基礎(chǔ)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕虻腜CR擴(kuò)增及其擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

1、目的基因的目的基因的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增及其擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定分析及其擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定分析 綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)-8-8此實(shí)驗(yàn)共包括如下六個(gè)部分此實(shí)驗(yàn)共包括如下六個(gè)部分1.1. 第一部分，目的基因選擇第一部分，目的基因選擇2.2. 第二部分，第二部分，PCRPCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)3.3. 第三部分，第三部分，PCRPCR實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作4.4. 第四部分，第四部分，PCRPCR產(chǎn)物電泳鑒定產(chǎn)物電泳鑒定5.5. 第五部分，第五部分，PCRPCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定產(chǎn)物測(cè)序鑒定6.6. 第六部分，目的基因序列變異分析第六部分，目的基因序列變異分析 PCR技術(shù)的發(fā)明技術(shù)的發(fā)明PCR與臨床診斷與臨床診斷第一部

2、分，目的基因選擇第一部分，目的基因選擇候選基因簡(jiǎn)介候選基因簡(jiǎn)介在本實(shí)驗(yàn)中，有三個(gè)候選基因，分別是在本實(shí)驗(yàn)中，有三個(gè)候選基因，分別是NGAL，F(xiàn)ascin和和Ezrin。這三個(gè)基因在食管癌及其他多種腫瘤中呈過表達(dá)，說明它們?cè)谀[瘤的發(fā)生發(fā)展這三個(gè)基因在食管癌及其他多種腫瘤中呈過表達(dá)，說明它們?cè)谀[瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的生物學(xué)作用。中起重要的生物學(xué)作用。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民課題組曾對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民課題組曾對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)行了深入研究，在國(guó)外雜志上發(fā)表行了深入研究，在國(guó)外雜志上發(fā)表SCI收錄研究論文收錄研究論文20余篇，已形成系列優(yōu)勢(shì)。

3、余篇，已形成系列優(yōu)勢(shì)。同學(xué)們可查閱相關(guān)資料，選擇感興趣的基因來做同學(xué)們可查閱相關(guān)資料，選擇感興趣的基因來做PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)。NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）即中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載）即中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（蛋白，是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（lipocalin) 家族的一個(gè)成員。家族的一個(gè)成員。 NGAL基因的蛋白產(chǎn)物具有保護(hù)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶基因的蛋白產(chǎn)物具有保護(hù)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性，作為小分子鐵配合物結(jié)的活性，作為小分子鐵配合物結(jié)合蛋白參與機(jī)體鐵代謝和天然免疫反應(yīng)等功能。另外，合蛋白參與機(jī)體鐵代謝和

4、天然免疫反應(yīng)等功能。另外，NGAL作為一種早期標(biāo)志物還可作為一種早期標(biāo)志物還可以幫助判定缺血性腎損傷程度。以幫助判定缺血性腎損傷程度。 NGAL的的mRNA信息在信息在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中有來自不同實(shí)驗(yàn)室登記的多個(gè)版本，包含完核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中有來自不同實(shí)驗(yàn)室登記的多個(gè)版本，包含完整編碼區(qū)的有整編碼區(qū)的有BC033089和和NM_005564等，編碼區(qū)長(zhǎng)為等，編碼區(qū)長(zhǎng)為597 bp，編碼，編碼198個(gè)氨基酸，包含個(gè)氨基酸，包含了了N端前部長(zhǎng)為端前部長(zhǎng)為20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列（為核酸序列的個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列（為核酸序列的1-60 bp）。）。NGAL 基因基因NGAL核酸編碼區(qū)序列及其相應(yīng)的蛋白序

5、列核酸編碼區(qū)序列及其相應(yīng)的蛋白序列：前前20個(gè)個(gè)AA為信號(hào)肽序?yàn)樾盘?hào)肽序列列2001年汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民課題組以永生化食管上皮細(xì)胞年汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民課題組以永生化食管上皮細(xì)胞系系SHEE 和食管癌細(xì)胞系和食管癌細(xì)胞系SHEEC 互為對(duì)照，用互為對(duì)照，用cDNA 微列陣進(jìn)行篩選，用微列陣進(jìn)行篩選，用RNA 印跡和印跡和RT-PCR 進(jìn)行鑒定，進(jìn)行鑒定，cDNA 克隆測(cè)序后與克隆測(cè)序后與GenBank 進(jìn)行進(jìn)行BLAST 分析比較。結(jié)果表明分析比較。結(jié)果表明NGAL 基基因在因在SHEEC中出現(xiàn)顯著差異過表達(dá)，其中出現(xiàn)顯著差異過表達(dá)，其cD

