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1、性低O2高CO2對(duì)大鼠海馬Bcl-2、Bax基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響【摘要】 目的:探討慢性低O2高CO2對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的誘發(fā)作用及對(duì)Bcl-2、Bax基因表達(dá)的影響。方法:雄性SD大鼠50只,隨機(jī)均分成5組:正常對(duì)照組(NC)、低O2高CO21周組(1HH)、2周組(2HH)、3周組(3HH)和4周組(4HH)。采用TUNEL法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡;以RT-PCR檢測(cè)海馬Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表達(dá)。結(jié)果:隨著低O2高CO2時(shí)間延長(zhǎng),凋亡指數(shù)(AI)及Bax mRNA水平進(jìn)行性升高;Bcl-2 mRNA先升高后下降(均P<0.01)。AI與Bax mRN

2、A之間呈顯著正相關(guān)(r=0.814,P<0.01),而與Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.405,P<0.01)。結(jié)論:慢性低O2高CO2可以誘發(fā)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡,Bcl-2/Bax比值下降是促進(jìn)凋亡的重要因素。 【關(guān)鍵詞】 海馬 低氧 高碳酸血癥 凋亡 Bcl-2 Bax Abstract: Objective: To explore the inducing effect of chronic hypoxic hypercapnia on the apoptosis of rat neural cells in the h

3、ippocampus, and the relationship between the apoptosis and Bcl-2 as well as Bax gene expression. Methods: Fifty male spragu-dawley rats were randomly divided into five groups: normal control group (NC), hypoxic hypercapnia 1-week (1HH), 2-week (2HH), 3-week (3HH) and 4-week (4HH) group. The in situ

4、cell apoptosis in the hippocampus was detected with TUNEL staining. The expression of Bcl-2 and Bax mRNA in the hippocampus were examined with RT-PCR. Results: Apoptosis index (AI) and the expression Bax mRNA were progressirely increased with the prolongation of duration of hypoxic hypercapnic expos

5、ure, and the expression of Bcl-2 mRNA was increased at first, then declined. There was a significant positive correlation between AI and the expression of Bax mRNA (r=0.814, P<0.01), and there was a significant negative correlation between AI and the ratio of Bcl-2 mRNA/Bax mRNA (r=-0.405, P&

6、amp;lt;0.01). Conclusion: Apoptosis can be induced by chronic hypoxic hypercapnia in rat hippocampus. The ratio of Bcl-2/Bax decline accelerates the occurrence of apoptosis.2 / 14 Key words: hippocampus; hypoxia; hypercapnia; apoptosis; Bcl-2; Bax 臨床上慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstruc-tive pulmonary disease,C

7、OPD)由于通氣功能障礙常引起低氧血癥或伴高碳酸血癥,病情持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致肺性腦病。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),慢性低氧能夠引起腦組織結(jié)構(gòu)和功能的損害1,2,但迄今為止,其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡可能在慢性低氧性腦損害中起重要作用3。本實(shí)驗(yàn)采用慢性低O2高CO2性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型,通過(guò)不同低O2高CO2干預(yù)時(shí)間(1周、2周、3周、4周),動(dòng)態(tài)觀察大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化,初步探討慢性低O2高CO2大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。 1 材料和方法 1.1 主要材料 常壓低02高CO2艙(溫州醫(yī)學(xué)院肺心病研究室研制),CYESIl型O2、CO2氣體測(cè)定儀(上海市嘉定學(xué)

8、聯(lián)儀表廠生產(chǎn)),Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司生產(chǎn)),TUNEL試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)),梯度PCR儀(Effendorf公司生產(chǎn)),RT-PCR試劑盒(Fermentas公司提供)。 1.2 動(dòng)物分組及模型制備4 雄性SD大鼠50只(溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重180220 g。隨機(jī)分成5組:即正常對(duì)照組(NC)、低O2高CO21周組(1HH)、2周組(2HH)、3周組(3HH)和4周組(4HH),每組10只。將后4組動(dòng)物放入常壓低O2高CO2艙內(nèi),艙內(nèi)充入氮?dú)猓∟2)使O2濃度維持在9%11%,CO2濃度維持在5.5%6.5%,每天8 h,連續(xù)

