心膽論治針灸抗動脈粥樣硬化斑塊的臨床與分子機制研究

1、心膽論治”針灸抗動脈粥樣硬化斑塊的臨床與分子機制研究目的 :1. 血小板表面的黏附分子整合素 GPIIb IIIa 及其配體的相互作用是 動脈粥樣硬化血栓形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié) , 導致心肌梗死與腦卒中的發(fā)生。利用整合素 GPIIb IIIa 包被的珠子 , 我們之前從人血漿中篩選出載脂蛋白 A-IV。載脂蛋白 A-IV 是一種主要在小腸中合成分泌的脂質(zhì)結(jié)合蛋白。在不同種族 人類群體中的幾項臨床研究一致表明 , 血漿載脂蛋白 A-IV 的水平與心腦血管疾 病呈反比。然而,載脂蛋白 A-IV 在血小板功能和動脈粥樣硬化血栓形成中的作用 , 至今 從未得到探討。本研究旨在探索載脂蛋白 A-IV 與血小板活

2、化后血小板整合素 GPIIb IIIa 的相互作用 , 明確載脂蛋白 A-IV 在抑制血小板功能和動脈粥樣硬化 血栓形成中的作用。2.“心膽論治” 針灸是國內(nèi)導師符文彬教授提出的防治心腦血管疾病的新理 論。本研究旨在客觀評價從 “心膽論治” 針灸干預動脈粥樣硬化斑塊的綜合治療 方案的有效性及安全性 , 并從載脂蛋白 A-IV 與血小板功能的角度探究針灸抗動 脈粥樣硬化斑塊作用的分子生物學機制。方法 :1. 載脂蛋白 A-IV 與血小板功能及血栓形成相互關(guān)系的基礎(chǔ)研究 1.1 動物實驗研究 1.1.1 小鼠:載脂蛋白 A-IV 基因敲除 (apoA-IV-/-) 小鼠,載脂蛋白 A-IV野生型(

3、apo A-IV+/+)小鼠,C57BL/6J野生型小鼠,和過表達鼠載脂蛋白 A-IV 的轉(zhuǎn)基因 (apo A-IV-Tg) 小鼠。1.1.2 造模: 本研究運用的血栓模型主要有 (1) 建立體外模擬體內(nèi)四維室腔小鼠血栓的模型 : 將全血或富含血小板血漿中均勻加 入到被誘聚劑ADP花生四烯酸、膠原等鋪蓋的長方體玻璃室腔，通過誘聚劑刺 激血小板上相應的受體 , 在體外誘導血小板黏附和聚集 , 并對其進行評價可以反映血小板總體功能狀態(tài) , 并可以直接用于評價處理前后血小板黏附與 聚集功能變化 ,分析血小板數(shù)量、黏附和聚集所需時間及形態(tài)改變。 (2) 建立體內(nèi) 顯微攝影血栓模型 :先將小鼠麻醉 ,

4、進行氣管插管以及頸靜脈插管。利用激光損傷小鼠提睪肌小動脈 , 熒光標記的血小板在不斷遞增的血栓中黏 附和聚集。分析不同基因型小鼠 , 或重組載脂蛋白 A-IV 處理前后的小鼠血栓形成 的速率, 大小和組分等的差異。(3)建立高脂飲食后的小鼠血小板功能評價模型：將C57BL/6J野生型,載脂 蛋白 A-IV 過表達轉(zhuǎn)基因 (apo A-IV-Tg), 載脂蛋白 A-IV 基因敲除 (apo A-IV-/-), 載脂蛋白A-IV野生型(apo A-IV+/+)和雜合子(apo A-IV+/-)小鼠在禁食12小時 候后進行3小時高脂飲食(HFD)。在禁食及高脂飲食后分別收集這幾類小鼠的血 液, 凝膠

5、過濾血小板 , 并進行血小板功能測定。1.1.3 其他體外實驗 ： 包括表達與純化人和鼠的重組載脂蛋白 A-IV, 及生物 素標記的重組載脂蛋白 A-IV; 運用流式細胞技術(shù)檢測血小板活化及血小板表面 不同黏附分子；運用ELISA、流式細胞技術(shù)法、免疫熒光分析血小板的活化、炎 癥反應; 運用體積排阻色譜 , 圓二色極譜儀和熱變性測定評價重組蛋白及重組突 變蛋白的二級結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性 ；利用血小板聚集儀 ,通過分析重組載脂蛋白 A-IV 處理前后或不同基因型血小板玻璃管中光的通透性變化以評價血小板聚集功能 改變。 1.2 人體實驗研究 1.2.1 研究對象 ： 健康人群 1.2.2(1) 建立體外