6、NA 序列與小鼠序列與小鼠24p3、大鼠、大鼠NRL (neu-related lipocalin) 和人中性粒細(xì)胞和人中性粒細(xì)胞NGAL 具有較高的相似性。這提示具有較高的相似性。這提示NGAL 基因在永生化食管上皮基因在永生化食管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮著重要作用，可能是一種新的癌基因或促癌基因。細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮著重要作用，可能是一種新的癌基因或促癌基因。AB利用利用cDNA 芯片篩選兩種細(xì)胞的差異表達(dá)基因芯片篩選兩種細(xì)胞的差異表達(dá)基因A.永生化食管上皮細(xì)胞系永生化食管上皮細(xì)胞系SHEE B.食管癌細(xì)胞系食管癌細(xì)胞系SHEEC A B C反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)檢測(cè)NGAL在兩種細(xì)胞

7、的在兩種細(xì)胞的mRNA水平水平A.永生化食管上皮細(xì)胞系永生化食管上皮細(xì)胞系SHEE B.食管癌細(xì)胞系食管癌細(xì)胞系SHEECC. 100 bp DNA markerFascin蛋白的蛋白的mRNA全長(zhǎng)為全長(zhǎng)為2767bp，由，由5端非翻譯區(qū)端非翻譯區(qū)111bp堿基，堿基，3端非翻譯區(qū)端非翻譯區(qū)1174bp堿基，堿基，1482bp的全編碼序列區(qū)和的全編碼序列區(qū)和6個(gè)個(gè)PloyA信號(hào)肽組成，編碼信號(hào)肽組成，編碼493個(gè)氨基酸，分子量約個(gè)氨基酸，分子量約為為55kD。Fascin蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維和細(xì)胞膜皺褶蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維和細(xì)胞膜皺褶(ruffles)，邊緣的絲狀偽足，邊緣的絲狀偽足(

8、filopodia)、微棘微棘(microspikes)的核心肌動(dòng)蛋白束中。的核心肌動(dòng)蛋白束中。以往研究發(fā)現(xiàn)，以往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascin基因在許多上皮來源的腫瘤細(xì)胞系，如宮頸癌基因在許多上皮來源的腫瘤細(xì)胞系，如宮頸癌Hela、胃癌、胃癌AGS、大腸癌大腸癌LM1215和和SW480、胰腺癌、胰腺癌BxPC3和和T3H4等細(xì)胞系中均上調(diào)表達(dá)。等細(xì)胞系中均上調(diào)表達(dá)。細(xì)胞的絲狀偽足和微棘與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，提示細(xì)胞的絲狀偽足和微棘與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，提示Fascin蛋白可蛋白可能在細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附以及細(xì)胞間信息交流等過程中發(fā)揮作用。能在細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附以及細(xì)胞

9、間信息交流等過程中發(fā)揮作用。Fascin 基因基因ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGACGGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAGCAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACAAGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCT

10、CATCGTGGCGCACGACGACGGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGCGCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCACCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGGCGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGA

11、CCACCGCTTCCTGCGCCACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGTGGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCACCAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACGAGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGA

12、GACCTTCCAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGCCACCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGCGCATCACACTGAGGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGTGGAGACAGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCA

13、TGGCTTCATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTGGACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGTTCAACGATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACCAGCAGCGGCGACACTCCTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGGGCGCTACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGGGA

14、GTACTAGMTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFGFKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDGNVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYAHLSARPADEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLRHDGRLVARPEPATGYTLEFRSGKVAFRDCEGRYLAPSGPSGTLKAGKATKVGKDELFALEQSCAQVVLQAANERNVSTRQGMDLSANQDEETDQET

15、FQLEIDRDTKKCAFRTHTGKYWTLTATGGVQSTASSKNASCYFDIEWRDRRITLRASNGKFVTSKKNGQLAASVETAGDSELFLMKLINRPIIVFRGEHGFIGCRKVTGTLDANRSSYDVFQLEFNDGAYNIKDSTGKYWTVGSDSAVTSSGDTPVDFFFEFCDYNKVAIKVGGRYLKGDHAGVLKASAETVDPASLWEYFascin基因的編碼區(qū)序列基因的編碼區(qū)序列Fascin基因的蛋白序列基因的蛋白序列Fascin蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)：由蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)：由4個(gè)個(gè)-三葉草結(jié)構(gòu)組成，含多個(gè)三葉草結(jié)構(gòu)組成，含多個(gè)折疊折疊我們課題

