抗生素的分離與純化

1、 衡水學(xué)院結(jié)課論文抗生素的分離和純化論文作者：邢五星系別：生命科學(xué)系專業(yè)：生物科學(xué)學(xué)號(hào)201440700035年級(jí)：2014級(jí)抗生素的分離和純化抗生素是由生物包括微生物、植物、動(dòng)物在其生命活動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的一類天然有機(jī)化合物,具有能在極小的濃度下有選擇地抑制、促進(jìn)或殺滅其他微生物和生物細(xì)胞的作用。由于其存在于成分復(fù)雜的發(fā)酵液中,因此采用合理有效的分離純化技術(shù)路線是新型抗生素研究成功與否的關(guān)鍵。1.發(fā)酵液的預(yù)處理微生物發(fā)酵液的預(yù)處理,其目的不僅在于分離菌體和其他懸浮顆粒,還著眼于除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì),以利于提取和精制后續(xù)各工作的順利進(jìn)行。對(duì)于胞外產(chǎn)物,經(jīng)預(yù)處理應(yīng)盡可能使目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到

2、液相,然后經(jīng)固液分離除去固相;對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物,則首先收集菌體,經(jīng)細(xì)胞破碎后,目的產(chǎn)物進(jìn)入液相,然后再將細(xì)胞碎片分離。改變發(fā)酵液過(guò)濾特性的方法有:調(diào)酸(等電點(diǎn))、熱處理、電解質(zhì)處理、添加凝聚絮凝劑等。另外通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的酸堿度或加入合適的溶劑也可以除去部分相應(yīng)的雜質(zhì),如調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值過(guò)酸性或過(guò)堿性可以使大部分蛋白類雜質(zhì)沉淀除去,用高濃度甲醇、乙醇或丙酮溶液浸提發(fā)酵液,既可以沉淀出大部分不溶性多糖和蛋白雜質(zhì),又可以降低發(fā)酵液粘稠度,有利于過(guò)濾、色譜分離等進(jìn)一步處理。廖文彬、鮑時(shí)翔等報(bào)道1,采用有機(jī)溶劑乙醇B丙酮(1B1)的混合液可以很好的除去紅樹林放線菌發(fā)酵液中的的蛋白等雜質(zhì),有利于活性物質(zhì)的分離

3、純化。解翠華、夏煥章等報(bào)道2用草酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至3,然后離心,可以使發(fā)酵液和菌絲體很好的分離,分別用乙酸乙酯對(duì)上清液進(jìn)行萃取;對(duì)菌絲體進(jìn)行抽提;都得到了具有活性的粗提物。2.抗生素常用的分離純化方法抗生素常用的分離純化方法主要有溶媒萃取法、吸附法、離子交換法、沉淀和結(jié)晶、色譜分離等。在提取時(shí),可根據(jù)抗生素分離的難易,單獨(dú)或同時(shí)使用上述方法。2.11 溶媒萃取法 溶媒萃取法是利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同,使溶質(zhì)選擇性的從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中而得到純化或濃縮的方法,它是生物工業(yè)中一種重要的分離提取方法。作為一種傳統(tǒng)的分離技術(shù),溶媒萃取法目前仍然在廣泛應(yīng)用于在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中

4、,如螺旋霉素、林可霉素、青霉素等都采用溶媒萃取法提取。盡管選擇性更高、分離度更好的現(xiàn)代分離技術(shù)和方法不斷出現(xiàn),但還是不能完全替代溶媒萃取法。另外,近年來(lái),溶媒萃取法在傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取技術(shù)的基礎(chǔ)上,萃取機(jī)制和方法也在不斷發(fā)展完善,相繼出現(xiàn)了各種新的現(xiàn)代萃取技術(shù),其中的超臨界CO2萃取技術(shù)3以其在天然產(chǎn)物分離方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)備受青睞, 20世紀(jì)80年代以來(lái),已經(jīng)在許多領(lǐng)域中實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化。萃取和反萃取同時(shí)進(jìn)行的液膜萃取、反膠團(tuán)萃取、雙水相萃取等技術(shù)相繼取得了重大進(jìn)展4-6。這些都使得萃取技術(shù)更加全面,適用于各種生物產(chǎn)品的分離純化。2.12 吸附法 吸附法是利用吸附劑與抗生素之間的分子引力而將抗生素吸

