ELISA一些體會

1、酶聯(lián)免疫吸附試驗的一些體會檢驗科 常會忠 免疫吸附劑 ELISA 的步驟和注意事項 ELISA的相關(guān)知識免疫吸附劑免疫吸附劑 固相載體固相載體-聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。性。 聚氯乙烯聚氯乙烯-聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。烯高，但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板應(yīng)該是板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔吸附性能好，空白值低，孔底透明度高底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板

2、各，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近?？字g性能相近。 將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被被(coating(coating) )。 包被方式包被方式包被用抗原 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的。與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的。 脂類物質(zhì)脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入（例如乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，開蓋置板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相

3、表面。然干固在固相表面。包被用抗體 IgGIgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在FcFc段上，抗體段上，抗體結(jié)合點暴露于外。結(jié)合點暴露于外。包被的條件包被的條件 pH9.6 pH9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液 pH7.2pH7.2的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液 pH7-8pH7-8的的TrisTris-HCL-HCL緩沖液。緩沖液。 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置過夜，冰箱中放置過夜，3737中保溫中保溫2 2小時。小時。封閉封閉 封閉封閉(blocking)(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)

4、溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISAELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 常用封閉劑：常用封閉劑：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血的小牛血清或清或1%1%明膠。明膠。 所有的所有的ELISAELISA固相均需封閉。固相均需封閉。加樣 溫育 洗板 ELISA加樣量小（5-100l），其準(zhǔn)確性直接影響實驗結(jié)果，一般應(yīng)在10%以內(nèi)。 要先加稀釋液后加樣本 溫箱實測溫度是否準(zhǔn)確，允許有1的誤差； 洗板機 每

5、個廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ，人工扣板時，墊紙不濕 。顯色 加入順序 HRPHRP的底物的底物 DH2+ H2O2 DH2+ H2O2 D D+ 2H2O+ 2H2O 上式中，上式中， DH2DH2為供氫體，為供氫體， H2O2H2O2為受氫體為受氫體。 10-15分鐘，根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度值達(dá)0.2左右使的時間而恒定反應(yīng)時間. 結(jié)果判讀 定性試驗 國內(nèi)外為便于統(tǒng)一計算，一律按S/C.O方式報告 。 陰陽性對照測定值 的有效性。 精密度：ELISA試劑一般指其批內(nèi)CV，其值應(yīng)小于15%。結(jié)果判讀 Cut Off的計算公式以試劑盒說明書的為準(zhǔn)常見的有： A） C.O

6、=2.1N（當(dāng)N不足0.05時按0.05計）， B） C.O=0.5N，從抑止率公式換算而來 C） C.O=N+C（C為常數(shù)），用于間接法。 D) C.O=CP+N（C為常數(shù)），用于間接法。此公式最客觀，結(jié)果判讀 灰區(qū)的設(shè)置有： 1）C.O（1CV）， CV為該試劑的批內(nèi)CV (一般在15-20%間）； 2）C.O2s，s為實驗室做室內(nèi)質(zhì)控的SD。 3）0.7C.O樣本OD1.4C.O參考標(biāo)準(zhǔn)品參考標(biāo)準(zhǔn)品 英國國立生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)及控制品研究院（NIBSC）：免疫血清學(xué) IU/ML 德國鮑爾-艾立希研究院（PEI）：病毒學(xué)、免疫血清學(xué)等，傳染病標(biāo)志物最全PEI/ML。 法國國家中心實驗室（LNS）、法國輸血協(xié)會（SFTS）：病毒性肝炎、艾滋等血清盤。NG/ML參考標(biāo)準(zhǔn)品參考標(biāo)準(zhǔn)品 荷蘭輸血中