16、組發(fā)現(xiàn)，在永生化食管上皮細(xì)胞我們課題組發(fā)現(xiàn)，在永生化食管上皮細(xì)胞SHEE向食管癌細(xì)胞向食管癌細(xì)胞SHEEmt的惡性轉(zhuǎn)化中，的惡性轉(zhuǎn)化中，F(xiàn)ascin基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，并且在食管癌組織中也檢測(cè)到基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，并且在食管癌組織中也檢測(cè)到Fascin蛋白呈陽性表達(dá)。蛋白呈陽性表達(dá)。Fascin在食管癌中的具體功能以及過表達(dá)的機(jī)制至今仍沒有得到很好的闡明。為此我們?cè)谑彻馨┲械木唧w功能以及過表達(dá)的機(jī)制至今仍沒有得到很好的闡明。為此我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了靶向設(shè)計(jì)并合成了靶向Fascin基因的基因的siRNA，試圖通過，試圖通過RNA干擾的方法減少干擾的方法減少Fascin基因的表基因的表達(dá)，從而探討達(dá)，從而

17、探討Fascin對(duì)腫瘤的分化、分裂增殖和浸潤(rùn)等生物學(xué)行為的影響。對(duì)腫瘤的分化、分裂增殖和浸潤(rùn)等生物學(xué)行為的影響。掃描電鏡結(jié)果顯示抑制掃描電鏡結(jié)果顯示抑制Fascin表達(dá)后，表達(dá)后，EC109細(xì)胞突觸形成明顯減少。細(xì)胞突觸形成明顯減少。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示代表細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示代表Fascin蛋白的綠色熒蛋白的綠色熒光在被干擾細(xì)胞（光在被干擾細(xì)胞（A）中要比對(duì)照細(xì)胞（）中要比對(duì)照細(xì)胞（B）的弱）的弱ABEzrin基因基因Ezrin為為ERM（Ezrin,radixin,moesin ）蛋白家族成員之一，）蛋白家族成員之一，ERM家族成員大多位于絲狀突家族成員大多位于絲狀突和膜伸展部位，基本功能

18、就是將肌動(dòng)蛋白栓系到細(xì)胞膜和將膜蛋白錨定在特定的部位，這和膜伸展部位，基本功能就是將肌動(dòng)蛋白栓系到細(xì)胞膜和將膜蛋白錨定在特定的部位，這樣可維持細(xì)胞膜表面的一些特殊結(jié)構(gòu)，如微絨毛和細(xì)胞膜突起等。樣可維持細(xì)胞膜表面的一些特殊結(jié)構(gòu)，如微絨毛和細(xì)胞膜突起等。ERM家族蛋白還參與細(xì)胞表面粘附分子的定位，通過細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互家族蛋白還參與細(xì)胞表面粘附分子的定位，通過細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用參與細(xì)胞粘附作用降。作用參與細(xì)胞粘附作用降。ERM家族蛋白還是酪氨酸激酶的受體，并通過家族蛋白還是酪氨酸激酶的受體，并通過Rho-GTP酶參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。酶參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ezrin含有含有585

19、個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為6.15，理論分子量為，理論分子量為69kD。Ezrin分子帶有大量電荷分子帶有大量電荷（38.5%的氨基酸殘基帶電荷），這可能是導(dǎo)致它的理論分子量與實(shí)際分子量不同的原因的氨基酸殘基帶電荷），這可能是導(dǎo)致它的理論分子量與實(shí)際分子量不同的原因（Ezrin實(shí)際分子量為實(shí)際分子量為80kD）。）。Ezrin定位與染色體定位與染色體6q25.2-q26，DNA長(zhǎng)度為長(zhǎng)度為1761個(gè)堿基，含個(gè)堿基，含13個(gè)外顯子。個(gè)外顯子。ATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTTACCACCATGGATGCAGAGCTGGAGTTTGCAATCCAGCCAAATACAA

20、CTGGAAAACAGCTTTTTGATCAGGTGGTAAAGACTATCGGCCTCCGGGAAGTGTGGTACTTTGGCCTCCACTATGTGGATAATAAAGGATTTCCTACCTGGCTGAAGCTGGATAAGAAGGTGTCTGCCCAGGAGGTCAGGAAGGAGAATCCCCTCCAGTTCAAGTTCCGGGCCAAGTTCTACCCTGAAGATGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATCACCCAGAAACTTTTCTTCCTCCAAGTGAAGGAAGGAATCCTTAGCGATGAGATCTACTGCCCCCCTGAGACTGCCGTGCTCT