9、1周(1HH組)、2周(2HH組)、3周(3HH組)或4周(4HH組)。對(duì)照組大鼠除吸入空氣外,其他飼養(yǎng)條件與各低O2高CO2組相同。動(dòng)物飼養(yǎng)到規(guī)定時(shí)間后,用戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔麻醉,右心導(dǎo)管法測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)、平均頸動(dòng)脈壓(mCAP)。 1.3 取材和標(biāo)本制作 經(jīng)左頸總動(dòng)脈插管處用4 生理鹽水200 m1灌注10 min。將大鼠斷頭,取腦置于冰盤(pán)上,快速分離出左、右海馬。左側(cè)海馬置于液氮迅速冷凍,再放-70 冰箱保存,用于RT-PCR檢測(cè)。右側(cè)海馬放入4%多聚甲醛中固定4 h,依次進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、5m厚連續(xù)切片,用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。 1.4

10、海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡原位檢測(cè) 采用原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法,按試劑盒提供方法操作。鏡檢細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)算5個(gè)高倍視野(×400)下的凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)以凋亡細(xì)胞/100個(gè)細(xì)胞(%)表示。 1.5 Bcl-2和Bax基因的RT-PCR檢測(cè) Bcl-2和Bax引物根據(jù)Genebank資料,利用primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件確定最優(yōu)引物,然后經(jīng)Blast匹對(duì),由上海生工生物有限公司合成。Bcl-2引物:上游為5'-CTGGTGGACAACATCGCTCTG-3',下游為5'-GGTCTGCTGA

11、CCTCACTTGTG-3',擴(kuò)增片段228 bp;Bax引物:上游為5'-GCGAATTGGAGATGAACTGG-3',下游為5'-GTGAGCGAGGCGGTGAGGAC-3',擴(kuò)增片段366 bp。以GAPDH作為內(nèi)參照,引物序列:上游為5'-AGTATGACTCCACTCACGGCAA-3',下游為5'-TCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3',擴(kuò)增片斷100 bp。 取左側(cè)海馬組織勻漿后,提取1l RNA樣品,采用紫外分光光度法測(cè)定RNA純度,以O(shè)D260/OD280的比值表示,要求比值在1.82.0之間

12、。取2g RNA,采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,按20l體系,42 ,逆轉(zhuǎn)錄1 h。多聚酶反應(yīng)總體系為20l(包含GAPDH引物),所有引物退火溫度為56 ,擴(kuò)增35個(gè)循環(huán),脂糖電泳,溴乙啶染色,紫外燈照相,凝膠圖像掃描。 1.6 統(tǒng)計(jì)分析 多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析,方差齊性者用LSD檢驗(yàn),方差不齊者用Dunnett's T3檢驗(yàn)。雙變量相關(guān)分析用Pearman直線相關(guān)分析法分析。 2 結(jié)果 2.1 低O2高CO2對(duì)大鼠mPAP、mCAP、RV/(LV+S)的影響 慢性低O2高CO2各組mPAP、RV/(LV+S)均高于正常對(duì)照組(均P<0.

13、01),mPAP、RV/(LV+S)在慢性低O2高CO2 2周時(shí)達(dá)最高,34周漸趨穩(wěn)定。各組間mCAP差異無(wú)顯著性(均P>0.05)。見(jiàn)表1。 2.2 大鼠海馬細(xì)胞凋亡檢測(cè) NC組海馬神經(jīng)細(xì)胞少量凋亡(見(jiàn)圖1);低O2高CO2各組與NC組比較,細(xì)胞凋亡均顯著增加(P<0.05或P<0.01)。隨著低O2高CO2時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡有逐漸增多的趨勢(shì),4HH組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞最多(見(jiàn)圖4)。4HH組AI較1HH組高261.6%(P<0.01),較2HH組高71.4%(P<0.01),較3HH組增高不明顯(見(jiàn)表2)。 2.3 海

14、馬Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表達(dá)及Bcl-2/Bax比值 低O2高CO2各組海馬Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達(dá)上調(diào),與NC組比較均有顯著性差異(均P<0.01)。隨著低O2高CO2時(shí)間延長(zhǎng),Bcl-2 mRNA表達(dá)先升高而后下降(見(jiàn)圖5),而B(niǎo)ax mRNA表達(dá)逐漸增高(見(jiàn)圖6)。Bcl-2/Bax比值的變化趨勢(shì)同Bcl-2 mRNA,即隨著低O2高CO2時(shí)間的延長(zhǎng),先升高而后下降(見(jiàn)表2)。 2.4 相關(guān)性分析 將海馬神經(jīng)細(xì)胞AI與Bcl-2 mRNA、Bax mRNA及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值作相關(guān)分析表明:AI與Bax mRNA