6、模擬體內(nèi) 四維室腔人血栓的模型 ： 造模方式同四維室腔小鼠血栓的模型的建立。(2) 探討人載脂蛋白 A-IV 水平和血小板聚集相關(guān)性的臨床研究以及在人群 中載脂蛋白A-IV的晝夜節(jié)律變化的研究：從2017年1月至3月期間,在廣東省中 醫(yī)院招募 20位健康志愿者納入這項研究。一天中 ,于中午12點,傍晚6點,半夜24點以及清晨 6點, 取受試者 （飯前）靜脈血, 并運用血小板聚集儀進行血小板聚 集試驗, 以及運用酶聯(lián)免疫吸附測定試驗測量載脂蛋白A-IV 的血漿水平。2.“心膽論治” 針灸抗動脈粥樣硬化斑塊的臨床及機制研究本課題臨床試驗 屬于前瞻性真實世界研究 （Real-World Study）

7、 。2.1 研究對象 2016年5月至 2017 年 10 月期間 , 在廣東省中醫(yī)院收集符合痰濕質(zhì)頸動脈粥樣硬化斑塊納入標準和 排除標準的患者 ,其中針灸組 23例,西藥對照組 9 例;以及健康人群 6例。2.2 干預方案分為 3組,“心膽論治”針灸組,西藥對照組和健康人群組。 2.2.1 “心膽論治”針灸組 :取穴為內(nèi)關(guān) （雙）、陽陵泉（雙）、人迎（雙）、心俞（雙）、膈 俞（雙）、膽俞（雙）, 百會、印堂、引氣歸元 （中脘,下脘,氣海和關(guān)元 ）。操作方法:患者取仰臥位 ,術(shù)者手指及腧穴皮膚用 0.5%碘伏消毒后,以三指 持針快速進針 , 進針深度依穴位部位、體型胖瘦而定 , 先針內(nèi)關(guān) （雙

8、）、陽陵泉（雙）、 人迎（雙）, 后針百會、印堂 , 行捻轉(zhuǎn)手法至患者覺局部酸麻脹痛 ,每個穴位得氣即 止。內(nèi)關(guān)、陽陵泉、百會、印堂采用常規(guī)刺法刺入 0.6-1.0cm 。針刺人迎穴時醫(yī)者以押手捫及喉結(jié)外 1.5cm, 胸鎖乳突肌前緣處頸總動脈搏 動處, 頸動脈輕輕撥向外側(cè)并固定 ,避開頸動脈直刺 0.5-0.8cm, 以得氣并可見針 體隨動脈搏動而擺動為度。留針 30分鐘,配合導氣法 ,囑患者行鼻深呼吸。醫(yī)者出針后對分別對兩側(cè)人迎穴單獨按壓 2 分鐘, 同時患者囑休息 , 若無不 適感,囑患者取仰臥位及俯臥位 ,采用精灸治療。精灸先后在引氣歸元、 四花穴位 皮膚局部涂增加粘附和防燙傷作用的萬

9、花油,然后將底徑0.2mmx高度0.2mm艾 炷粘貼其上 , 自艾炷尖端用線香點燃艾炷 , 在艾炷燃燒過半 , 局部皮膚潮紅、灼痛 時移去艾炷 , 更換另一艾炷 , 每穴灸 2 壯。精灸完用棉簽拭去萬花油。接著進行埋皮內(nèi)針 , 用 0.5%碘伏在雙側(cè)心俞、膽 俞穴皮膚消毒后 ,一手將俞穴部皮膚向兩側(cè)舒張 , 另一手持鑷子夾持針尾平刺入 俞穴皮內(nèi)。先在針尾下墊一橡皮膏 , 然后用脫敏膠布從針尾沿針身向刺入的方向覆蓋、 粘貼固定。2.2.2西藥組：口服拜阿司匹林75 mg/日，阿托伐他汀10mg/日。2.2.3 健康人群組 : 治療方案同針灸組。 2.2.4. 療程 : 針刺, 皮內(nèi)針及艾灸每 周