21、TGGGGTCCTACGCTGTGCAGGCCAAGTTTGGGGACTACAACAAAGAAGTGCACAAGTCTGGGTACCTCAGCTCTGAGCGGCTGATCCCTCAAAGAGTGATGGACCAGCACAAACTTACCAGGGACCAGTGGGAGGACCGGATCCAGGTGTGGCATGCGGAACACCGTGGGATGCTCAAAGATAATGCTATGTTGGAATACCTGAAGATTGCTCAGGACCTGGAAATGTATGGAATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAGAAAGGAACAGACCTTTGGCTTGGAGTTGATGCCCTTGGAC

22、TGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCAAAGATTGGCTTTCCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTTTGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCCGCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCATCAGAAGCAGCTGGAGCGGCAACAGCTGGAAA

23、CAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGAGAAAGAGCAGATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTTGATGCTGCGGCTGCAGGACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGATTCAGAGGGCCCTGCAGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCGGGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGTATGGCTGCACTGCGGGCTAAGGAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAGGAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAATACA

24、CTGCCAAGATTGCCCTCCTGGAAGAGGCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCCCAGGATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCGGTGAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGGCATCCGGGATGACCGCAATGAGGAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACG

25、AGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACGCTGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATCATCCACAACGAGAACATGAGGCAAGGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATCGACGAGTTCGAGGCCCTGTAAEzrin的編碼區(qū)序列的編碼區(qū)序列Ezrin蛋白含有四個(gè)功能域蛋白含有四個(gè)功能域名稱名稱起始起始終點(diǎn)終點(diǎn)功能功能FERM_N 986將胞漿蛋白連接到膜上將胞漿蛋白連接到膜上FERM_M 88206FERM_C 210299E

26、RM 338586結(jié)合胞漿蛋白結(jié)合胞漿蛋白我們課題組發(fā)現(xiàn)我們課題組發(fā)現(xiàn)Ezrin在食管癌及切緣食管粘膜組織中的位置分布有胞膜分布、胞漿分在食管癌及切緣食管粘膜組織中的位置分布有胞膜分布、胞漿分布和胞膜胞漿混合分布等三種模式。惡性程度越高的癌細(xì)胞越易具有胞漿分布模式，說布和胞膜胞漿混合分布等三種模式。惡性程度越高的癌細(xì)胞越易具有胞漿分布模式，說明明Ezrin細(xì)胞定位的變化可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞定位的變化可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。第二部分，第二部分，PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物決定了引物決定了PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和特異性。目前有多種引物設(shè)計(jì)軟件，如產(chǎn)物的長(zhǎng)度和特異

27、性。目前有多種引物設(shè)計(jì)軟件，如primer premier5、Oligo和北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院李伍舉教授開發(fā)的和北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院李伍舉教授開發(fā)的Biosun等，等，Internet免費(fèi)引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站有免費(fèi)引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站有primer 3，Primerfinder等。等。引物設(shè)計(jì)有以下幾個(gè)原則：引物設(shè)計(jì)有以下幾個(gè)原則：（1 1）引物的特異性。引物應(yīng)根據(jù)目的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物與非靶序列之間不要超過）引物的特異性。引物應(yīng)根據(jù)目的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物與非靶序列之間不要超過 7070的同源性或連續(xù)的同源性或連續(xù)8 8個(gè)的堿基互補(bǔ)，減少非特異產(chǎn)物；個(gè)的堿基互補(bǔ)，減少非特異產(chǎn)物；（2 2）引物的長(zhǎng)度。一般指引物中

28、能與模板序列互補(bǔ)結(jié)合的部分，不包括在）引物的長(zhǎng)度。一般指引物中能與模板序列互補(bǔ)結(jié)合的部分，不包括在55端額外端額外增加的酶切位點(diǎn)序列和其他序列。引物長(zhǎng)度以增加的酶切位點(diǎn)序列和其他序列。引物長(zhǎng)度以181824 bp24 bp為佳。為佳。（3）引物）引物3末端的堿基。引物末端的堿基。引物3末端是延伸的始端，堿基錯(cuò)配會(huì)影響延伸效率。當(dāng)最后一個(gè)末端是延伸的始端，堿基錯(cuò)配會(huì)影響延伸效率。當(dāng)最后一個(gè)堿基是堿基是A時(shí)，容易發(fā)生錯(cuò)配，所以引物時(shí)，容易發(fā)生錯(cuò)配，所以引物3末端最好不要為末端最好不要為A；（4）引物的）引物的G+C含量一般為含量一般為4060，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)；，過高或過低都不利于引發(fā)反