15、之間存在顯著正相關(guān)(r=0.814,P<0.01),而與Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值之間存在顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.405,P<0.01)。 3 討論 慢性低氧能夠引起腦組織結(jié)構(gòu)和功能的損害,細(xì)胞凋亡被證實(shí)在其中起著重要作用2,3。Gozal等5在研究大鼠間斷性低氧模型時(shí)發(fā)現(xiàn),在間斷低氧14 d時(shí),大鼠皮層和海馬區(qū)細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰。Xu等6在Gozal實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在間斷性低氧21 d、30 d時(shí),細(xì)胞凋亡出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。而本實(shí)驗(yàn)顯示,海馬細(xì)胞凋亡指數(shù)隨低O2高CO2時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸升高,在第4周時(shí)未見(jiàn)下降。據(jù)推測(cè)可能是不同的實(shí)驗(yàn)條件和動(dòng)物模型

16、使腦細(xì)胞凋亡出現(xiàn)不同變化趨勢(shì)。另外,本實(shí)驗(yàn)與低O2同時(shí)存在的高CO2也可能是造成這種趨勢(shì)的重要因素。因?yàn)?,高CO2能明顯抑制低氧誘導(dǎo)的腦血管密度增加,通過(guò)抑制腦血管重建而加重低氧性腦損害7,8;高CO2使大腦乳酸根濃度明顯增加及葡萄糖濃度明顯減少,使大腦發(fā)生能量代謝障礙9。 細(xì)胞凋亡是許多基因參與的程序化過(guò)程,有著非常復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,其中,Bcl-2基因家族是目前較為公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因。Bcl-2家族包括兩類(lèi)成員,一類(lèi)如Bcl-2、Bcl-xl等抑制凋亡發(fā)生,另一類(lèi)如Bax、Bak、Bcl-xs、Bad、Bid、Bik等促進(jìn)凋亡發(fā)生,Bcl-2/Bax增大時(shí)促進(jìn)細(xì)胞存活,反之則導(dǎo)致細(xì)胞凋

17、亡10。本實(shí)驗(yàn)觀察到,隨著低O2高CO2干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),海馬Bcl-2 mRNA表達(dá)先升高后下降。這種變化出現(xiàn)的原因,可能是由于在低O2高CO2損傷早期,首先啟動(dòng)了Bcl-2基因表達(dá)以阻止細(xì)胞凋亡;而隨著低O2高CO2時(shí)間延長(zhǎng),其他誘導(dǎo)凋亡因素持續(xù)存在,細(xì)胞損傷不斷加重,最終Bcl-2的表達(dá)被抑制,細(xì)胞繼而發(fā)生凋亡。另外,隨著低O2高CO2干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),海馬Bax mRNA表達(dá)逐漸增多,表明低O2高CO2可引起海馬Bax表達(dá)增多,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,因而B(niǎo)cl-2/Bax比值逐漸下降,海馬神經(jīng)細(xì)胞AI逐漸增高,兩者呈顯著負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)提示,慢性低O2高CO2可以誘發(fā)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Bcl

18、-2/Bax比值下降可能是促進(jìn)凋亡的重要因素。【參考文獻(xiàn)】1 Mikati MA, Zeinieh MP, Kurdi RM, et al. Long-term effects of acute and of chronic hypoxia on behavior and on hippoc- ampal histology in the developing brain J. Brain Res Dev Brain Res, 2005, 157(1): 98-102.2 Benesova P, Langmeier M, Betka J, et al. Long-lasting changes

19、 in the density of nitrergic neurons following kainic acid ad- ministration and chronic hypoxia J. Physiol Res, 2005, 54 (5): 565-571.3 Schwartz ML, Vaccarino F, Chacon M, et al. Chronic neona- tal hypoxia leads to long term decreases in the volume and cell number of the rat cerebral cortex J. Semin

20、 Perinatol, 2004, 28(6): 379-388.4 胡良岡, 龔永生, 范小芳, 等. 常壓低氧高二氧化碳清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)艙的研制J. 醫(yī)療衛(wèi)生裝備, 2003, 24(4): 16-17. 5 Gozal D, Daniel JM, Dohanich GP. Behavioral and anatomi- cal correlates of chronic episodic hypoxia during sleep in therat J. J Neurosci, 2001, 21(7): 2442-2450.6 Xu W, Chi L, Row BW, et al. Increased oxidative stress is associated with chronic intermittent hypoxia-mediated brain cortical neuronal cell apoptosis in a mouse model of sleep apnea J. Neuroscience, 2004, 126(2): 313-323.7 Xu K, Puchowicz MA, LaManna JC. Renormalization of re-gional brain blo

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