餾水;3.實驗一分離培養(yǎng)的各種細菌平板、放線菌平板和真菌平板;4.牛肉膏蛋白胨固體斜面,高氏一號和馬鈴薯培養(yǎng)基平板。2.3實驗材料1. 大腸桿菌Escherichia coli (標準的

10、G-細菌)2.金黃色葡萄球菌Staphyloccus aureus (標準的G+細菌)3.硅酸鹽細菌 (供莢膜染色對照用)4.自己轉(zhuǎn)接未知菌株2.4實驗方法(一)細菌平板菌落的斜面轉(zhuǎn)接:提前24小時實驗 用無菌接種環(huán)挑取實驗一從環(huán)境中分離得到的平板單個菌落劃線接種于牛肉膏蛋白胨的試管斜面上,每組挑取2個菌落(被挑選的菌落在轉(zhuǎn)接前用記號筆在平板底部作好標記,以防混淆。被接種的細菌斜面做好標記,放置37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),供第二天細菌染色及形態(tài)學觀察。(二) 細菌染色及顯微鏡觀察與鑒定1.細菌的革蘭氏染色1)制片:在一塊干凈載玻片上的三個區(qū)域各滴加一小滴蒸餾水,分別挑取前一天細菌分離平板上單個菌落轉(zhuǎn)接培

11、養(yǎng)的斜面培養(yǎng)物,和兩支革蘭氏染色標準細菌斜面的菌苔與上述水滴混勻,制作成薄薄的細菌涂片。將此細菌涂片在酒精燈上方通過5-6次,以使干燥的細菌樣品能夠被固定在載玻片上。2)初染:在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液,染1min,傾去染液,流水沖洗至無紫色(進行細菌芽孢的觀察)。3)媒染:先用新配的路哥氏碘液沖去殘水,而后用其覆蓋涂面1min,后水洗。4)脫色:除去殘水后,滴加95%乙醇進行脫色到留下的乙醇無紫色為止(約2030s),后立即用流水沖洗。5)復染:滴加番紅染色液,染35 min,水洗后用吸水紙吸干。 6)鏡檢:遵循低倍-高倍-油鏡的順序依次觀察顯微鏡視野中的細菌樣品和實驗標準細菌的顏色

12、(藍紫色為革蘭氏陽性細菌,紅色為革蘭氏陰性細菌)。觀察染色結(jié)果并繪圖 (拍照)。2.細菌的芽孢染色(在革蘭氏染色時觀察) 1) 制片:細菌制片方法與革蘭氏染色實驗相同,分別挑取實驗一細菌分離平板上的單個細菌斜面的菌苔與上述水滴混勻,制作成薄薄的細菌涂片。將此細菌涂片在酒精燈上方通過5-6次,以使干燥的細菌樣品能夠被固定在載玻片上。 2)染色:使用沙黃或結(jié)晶紫對細菌樣品染色2分鐘,水洗去除染液,吸水紙輕輕擦拭水滴,然后在酒精燈上方進行干燥。 3)鏡檢:分別用高倍鏡和油鏡觀察,可以看到菌體顯示藍紫色或紅色,而細胞里面的芽孢則顯示為無色透明。(三)細菌、放線菌與真菌的平板菌落特征觀察2.3實驗結(jié)果芽

13、孢莢膜陽性菌 金黃色葡萄球菌霉菌菌落插片培養(yǎng)放線菌菌落3 放線菌、霉菌的形態(tài)多樣性觀察及酵母細胞的顯微測量和直接計數(shù)3.1實驗目的放線菌、絲狀真菌以及酵母菌顯微結(jié)構(gòu)的觀察了解絲狀細菌和真菌的群落特征與細胞結(jié)構(gòu)上的區(qū)別;掌握測定微生物細胞大小的測微技術(shù);掌握對單細胞微生物進行顯微直接計數(shù)的方法3.2實驗材料實驗二插片培養(yǎng)的放線菌平板與霉菌平板;實驗標準菌種:曲霉,青霉,根霉示范片;釀酒酵母菌懸液。顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、解剖針、解剖刀、酒精燈、鑷子等。鏡臺測微尺、目鏡測微尺、血球計數(shù)板3.3酵母菌顯微直接計數(shù) 方法:活菌計數(shù)法平板菌落計數(shù)法;總菌計數(shù)法血球計數(shù)板或霍瑟細菌計數(shù)板取清潔無油的血球計數(shù)板,在計數(shù)室上面加蓋血蓋片。 取酵母菌液,搖勻,用滴管由蓋玻片邊緣滴一小滴,使菌液自行滲入,計數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。用10×鏡觀察并將計數(shù)室移至視野中央。 在10×鏡下計數(shù):計數(shù)4個(或5個)中格的平均值,然后求得每個中格的平均值。乘上16(或25)就得出計數(shù)區(qū)總菌數(shù),最后再換算到每mL菌液中的含菌數(shù)。注意事項:計上不計下,計左不計右。出芽計一半3.3實驗結(jié)果放線菌菌絲霉菌根絲黑曲霉菌絲青霉菌絲黑根霉孢子梗黑曲霉菌絲黑根霉孢子囊校準大腸桿菌計數(shù)4自然界中噬菌體的分離4.1實驗目的1. 了解從環(huán)境污水中分離噬菌體的普通原理;2.熟悉并掌握噬菌體的擴增、培養(yǎng)

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