29、應(yīng)；（5）兩條引物不能形成穩(wěn)定的二聚體，或引物自身不能形成穩(wěn)定的二級(jí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這些都）兩條引物不能形成穩(wěn)定的二聚體，或引物自身不能形成穩(wěn)定的二級(jí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這些都會(huì)影響引物與模板的結(jié)合。會(huì)影響引物與模板的結(jié)合。（6）兩條引物的融解溫度）兩條引物的融解溫度Tm值盡量不要相差太大，引物的值盡量不要相差太大，引物的Tm值粗略計(jì)算公式為值粗略計(jì)算公式為Tm = 4 （G+C）+2（A+T）；）；（7）引物的）引物的5端對(duì)擴(kuò)增特異性沒有影響，因此可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性，引物端對(duì)擴(kuò)增特異性沒有影響，因此可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性，引物5端端修飾包括加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素和熒光等，引物修飾包括加酶

30、切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素和熒光等，引物3端是延伸的開始，不能進(jìn)行任何修端是延伸的開始，不能進(jìn)行任何修飾。飾。引物設(shè)計(jì)軟件引物設(shè)計(jì)軟件primer premier 5.0的使用的使用可通過兩個(gè)方法將序列輸入軟件中可通過兩個(gè)方法將序列輸入軟件中在表中粘貼序列在表中粘貼序列打開原有的序列文件打開原有的序列文件選擇序列文選擇序列文件所在位置件所在位置 在對(duì)話框中輸入待擴(kuò)增序列在對(duì)話框中輸入待擴(kuò)增序列 點(diǎn)擊左上角的點(diǎn)擊左上角的“Primer”按鈕按鈕Hairpin: 引物自身是否會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物自身是否會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer: 同一種引物是否會(huì)形成二聚體同一種引物是否會(huì)形成二聚體False primiri

31、ng: 引物在待擴(kuò)增序列中其他位置是否有配對(duì)引物在待擴(kuò)增序列中其他位置是否有配對(duì)Cross Dimer: 正向與反向引物間是否會(huì)形成二聚體正向與反向引物間是否會(huì)形成二聚體引物設(shè)計(jì)界面引物設(shè)計(jì)界面正向和正向和反向引反向引物的互物的互換換正向和反向正向和反向引物的評(píng)價(jià)引物的評(píng)價(jià)正向和反向正向和反向引物的信息引物的信息每點(diǎn)擊左每點(diǎn)擊左邊紅色的邊紅色的按鈕，就按鈕，就出現(xiàn)相應(yīng)出現(xiàn)相應(yīng)的內(nèi)容的內(nèi)容對(duì)正向和反向引物進(jìn)行編輯對(duì)正向和反向引物進(jìn)行編輯可對(duì)引物進(jìn)行增加或減少堿基可對(duì)引物進(jìn)行增加或減少堿基用鍵盤輸入了用鍵盤輸入了5 5個(gè)堿基個(gè)堿基引物的信息引物的信息改動(dòng)后引物的信息改動(dòng)后引物的信息重新回到雙引物的

32、界面重新回到雙引物的界面“Edit”“Copy”“Sense Primer”5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3輸出引物序列輸出引物序列了解并掌握了解并掌握PCR基因擴(kuò)增的基本原理基因擴(kuò)增的基本原理熟悉熟悉PCR基因擴(kuò)增技術(shù)的具體操作過程基因擴(kuò)增技術(shù)的具體操作過程 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康牡谌糠?，第三部分，PCR實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作一、概述一、概述 PCR：使用一對(duì)寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利用：使用一對(duì)寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利用DNA合成合成 酶和四種脫氧核糖酶和四種脫氧核糖核酸進(jìn)行核酸進(jìn)行DNA的體外合成反應(yīng)。的體外合成反應(yīng)。 PCR技術(shù)具有靈敏度高，

33、特異性高、操作方便和重復(fù)性好等特點(diǎn)，能夠在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)獲技術(shù)具有靈敏度高，特異性高、操作方便和重復(fù)性好等特點(diǎn)，能夠在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)獲得多達(dá)幾百萬拷貝的目的基因。得多達(dá)幾百萬拷貝的目的基因。 該技術(shù)在上個(gè)世紀(jì)該技術(shù)在上個(gè)世紀(jì)80年代中期由美國(guó)年代中期由美國(guó)K.Mullis發(fā)明建立，經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包括多發(fā)明建立，經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包括多種衍生技術(shù)，在很多領(lǐng)域中廣泛使用，種衍生技術(shù)，在很多領(lǐng)域中廣泛使用，K.Mullis也因此獲得也因此獲得1993年度的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。年度的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。二、二、PCR基本原理基本原理 DNA在細(xì)胞中的復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程，是在細(xì)胞中的復(fù)制是一個(gè)