10、治療2次,兩次治療間隔時間72小時;4周為1療程,共治療2個療程。西藥對照組 4周為 1 個療程,共計 2個療程。健康人群組針灸次數(shù)共 2次。2.3 觀察指標 2.3.1 主要觀察指標：(1)lntima-mediathickness(IMT):血管內(nèi)膜與官腔交界面到中膜與外膜交界面的距離。 該指標常用來評價早期動脈粥樣 硬化的程度。(2) 斑塊的總厚度即 Crouse 積分 ： 不考慮斑塊的長度 , 分別將同側(cè)頸動脈各 個孤立性動脈粥樣硬化斑塊的最大厚度相加 , 得到該側(cè)頸動脈的斑塊積分 , 雙側(cè) 求和為斑塊總積分。 (3) 斑塊的面積 (4) 血漿載脂蛋白 A-IV 水平以及人群載脂蛋 白

11、A-IV晝夜節(jié)律水平(5)血小板聚集功能2.3.2次要觀察指標:(1)血脂四項即膽 固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白 , 及脂蛋白 (a)(2) 凝血四項 ： 凝血 酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、和纖維蛋白原 (FIB)(3) 全血血小板計數(shù)。以上觀察指標為針灸組和西藥組的觀察指標 , 健康人群組的觀察指標僅為 2.3.1.(4) 血漿載脂蛋白 A-IV 水平以及人群載脂蛋白 A-IV 晝夜節(jié)律水平。 2.4 觀察周期在治療前及治療 8周后進行評價 (除健康人群組 )。健康人群組為針灸前后進行評價。 2.5 統(tǒng)計方法采用 Prism 建立數(shù)據(jù)

12、庫并進 行數(shù)據(jù)的管理與分析,分析方法主要是采用配對t檢驗(Paired,two-tailedStudent ' s t-test)o結(jié)果 :1. 載脂蛋白 A-IV 與血小板功能及血栓形成相互關(guān)系的基礎(chǔ)研究 1.1 表達與純化人和鼠的重組載脂蛋白 A-IV, 及生物素標記的重組載脂蛋白 A-IV 利 用基因重組技術(shù) , 在大腸桿菌中產(chǎn)生重組蛋白。蛋白質(zhì)電泳和蛋白質(zhì)印記實驗證 明了重組載脂蛋白A-IV,及生物素標記的重組載脂蛋白A-IV（約46Kd）的成功純化與表達。1.2 載脂蛋白 A-IV 是血小板整合素 GPIIb IIIa 的新型配體應用流式細胞技 術(shù) , 免疫沉淀 , 酶聯(lián)免疫

13、吸附劑測定 （Enzyme linked immunosorbent assay, 簡稱 ELISA）,和生物膜力探針試驗（Biomembrane-Force-Probe,簡稱BFP）證明了載脂 蛋白A-IV能特異地結(jié)合血小板整合素 GPIIb IIIa ?？笹PIIIa（即B 3）整合素的 特異抗體M1,可以徹底消除載脂蛋白A-IV與整合素GPIIb IIIa在這些檢測中的 結(jié)合作用。BFP動力學測量顯示載脂蛋白 A-IV與整合素GPIIb IIIa之間的有效二維親 和力（2.13 X 10-4卩m4）是纖維蛋白原與整合素 GPIIb IIIa 間親和力（4.99 X 10-4 卩m4）的4

14、3%流式細胞技術(shù)，ELISA和BFP競爭性分析證明載脂蛋白A-IV可以競 爭性且劑量依賴性地抑制纖維蛋白原與整合素 GPIIb IIIa 的相互作用。ELISA顯示整合素經(jīng)典的配體結(jié)合位點精氨酸-甘氨酸-絲氨酸抑制載 脂蛋白 A-IV 與整合素 GPIIb IIIa 的相互作用。這些實驗證實了載脂蛋白 A-IV 是 GPIIb IIIa 的新型特異性配體。1.3 載脂蛋白 A-IV 抑制人與鼠血小板聚集血小板聚集實驗檢測證明了重組 人或鼠載脂蛋白A-IV能明顯地抑制激活劑ADP膠原蛋白，凝血酶和凝血酶受體 激動肽激活的血小板聚集 （約20%-40%） 載脂蛋白 A-IV 過表達（約3倍）的小鼠