5、附在吸附劑上。常用的吸附劑有活性炭、氧化鋁、大孔吸附樹脂等。大孔吸附樹脂是當(dāng)前微生物天然產(chǎn)物分離技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展最迅速、最活躍的分支之一,目前它已逐漸取代活性炭和氧化鋁等吸附劑,在抗生素工業(yè)中顯示出越來(lái)越重要的地位。大孔吸附樹脂適合于吸附各種抗生素,它不僅可吸附脂溶性化合物,而且可以吸附水溶性化合物。有文獻(xiàn)報(bào)道,近年來(lái),國(guó)內(nèi)應(yīng)用大孔吸附樹脂進(jìn)行分離、提取、濃縮、純化的抗生素涵蓋了目前已知抗生素的所有類型7。姬生寶等8藤黃灰鏈霉菌發(fā)酵液中的抗真菌活性成分SL103采用X-5型吸附樹脂對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化,對(duì)吸附飽和的X-5樹脂柱用去離子水沖洗,然后用50%的甲醇洗去雜質(zhì)和色素,再用50%的乙醇4m

6、L/min的流速下進(jìn)行洗脫,合并活性高的洗脫液,濃縮后靜置48h得到SL103的粗結(jié)晶。通過(guò)對(duì)結(jié)晶進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,此結(jié)晶純度可達(dá)95%以上;經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析,得知其為一種小分子量的抗生素,分子量為66215。2.13 離子交換法 離子交換法是9利用離子交換樹脂與目的物質(zhì)之間的化學(xué)親合力,有選擇地將目的物質(zhì)吸附上去,再用適當(dāng)?shù)南疵搫┫疵撓聛?lái)。如果目的物質(zhì)為堿性,則選擇酸性樹脂;如果為酸性,則要選擇堿性樹脂。由于抗生素是一類天然抗菌,抗病毒藥物,其分子中往往含有多種化學(xué)基團(tuán),在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下容易發(fā)生化學(xué)變化,導(dǎo)致藥理活性喪失,提取分離抗生素所用的離子交換樹脂主要為弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂和弱堿性陰

7、離子交換樹脂。如金霉素,丁胺卡那霉素,萬(wàn)古霉素,先鋒霉素用弱酸性樹脂;慶大霉素,新生霉素用弱減性樹脂;春雷霉素,肉瘤霉素,夾竹桃霉素用強(qiáng)酸性樹脂;先鋒霉素,土霉素用強(qiáng)堿性樹脂。由于抗生素分子體積較大,一般選擇大孔網(wǎng)狀樹脂。2.14 沉淀和結(jié)晶2.141 沉淀法 沉淀法廣泛用于蛋白質(zhì)等大分子的提取中。它主要起濃縮作用,純化的效果較差,通常作為初步分離的一種方法。沉淀法分為5種類型: 1)鹽析:加入高濃度的鹽使蛋白質(zhì)沉淀,其機(jī)理為蛋白質(zhì)分子的水化層被除去,而相互吸引。2)加入有機(jī)溶劑:其機(jī)理為加入有機(jī)溶劑會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低,從而使水分子的溶解能力降低,在蛋白質(zhì)分子周圍,不易形成水化層。缺點(diǎn)是有

8、機(jī)溶劑常會(huì)引起蛋白質(zhì)失活。3)調(diào)pH至等電點(diǎn):此法沉淀能力不強(qiáng),常加入有機(jī)溶劑,使沉淀完全。4)加入非離子型聚合物:如PEG等。5)加入聚電解質(zhì):如聚丙烯酸,其機(jī)理與鹽析作用相似。張鵬,洪葵等報(bào)道10,通過(guò)在拮抗菌株Bacillus cereus041381發(fā)酵液上清液中加入硫酸銨,以硫酸銨飽和梯度55% -60% -65% -70%進(jìn)行連續(xù)分級(jí)操作,可以將抗真菌活性蛋白有效的提取出來(lái)。2.142 結(jié)晶 抗生素工業(yè)中常用的結(jié)晶方法有以下4種11。(1)蒸發(fā)結(jié)晶。使溶液在加壓、常壓或減壓下加熱蒸發(fā)除去一部分溶劑,以達(dá)到或維持溶液過(guò)飽和度,使晶體長(zhǎng)大。(2)化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶。加入反應(yīng)劑或調(diào)節(jié)pH產(chǎn)生新

9、物質(zhì),當(dāng)該新物質(zhì)的濃度超過(guò)它的溶解度時(shí)就有結(jié)晶析出。(3)過(guò)飽和冷卻結(jié)晶。使溶液冷卻降溫以維持一定過(guò)飽和度,不用除去溶劑,優(yōu)點(diǎn)是能耗小設(shè)各構(gòu)造及操作較簡(jiǎn)單,但生產(chǎn)速率和產(chǎn)率相應(yīng)較低,難以自動(dòng)控制。(4)鹽(溶)析結(jié)晶。加一種物質(zhì)于溶液中,以便溶質(zhì)的溶解度降低形成過(guò)飽和溶液而結(jié)晶。2.15 色譜法色譜法是基于混合物各組分在兩相(固定相和流動(dòng)相)之間的不均勻分配進(jìn)行分離的一種方法。其基本原理是由于混合物中的各個(gè)單一組分對(duì)兩相不同的親和力和向兩相不均勻擴(kuò)散的可能性而導(dǎo)致在固定相和移動(dòng)相之間的不均勻分配,從而得到分離。色譜法有不同的分類根據(jù),下面主要介紹薄層色譜、硅膠吸附柱色譜、高效液相色譜等常見(jiàn)色譜