34、復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程，是 DNA聚合酶、聚合酶、DNA連接酶、引發(fā)酶、連接酶、引發(fā)酶、RNA引物、四種脫氧核糖核酸、引物、四種脫氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、離子環(huán)境等超螺旋酶、離子環(huán)境等多成份參與的過程。多成份參與的過程。 PCR是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細(xì)胞內(nèi)的是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制，所以在一個(gè)復(fù)制，所以在一個(gè)PCR中中必需成分是必需成分是 1. 模板模板DNA 2. DNA聚合酶聚合酶 3. 四種脫氧核糖核酸四種脫氧核糖核酸 4. 正向和反向兩條引物正向和反向兩條引物 5. 適當(dāng)?shù)木彌_體系。適當(dāng)?shù)木彌_體系。模板序列：待擴(kuò)增的模板序列：待擴(kuò)增的DN

35、A序列，一般為雙鏈的序列，一般為雙鏈的DNA可包括線形雙螺旋可包括線形雙螺旋DNA，如基，如基因組因組DNA，及閉環(huán)雙鏈，及閉環(huán)雙鏈DNA，如質(zhì)粒；，如質(zhì)粒；模板的來源很廣，如從細(xì)胞模板的來源很廣，如從細(xì)胞/細(xì)菌中提取基因組細(xì)菌中提取基因組DNA、提取、提取mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA、質(zhì)粒、病毒等；、質(zhì)粒、病毒等；每個(gè)反應(yīng)中模板的量為每個(gè)反應(yīng)中模板的量為1 ng1 g。質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA和純化的和純化的DNA的量可少一些，而基因的量可少一些，而基因組組DNA的量應(yīng)多一些。的量應(yīng)多一些。PCR靈敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否則會(huì)導(dǎo)致靈敏度很高，所以在操作中注意

36、避免非目的基因序列的污染，否則會(huì)導(dǎo)致PCR的非特異性擴(kuò)增。的非特異性擴(kuò)增。1、模板、模板DNA引物（引物（primer）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的PCR反應(yīng)需要兩種引物，分別成為反應(yīng)需要兩種引物，分別成為5端引端引物和物和3端引物，或稱為正向引物和反向引物。端引物，或稱為正向引物和反向引物。通常通常DNA及及mRNA序列的寫法為序列的寫法為53，所以，所以5端引物與目的序列的端引物與目的序列的5末端序列相同，而末端序列相同，而3端引物與目的序列的端引物與目的序列的3末端序列反向互補(bǔ)。末端序列反向互補(bǔ)。2 2、引物、引物它們作為它們作為DNADNA擴(kuò)增的起始部分，能限

37、定待擴(kuò)增擴(kuò)增的起始部分，能限定待擴(kuò)增DNADNA序列的長(zhǎng)度。序列的長(zhǎng)度。為了保證擴(kuò)增的特異性和有效性，引物與模板相匹配部分應(yīng)至少有為了保證擴(kuò)增的特異性和有效性，引物與模板相匹配部分應(yīng)至少有151518 bp18 bp。5 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物DNA聚合酶：以聚合酶：以DNA為模板，以脫氧核糖核酸為底物催化合成新的為模板，以脫氧核糖核酸為底物催化合成新的DNA的一種酶。的一種酶。早期的早期的PCR反應(yīng)使用的反應(yīng)使用的DNA聚合酶為大腸桿菌聚合酶為大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段。但該酶在高溫片段。但該酶在高溫下容易失活，需要

38、在每次合成反應(yīng)進(jìn)行時(shí)候再加入一份酶。下容易失活，需要在每次合成反應(yīng)進(jìn)行時(shí)候再加入一份酶。隨著新的耐熱隨著新的耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)及在聚合酶的發(fā)現(xiàn)及在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用，使反應(yīng)中的應(yīng)用，使PCR操作更方便，產(chǎn)量更穩(wěn)定。操作更方便，產(chǎn)量更穩(wěn)定。目前商品化的目前商品化的DNA聚合酶有聚合酶有Taq DNA聚合酶和聚合酶和Pfu DNA聚合酶。聚合酶。Taq DNA聚合酶最適工作溫度為聚合酶最適工作溫度為75-80。該酶具有。該酶具有53聚合酶活性，在鎂離子存在情況聚合酶活性，在鎂離子存在情況下可催化核苷酸沿下可催化核苷酸沿53方向發(fā)生聚合反應(yīng)。方向發(fā)生聚合反應(yīng)。3、DNA聚合酶聚合酶4 4、脫氧核