15、呈現(xiàn)出約 50%減少的血小板聚集的特性。1.4 在血液流動的情況下 , 載脂蛋白 A-IV 抑制體外血栓形成制備四維室腔人 與動物的血栓模型。實驗證明了無論在高血流剪切力 （1800 s-1, 模擬動脈血流 ） 或是低血流剪切力 （300 s-1, 模擬靜脈血流 ）下, 載脂蛋白 A-IV 基因敲除小鼠的血 小板血栓比野生型小鼠的增多約 50%。經(jīng)過重組載脂蛋白 A-IV 治療的健康人的全血也在高與低血流剪切力下顯示 出明顯抑制的血小板血栓形成（約60%-80%） 1.5載脂蛋白A-IV的N-末端天冬 氨酸（D5和D13）是其抑制血小板功能和血栓形成的關(guān)鍵序列制備載脂蛋白A-IV雙D突變蛋白，

16、即同時擁有載脂蛋白A-IV的N-末端兩個天冬氨酸（D5和D13）突 變?yōu)楣劝滨０?（E） 的突變蛋白。血小板聚集實驗和室腔血栓形成模型實驗顯示了載脂蛋白A-IV雙D突變導致其抑制體外血小板聚集和血小板血栓形成作用的完全消失。相應的是，BFP黏附頻率實驗證明了雙D突變的載脂蛋白A-IV未能與整合素GPIIbIIIa黏附，說明 載脂蛋白A-IV的D5和D13是其與整合素GPIIb IIIa的潛在結(jié)合位點,是其抑制 血小板功能和血栓形成的關(guān)鍵序列。1.6 載脂蛋白 -IV 的抗血栓作用隨著血流剪切力的升高而增強室腔血栓形成 模型實驗提示載脂蛋白 A-IV 的抑制血栓的效應隨著血流剪切力的升高而不斷增

17、 強（從300s-到5000s-）。1.7載脂蛋白A-IV雙D突變并未影響載脂蛋白A-IV的 結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性應用體積排阻色譜，圓二色性（CD）光譜波長掃描測定和熱變性測定 顯示重組載脂蛋白A-IV及重組載脂蛋白A-IV雙D突變蛋白擁有相同的二級結(jié)構(gòu) 及穩(wěn)定性。1.8 載脂蛋白 A-IV 抑制小鼠體內(nèi)血栓形成激光損傷小鼠提睪肌小動脈的體 內(nèi)顯微攝影血栓模型顯示載脂蛋白 A-IV 基因敲除的小鼠出現(xiàn)加速的血栓形成和 血管閉塞。靜脈注射重組載脂蛋白A-IV減少了血栓形成，然而雙D突變蛋白的抑 制血栓的功能消失。1.9 體內(nèi)動態(tài)監(jiān)測載脂蛋白 A-IV 的作用部位及蛋白沉積運用激光損傷小鼠提睪肌小動脈體內(nèi)

18、顯微攝影血栓模型 , 發(fā)現(xiàn)載脂蛋白 A-IV 在體內(nèi)呈現(xiàn)一種獨特 的沉積方式：載脂蛋白A-IV可在血管損傷后沉積在血管壁以及血栓的頂部。這說明了載脂蛋白 A-IV 與血小板在體內(nèi)的相互作用。1.10 載脂蛋白 A-IV 抑制餐后的血小板功能亢進野生型小鼠高脂飲食后 , 出 現(xiàn)餐后血小板功能的明顯亢進。載脂蛋白 A-IV 過表達轉(zhuǎn)基因小鼠高脂飲食后出 現(xiàn)血漿載脂蛋白 A-IV 水平的快速升高 , 從而抑制了餐后血小板功能亢進引起的 血小板聚集。相應的 , 載脂蛋白 A-IV 基因敲除或減少的小鼠 , 高脂飲食餐后血小板功能比 野生型小鼠更為亢進。這些實驗證明了載脂蛋白 A-IV 是體內(nèi)一個重要的