10、方法。2.151薄層色譜(Thin LayerChromatography) 薄層色譜常用TLC表示,又稱薄層層析,屬于固-液吸附色譜。是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種微量、快速而簡(jiǎn)單的色譜法,它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于小量樣品(幾到幾十Lg,甚至0101Lg)的分離;另一方面若在制作薄層板時(shí),把吸附層加厚,將樣品點(diǎn)成一條線,則可分離多達(dá)500mg的樣品。因此又可用來(lái)精制樣品。田黎、顧振芳等12采用硅膠G薄板(20cm15cm01025cm)分離海洋細(xì)菌B-9987菌株產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì),展開劑用甲苯B乙酸乙酯B90%甲酸(V/V/V)=6B3B1,得到兩種活性組分。李德順,蘇中銳等13真

11、菌活性物質(zhì),采用硅膠G薄板以正丁醇B乙酸B水(V/V/V)=3B1B1為展層劑進(jìn)行操作,通過(guò)生物顯影技術(shù),確定分離的為單一組分的抗生素。21512 硅膠吸附柱色譜 硅膠吸附柱色譜的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離,一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附,極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附,整個(gè)層析過(guò)程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過(guò)程。由于硅膠既可用于非極性化合物,又可用于極性化合物的分離純化工作,因此,在抗生素的分離純化中硅膠柱色譜是最常用的方法之一。陳文君、吳劍波等14柱層析法大量純化農(nóng)用抗生素11371A復(fù)合組分,洗脫溶劑采用甲醇:二氯甲烷(6B1)和乙醇B氫氧化銨B水(8B1B

12、1),分段收集洗脫液,濃縮后制品最高純度可達(dá)到85%左右。MotooKoitabashi等15吸附柱,以正己烷-乙烷為流動(dòng)相,體積比100B1至30B1梯度洗脫,成功的從真菌菌株Kyu-W63發(fā)酵液濃縮物中分離出兩種脂溶性抗真菌組分PTF和PDF。硅膠柱色譜因其一次性獲得樣品的純度不高,雖然通過(guò)多次重復(fù)使用也可以得到更高純度的樣品,但在實(shí)際研究中更多的是作為高效液相色譜法等精制方法的前提步驟。2.153高效液相色譜(HPLC) 20世紀(jì)60年代以后,由于柱色譜填料的改進(jìn)及流動(dòng)相輸送和被分離物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步,高效液相色譜技術(shù)迅速發(fā)展起來(lái)。它是建立在經(jīng)典液體柱色譜的基礎(chǔ)上,引入氣相色譜分析的理論

13、和技術(shù),并加以改進(jìn)而建立起來(lái)的,HPLC已成為應(yīng)用最為廣泛的高精度色譜技術(shù),它對(duì)樣品的適用性廣,不受樣品的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性限制,有分離效果好、靈敏度高、分析速度快和操作方便等優(yōu)點(diǎn),具適宜于各種類型抗生素分離分析中最常用的是反相高效液相色譜。在反相高效液相色譜中,流動(dòng)相的極性大于固定相的極性,通常以高極性的水與相對(duì)低極性的甲醇、乙腈等水溶性高的有機(jī)溶劑搭配組成,通過(guò)調(diào)節(jié)水與有機(jī)溶劑的比例及流動(dòng)相的流速來(lái)達(dá)到最佳分離效果。反相色譜法適于分離非極性,極性或離子型化合物,大部分的分析任務(wù)皆由反相色譜法完成。孫強(qiáng)16用反相色譜柱SinochromODS-BP-C1(8300mm416mm i1d, 5L

14、m)對(duì)放線菌菌株MY02發(fā)酵液中的抗真菌活性物質(zhì)SN06進(jìn)一步純化,以甲醇-水系統(tǒng)(80B20, V/V)為流動(dòng)相,流動(dòng)相流速為014mL/min,柱溫30e,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)304nm。81044min和171347min兩個(gè)吸收峰的收集液具有明顯的活性,純度較高,可以滿足光譜分析等進(jìn)一步研究的需要。3.抗生素分離純化實(shí)現(xiàn)手段在實(shí)際的操作中,抗生素的分離純化工作往往是通過(guò)各種分離手段相結(jié)合來(lái)完成的。如匡巖巍,張慶林17從一株土壤放線菌2215的發(fā)酵提取物中分離純化棘霉素。其方法為:發(fā)酵液直接用有機(jī)溶劑裂解,乙酸乙酯提取,提取液濃縮至干,得到粗提物9A,C18徑向加壓柱分離得到11C,條件:乙睛水