39、糖核酸、脫氧核糖核酸四種脫氧核苷三磷酸即四種脫氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和和dGTP，為，為PCR反應(yīng)中反應(yīng)中DNA合成原料。合成原料。在新的一個(gè)反應(yīng)體系中，這四種脫氧核糖核酸的起始濃度應(yīng)該都相等，如果其中一種在新的一個(gè)反應(yīng)體系中，這四種脫氧核糖核酸的起始濃度應(yīng)該都相等，如果其中一種的濃度明顯不同于其他的就會(huì)誘發(fā)錯(cuò)配，并降低新鏈合成速度。的濃度明顯不同于其他的就會(huì)誘發(fā)錯(cuò)配，并降低新鏈合成速度。緩沖液提供緩沖液提供PCR反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有KCl、Tris-Cl和和MgCl2。其中其中Mg2的濃度最重要，它能影響

40、的濃度最重要，它能影響DNA聚合酶的活性，以及模板與聚合酶的活性，以及模板與PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的解鏈溫度。解鏈溫度。5 5、緩沖液、緩沖液1.變性：是指模板的熱變性，雙螺旋模版變性：是指模板的熱變性，雙螺旋模版DNA成為單鏈的成為單鏈的DNA分子；在應(yīng)用分子；在應(yīng)用Taq DNA聚聚合酶進(jìn)行合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，變性往往在反應(yīng)時(shí)，變性往往在9495條件下進(jìn)行。這也是條件下進(jìn)行。這也是Taq DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行30個(gè)左右的個(gè)左右的PCR循環(huán)而活力不致受到過多損失時(shí)所能耐受的最適溫度。循環(huán)而活力不致受到過多損失時(shí)所能耐受的最適溫度。2.退火：是指引物和模板在局部形成互補(bǔ)的雜交鏈的過程。退火溫

41、度比兩條寡核苷酸引物退火：是指引物和模板在局部形成互補(bǔ)的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物的熔解溫度低的熔解溫度低510，PCR實(shí)驗(yàn)要對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)要對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。二、二、PCR基本步驟基本步驟3.延伸：在鎂離子存在條件下，延伸：在鎂離子存在條件下，DNA聚合酶按堿基互補(bǔ)原則，催化四種脫氧核糖核酸加聚合酶按堿基互補(bǔ)原則，催化四種脫氧核糖核酸加在引物的在引物的3端，使引物沿端，使引物沿53方向生成與模版方向生成與模版DNA互補(bǔ)的新互補(bǔ)的新DNA鏈。鏈。雙鏈模版雙鏈模版DNADNA變性變性退火退火5 53 35 53 35 55 53 33 35 55 53 33 35 55

42、 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物延伸延伸3 35 55 53 33 35 55 53 3多次循環(huán)多次循環(huán)（2 2n n 拷貝）拷貝）下面為一個(gè)典型的下面為一個(gè)典型的PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置：循環(huán)參數(shù)設(shè)置：備注：備注：* 比兩條引物的比兩條引物的Tm值值低低510。94 5 min 94 30 s X * 30 s 72 1 kb/min 72 5 min25-3525-35個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)三、影響三、影響PCR因素因素 雖然雖然PCRPCR操作很方便，但影響因素也很多，從而影響操作很方便，但影響因素也很多，從而影響PCRPCR的特異性和高效性。的特異性和高效性。1.1. 引物引物2.2.

43、 變性溫度和時(shí)間變性溫度和時(shí)間3.3. 退火溫度和時(shí)間退火溫度和時(shí)間4.4. 延伸溫度和時(shí)間延伸溫度和時(shí)間5.5. 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)引物決定了引物決定了PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和特異性。產(chǎn)物的長(zhǎng)度和特異性。引物的設(shè)計(jì)要求請(qǐng)看本實(shí)驗(yàn)講義引物的設(shè)計(jì)要求請(qǐng)看本實(shí)驗(yàn)講義“引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)”部分。部分。1 1、引物、引物在在PCR反應(yīng)剛開始時(shí)，為保證作為模板的雙鏈反應(yīng)剛開始時(shí)，為保證作為模板的雙鏈DNA完全變性成單鏈完全變性成單鏈DNA，一般設(shè)為，一般設(shè)為95、5 min；在隨后的循環(huán)中，可設(shè)為；在隨后的循環(huán)中，可設(shè)為95、30s。有些模板有些模板DNA的的G+C含量較高，變性溫度就越高。太高的變性溫度和太長(zhǎng)的