19、抑制餐 后血小板功能亢進的保護蛋白 , 可以預防動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展。1.11 一天中人血漿載脂蛋白 A-IV 呈現(xiàn)晝夜節(jié)律且與血小板聚集功能呈負相 關(guān) 20 例健康人納入這項旨在探討血漿載脂蛋白 A-IV 水平與血小板聚集功能相關(guān) 性的人體實驗研究。研究證明人群在早上 6 點時出現(xiàn)一天中最高的血小板聚集。人群中的血漿載脂蛋白 A-IV 也存在晝夜節(jié)律 , 在深夜 0點時出現(xiàn)最高峰卻在 早上 6 點出現(xiàn)最低值。 絕大多數(shù)人 (16/20) 在一天之間血漿載脂蛋白 A-IV 水平和 血小板聚集水平存在負相關(guān)。因此, 載脂蛋白 A-IV 清晨水平最低的現(xiàn)象可能是清晨高血小板聚集的主要 原因,

20、故而導致心腦血管疾病血栓事件在此時段的高發(fā)。 2. “心膽論治”針灸抗動脈粥樣硬化斑塊的臨床及分子生物學機制研究 2.1 針灸能有效地減少頸動脈 粥樣硬化患者頸動脈內(nèi)中膜厚度 ,頸動脈粥樣斑塊的厚度以及面積每周 2次,共 8 周的“心膽論治”針灸方案的治療能有效地減少 23 例頸動脈粥樣硬化患者的頸 動脈內(nèi)膜中層厚度,頸動脈粥樣斑塊的總厚度(即Crouse積分)約16%,以及減少 斑塊面積約 20%(P<0.05) 。無論斑塊性質(zhì)是硬斑、軟斑或是混合斑 , “心膽論治”針灸方案對不同性質(zhì) 斑塊的治療效果暫無顯著性差異。由于目前西藥對照組的例數(shù)仍較少 ,阿司匹林 聯(lián)合立普妥治療后有

21、抑制頸動脈粥樣硬化的趨勢 , 但尚未達到統(tǒng)計學差異。2.2 針灸未能明顯地改善頸動脈粥樣硬化患者的血漿總膽固醇、 低密度脂蛋 白、甘油三酯和脂蛋白 (a) 水平經(jīng)針灸治療后 , 頸動脈粥樣硬化患者的總膽固醇、 低密度脂蛋白和甘油三酯水平無明顯變化 (P>0.05) 。脂蛋白 (a) 有改善的趨勢 , 但無統(tǒng)計學差異 (P=0.11) 。這些數(shù)據(jù)說明了 “心膽論治”針灸不是通過調(diào)節(jié)這些血脂水平來抑制動脈粥 樣硬化斑塊的。阿司匹林聯(lián)合立普妥治療后可改善患者血漿總膽固醇和低密度脂 蛋白水平 (P<0.05) 。2.3 針灸可顯著抑制頸動脈粥樣硬化患者的血小板聚集能力針灸治

22、療能有效地抑制頸動脈粥樣硬化患者 ADP激活的血小板聚集功能(P<0.05),提示“心 膽論治”針灸可通過抑制血小板功能 , 從而減少或消退動脈粥樣硬化斑塊的形成。 阿司匹林聯(lián)合立普妥治療后有緩解 ADP激活的血小板聚集的趨勢，但尚未達到統(tǒng) 計學差異 (P=0.12) 。2.4 針灸對頸動脈粥樣硬化患者的纖維蛋白原水平 , 凝血功能以及血小板計 數(shù)無顯著影響經(jīng)針灸治療后 , 頸動脈粥樣硬化患者的凝血功能 , 包括凝血酶原時 間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、和纖維蛋白原(Fg) 都無明顯影響 (P>0.05) 。同時 , 血小板計數(shù)在針灸治療前后亦無明顯變化 (P>0.05) 。因此, “心膽論治”針灸不是通過降低纖維蛋白原的水平或者血小板計數(shù)來 抑制血小板的聚集功能。 阿司匹林聯(lián)合立普妥治療后患者的血漿纖維蛋白原水平 和血小板數(shù)目也無明顯變化。2.5 針灸可顯著提升健康人群中血漿載脂蛋白 A-IV 的水平和其晝夜節(jié)律水 平“心膽論治”針灸 1次后,健康人24小時后血漿載脂蛋白 A-IV 得到明顯的提 升(P<0.05;n=7)。針灸似乎