15、梯度洗脫,流速710mL/min, UV =240nm。對(duì)11C采用制備HPLC進(jìn)行分離純化得14J,條件:C18反相柱4cm20cm,乙睛B水為52B48, UV =240nm。對(duì)14J進(jìn)行制備薄層,氯仿/甲醇=30B1展開得到16A。經(jīng)高效液相分析,條件:KromasialC18色譜柱,甲醇B水=7B3,UV=240。得到活性單體,經(jīng)面積歸一法檢測(cè)純度達(dá)95%。經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定其為棘霉素。新農(nóng)用抗生素18507的分離純化,1)菌絲體先通過(guò)兩次浸提,第1次用60%的丙酮水溶液;第2次用40%的丙酮水溶液。2)然后用大孔吸附樹脂CDA-45吸附,采用先轉(zhuǎn)型再脫附的方法,即用30%的醋酸水溶液轉(zhuǎn)型,再

16、用水按012BV/min流速?zèng)_洗吸附柱至中性,再用丙酮以0103BV/min的流速洗脫,回收率98%。然后經(jīng)過(guò)多次硅膠柱層析對(duì)有效成分分離純化,最后得到純品。通過(guò)各種波譜鑒定解析出了2507有效組分的分子結(jié)構(gòu),它屬于一類較為少見(jiàn)的多肽抗生素,分子量1156,分子式為C53H67N13O13S2。AngelaM1Hoffman等19株莖點(diǎn)霉屬的植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物中分離純化出三種具有抑菌活性物質(zhì),其方法為:發(fā)酵液在真空條件下過(guò)濾除去菌絲體,濾液用等體積的氯仿或二氯甲烷萃取3次,萃取液減壓濃縮,無(wú)水硫酸納干燥,然后用少量的二氯甲烷溶解得粗樣品。粗樣上硅膠柱,洗脫液己烷、己烷B乙酸乙酯(99B1)

17、、乙酸乙酯(99B2)三個(gè)洗脫梯度,經(jīng)TCL跟蹤檢測(cè)分別分離出三種活性物質(zhì)?；钚?經(jīng)己烷:乙酸乙酯(1B10)重結(jié)晶得到黃色固體,經(jīng)HPLC檢測(cè)為松蘿酸;活性2經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶得到淺紅色晶體, TLC比移值0154-0157,香草醛-硫酸噴后顯藍(lán)灰色。經(jīng)制備HPLC,質(zhì)譜分析,確定分子量為33310683,分子式為C16H13NO7。活性3經(jīng)乙酸乙酯:甲醇(1B9)重結(jié)晶得到淺褐色晶體, TLC比移值0190-0188,香草醛-硫酸噴后顯草綠色。經(jīng)制備HPLC,紫外光譜,紅外光譜,拉曼光譜,質(zhì)譜分析,確定分子量理論值為39011315,實(shí)驗(yàn)值為39011324,分子式: C20H22O8,為一

18、種新型的天然抗菌物質(zhì)。4.結(jié)語(yǔ)抗生素的分離純化過(guò)程是一項(xiàng)非常繁瑣艱巨的任務(wù),尤其對(duì)未知成分的新型抗生素分析,需要投入大量的人力物力,不僅要求研究人員熟練掌握各種分離純化技術(shù),而且還要具有足夠的耐心。在總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)各種分離純化技術(shù)敢于嘗試,大膽的對(duì)分離純化技術(shù)進(jìn)行創(chuàng)新,從而摸索出一條合理有效的分離純化路線。筆者認(rèn)為,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展,越來(lái)越多的新型技術(shù)會(huì)應(yīng)用于抗生素的分離純化中,將會(huì)有更多的安全、無(wú)毒、高效的抗生素類藥物服務(wù)于人類。參考文獻(xiàn)1廖文彬,鮑時(shí)翔 紅樹林放線菌產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的分離純化研究 藥物生物技術(shù), 2004, 11(6): 376-3802解翠華,阮麗君,夏煥章,等1植物內(nèi)生菌HCCB00167產(chǎn)物的發(fā)酵、分離和結(jié)構(gòu)鑒定沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 24(4): 245-2483李州,寥史書,雷文1制藥工業(yè)中溶劑萃取的機(jī)制和應(yīng)用發(fā)展方向 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 1996, 27: 89-904毛忠貴 超臨界流體萃取技術(shù)在生物、食品工