44、變性時(shí)間含量較高，變性溫度就越高。太高的變性溫度和太長(zhǎng)的變性時(shí)間會(huì)影響會(huì)影響DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 2 2、變性溫度和時(shí)間、變性溫度和時(shí)間退火溫度與引物的退火溫度與引物的Tm值相關(guān)，一般比值相關(guān)，一般比Tm值低值低510。退火溫度設(shè)置過低，會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；退火溫度過高，則影響引物與模板的結(jié)合退火溫度設(shè)置過低，會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；退火溫度過高，則影響引物與模板的結(jié)合而降低而降低PCR效率。效率。在退火時(shí)間里，引物與模板相結(jié)合，時(shí)間太短會(huì)使引物與模板未完全結(jié)合而導(dǎo)致無法在退火時(shí)間里，引物與模板相結(jié)合，時(shí)間太短會(huì)使引物與模板未完全結(jié)合而導(dǎo)致無法延伸；時(shí)間過長(zhǎng)容易產(chǎn)生引物在模板上的非特

45、異性結(jié)合或形成引物二聚體。退火時(shí)間延伸；時(shí)間過長(zhǎng)容易產(chǎn)生引物在模板上的非特異性結(jié)合或形成引物二聚體。退火時(shí)間設(shè)置為設(shè)置為30s基本上就足夠了。基本上就足夠了。3 3、退火溫度和時(shí)間、退火溫度和時(shí)間所用所用DNA聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度，如聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度，如Taq聚合酶的最佳溫度為聚合酶的最佳溫度為7080度，所以延伸溫度設(shè)為度，所以延伸溫度設(shè)為72即可。即可。在實(shí)踐中在實(shí)踐中Taq DNA聚合酶的延伸效率約為聚合酶的延伸效率約為500 bp/30 s，若待擴(kuò)增的片段較長(zhǎng)，可適，若待擴(kuò)增的片段較長(zhǎng)，可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，但時(shí)間過長(zhǎng)又會(huì)致非特異性擴(kuò)增。當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，但時(shí)間過長(zhǎng)

46、又會(huì)致非特異性擴(kuò)增。4 4、延伸溫度和時(shí)間、延伸溫度和時(shí)間在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等因素，在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等因素，PCR產(chǎn)產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加，此時(shí)稱為平臺(tái)效應(yīng)。物不再呈指數(shù)增加，此時(shí)稱為平臺(tái)效應(yīng)。循環(huán)次數(shù)設(shè)為循環(huán)次數(shù)設(shè)為2530次，即可滿足一般的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。過多的循環(huán)次數(shù)會(huì)導(dǎo)次，即可滿足一般的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。過多的循環(huán)次數(shù)會(huì)導(dǎo)致堿基錯(cuò)配增加和非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。致堿基錯(cuò)配增加和非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。5 5、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)次數(shù)1.DNA模板：以模板：以pPIC9-NGAL為模板，來擴(kuò)增不包含信號(hào)肽序列的為模板，

47、來擴(kuò)增不包含信號(hào)肽序列的NGAL編碼區(qū)編碼區(qū)2.引物：引物： PCR上游引物（上游引物（P1）：）：5-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA -3 PCR下游引物（下游引物（P2）：）：5-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC -3 底下有橫線的堿基為酶切位點(diǎn)：底下有橫線的堿基為酶切位點(diǎn)：XholI (P1)，EcoRI(P2)3.2Taq PCR Master Mix （廣州佰路生物科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品成份為：（廣州佰路生物科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品成份為： 0.1 U Taq DNA Polymerase/ml 500 mM dNTP each

48、50 mM Tris-HCl (pH8.7) 20 mM KCl 4 mM MgCl2 4.無菌水無菌水5.100bp plus ladder DNA marker本實(shí)驗(yàn)所用試劑本實(shí)驗(yàn)所用試劑實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作95 2min95 2min94 30s94 30s60 30s 60 30s 72 30s72 30s72 5min72 5min30個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)1.按以下次序?qū)⒏鞒煞旨影匆韵麓涡驅(qū)⒏鞒煞旨覲CR管中。管中。 2Taq PCR MasterMix 5 l P1 (12.5 M ) 1 l P2 (12.5 M) 1 l 無菌水無菌水 2 l pPIC9-NGAL 1 l 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系：10 l混勻，稍加離心并標(biāo)記?；靹?，稍加離心并標(biāo)記。2.PCR反應(yīng)于反應(yīng)于ABI 2720 Thermer cycler進(jìn)行，進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)條件： 凝膠準(zhǔn)備凝膠準(zhǔn)備 稱稱1g瓊脂糖置三角瓶中，加瓊脂糖置三角瓶中，加100ml 1TAE； 微波爐加熱大約微波爐加熱大約2分鐘，熔化瓊脂糖；分鐘，熔化瓊脂糖； 熔化的瓊脂糖自然冷卻到熔