基因診斷與基因治療

1、 基因診斷與基因治療 (Gene Diagnosis and Therapy) 1主要內(nèi)容2 基因診斷（基因診斷（4-184-18） 基因治療（基因治療（4-254-25） 2013年，H7N9禽流感來襲，快速而準(zhǔn)確地對疑似患者作出診斷，能有效的增大患者的生機。 通過什么方法作出快速診斷？如何來進行治療？3 基因診斷能夠快速檢測出疑似患者的送檢樣品中是否含有H7N9病毒的特定基因。4548小時內(nèi)使用最有效 利用分子生物學(xué)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達水平是否異常，從而對疾病作出診斷,為治療提供依據(jù)。 特點： 針對性強，特異性高 實用性強，診斷范圍廣 預(yù)見性，適應(yīng)性6基因診斷基因診斷常用技術(shù)方法

2、（一）核酸分子雜交技術(shù)（二）聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)（三）基因測序（四）基因芯片7核酸分子雜交技術(shù)原理8 Southern 印跡雜交法（Southern blotting ） Northern 印跡雜交法（Northern blotting ） 斑點雜交或狹縫雜交法（Spot/ Slot blot hybridization） 菌落雜交（colony hybridization） 夾心雜交法（sandwich hybridization） 原位雜交（ hybridization in situ）常用固相核酸雜交方法910 (1) Southern 印跡雜交法 限制性內(nèi)切酶酶切 檢測雜交信號檢測

3、雜交信號 提取提取DNADNA Southern 法可用于檢測特異的DNA序列片段,進行基因定位、分子量測定等。（2）Northern 印跡雜交法 （其基本過程類似于上述Southern法） 提取RNA樣本RNA變性瓊脂糖凝膠電泳分離轉(zhuǎn)移至膜探針（標(biāo)記DNA或RNA）與之雜交顯影或顯色檢測信號。 Northern法可用于檢測組織細胞中總RNA或mRNA 11（6）原位雜交 將標(biāo)記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，進而 檢測特異的DNA或RNA序列。 細胞原位雜交、組織切片原位雜交 DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA優(yōu)點： 不需提取核酸，故可完整保持組織或細胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確

4、地反映組織細胞的功能狀態(tài)。12（二）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction PCR）Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize 13PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，即Y = 2n n為循環(huán)數(shù)14（三）基因測序技術(shù)他們給DNA 的測序帶來了一場革命，分享了1980年的諾貝爾化學(xué)獎。后來Sanger法發(fā)展為自動化測序法，并為人類基因組測序做出了卓越貢獻。Fred Sanger

5、 發(fā)明的末端合成終止法 (sanger法)Walter Gilbert發(fā)明的化學(xué)裂解法 Maxam-Gillbert法15（四）基因芯片技術(shù)n快速、高通量、平行化、自動化16基因診斷方法經(jīng)典基因診斷.限制性內(nèi)切酶法.RFLP分析法.寡核苷酸分析法優(yōu)點缺點特異基因診斷未知基因診斷直接，過程簡單過程繁雜準(zhǔn)確性低，過程繁條件嚴(yán)格基因診斷進展.PCR方法.PCR-序列分析法.DNA芯片技術(shù)簡單、經(jīng)濟、敏感操作直接、準(zhǔn)確集成度高、快速、并行假陽性高價格高尚無成熟產(chǎn)品問世17 四. 基因診斷的臨床應(yīng)用18遺傳疾病腫瘤感染性疾病，傳染性流行病判斷個體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定鐮狀紅

6、細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析Mst酶切位點(CCTNAGG)5 3 正常基因5 3 突變基因突變基因1.15kb1.35kb0.2kb正常珠蛋白基因： 5CCTGAGG3鐮刀型貧血： 5CCTGTGG30.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著 患者19 實時熒光定量實時熒光定量PCR技術(shù)技術(shù) (Real time Quantitative PCR)實時監(jiān)測 熒光 起始模板20Real Time vs. Traditional PCRPCR21PCR分四個階段22TheoreticalReal LifeLog Target DNACt valueBaselineThreshold

7、2324理想的PCR反應(yīng)XnX0 2n*Xn：第n次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量n：擴增循環(huán)數(shù)熒光定量PCR原理Ct值定量的數(shù)學(xué)原理非理想的PCR反應(yīng)XnX0 （1En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量n：擴增循環(huán)數(shù)En：擴增效率熒光定量PCR原理Ct值定量的數(shù)學(xué)原理在擴增產(chǎn)物達到熒光閾值時XCtX0 （1En）CtM （1）*XCt ：熒光擴增信號達到閾值時擴增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個常數(shù)，：熒光擴增信號達到閾值時擴增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個常數(shù)，定為定為M方程式（1）兩邊同取對數(shù)得：Log2MLog2X0 *（1En）Ct （2）整理方程

8、式（2）：Log2X0 Log 2M Ct Log2（1En）熒光定量PCR原理Ct值定量的數(shù)學(xué)原理28SYBR Green I TaqMan Probe Molecular Beacon TaqMan30SYBR Green I GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA3132Dissociation curveTaqMan33Probes and Primers (Primer Express 3.0 software)34Primer Length: 15-30bpPCR Product: 100-200bpG+C%: 4060Tm of primers: 55-60 Tm of probes: 65 (10 )No G at 5探針中GC含量的差異對定量PCR反應(yīng)效率的影響36Methods of Quantification3738Absolute Quant